Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Åpner nye muligheter for Imaging Fysiologisk viktige parametere Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

En ny elektronparamagnetisk resonans (EPR) -metoden, hurtig scan EPR (RS-EPR), er demonstrert for 2D spektral romlig avbildning som er overlegne i forhold til tradisjonelle kontinuerlig bølge (CW) teknikk og åpner nye arenaer for in vivo avbildning. Resultatene er demonstrert ved 250 MHz, men teknikken er anvendelig ved en hvilken som helst frekvens.

Abstract

Vi viser en overlegen metode for 2D spektral-romlig avbildning av stabile radikaler reportermolekyler ved 250 MHz ved anvendelse av hurtig-skanning elektron-paramagnetisk resonans (RS-EPR), som kan gi kvantitativ informasjon under in vivo-betingelser på oksygenkonsentrasjon, pH, redoks- status og konsentrasjonen av signalmolekyler (dvs. OH •, NO •). RS-EPR-teknikken har en høyere følsomhet og forbedret romlig oppløsning (1 mm), og kortere innsamlingstiden i forhold til den standard kontinuerlig bølge (CW) teknikk. En rekke fantom konfigurasjoner har blitt testet, med romlig oppløsning varierende fra 1 til 6 mm, og spektral bredde av reportermolekyler som strekker seg fra 16 jjT (160 mg) i 5 mT (50 G). En cross-løkke bimodal resonator kobler ut eksitasjon og deteksjon, redusere støy, mens den raske skanning effekt gir mer kraft til å være innspill til spinnsystemet før metning, øke EPR signal. Dettefører til en vesentlig høyere signal-til-støy-forhold enn i konvensjonelle CW EPR-eksperimenter.

Introduction

I forhold til andre medisinsk bildediagnostikk, elektron paramagnetisk resonans (EPRI) er unikt i stand til å kvantitativt bilde fysiologiske egenskaper, inkludert pH 1-3, Postboks 4 til 7 februar, temperatur 8, perfusjon og levedyktighet av vev 9, microviscosity og enkel diffusjon av små molekyler 10 og oksidativt stress 11. Beregning av den enkle disulfid spalting av glutation (GSH) i vev og celler 12,13 kan rapportere om redox status. For in vivo avbildning, blir EPR i frekvensområdet mellom 250 MHz og 1 GHz valgt fordi disse frekvensene tilveiebringe tilstrekkelig dybde av vev penetrasjon (opp til flere cm) for å generere bilder av små dyr i hvilke intensiteter ikke blir svekket av dielektriske tapseffekter. Høyere frekvenser, for eksempel 9,5 GHz 14 (X-båndet) og 17 GHz (K u-band) 15,16 kan brukes til avbildning av hud og hår eller enkeltcellerHhv. Suksessen til EPRI ved alle frekvenser avhenger av paramagnetiske spin sonder som er spesifikke for vev, slik at deres plassering og skjebne kan bli fotografert.

Dersom miljøet i et elektronspinn probe er romlig heterogen, er EPR-spekteret summen av bidrag fra alle steder. Spektral-romlig bildebehandling deler prøvens volum inn i en rekke små romlige segmenter og beregner EPR-spekteret for hvert av disse segmentene 17. Dette tillater kartlegging av det lokale miljøet ved å måle den romlige variasjonen i EPR-spekteret. Magnetfeltgradienter brukes til å kode romlig informasjon i EPJ-spektra, som er kalt anslag. Den spektrale-romlig bilde er rekonstruert fra disse anslagene 18,19.

I RS-EPR det magnetiske feltet blir skannet gjennom resonans i en tid som er kort i forhold til elektronspinn-relaksasjonstider (figur 2) 20,21. D econvolution av den hurtige-scan signal gir absorpsjonsspektrum, som er ekvivalent med den første integralet av den konvensjonelle første-deriverte CW spektrum. Den hurtige-scan-signalet blir detektert i kvadratur, slik at både absorpsjon og spredning komponenter av spinnsystemresponsen er målt. Dette er i hovedsak å samle dobbelt så mye data per tidsenhet. Metning av signalet i en hurtig skanning eksperiment skjer ved høyere krefter enn for CW, slik at høyere krefter kan brukes uten bekymring for metning. 20,22 Mange flere gjennomsnitt kan gjøres per tidsenhet sammenlignet med CW. Høyere kraft, direkte kvadratur-deteksjon og flere gjennomsnitt per tidsenhet kombineres for å gi hurtig skanning et bedre signal-til-støy-forhold (SNR), særlig ved høye gradient fremspring som definerer romlig atskillelse, som fører til høyere kvalitet. For å oppnå omtrent samme SNR for et bilde av et fantom kreves omtrent 10 ganger så lenge for CW som for rask skanning 23.

telt "> Den økte SNR tillater også eksperimenter ved 250 MHz med lav konsentrasjon ring felle addukter dannet ved omsetning av OH med 5-tert-butoksykarbonyl-5-metyl-1-pyrroline- N-oksid (BMPO-OH) som ville bli usynlige for det CW-metoden 24. Dinitroxides forbundet med en disulfid-bindingsmiddel er følsomme for spaltning av glutation, og så kan rapportere om cellulære redoks status. Likevekts finnes, avhengig av konsentrasjonen av glutation tilstede, mellom de di- og mono-radikal former. observere disse endringene krever opptak av hele 5 mT bredt spektrum, og kan oppnås mye raskere med hurtig skanning EPR i forhold til pass det magnetiske felt i en CW eksperiment.

En komplett rask skanning systemet består av fire deler: spektrometer, hovedfeltet magnet, den raske skanning polen driver, og den raske skanning kryss-loop resonator. Spektrometeret og hovedfeltmagneten funksjon den samme som i en CW eksperiment, sette hoved Zeeman-feltetog å samle inn data fra resonatoren. Den raske scan polen driver genererer sinus scan strømmen som går inn i spesialdesignede raske skanderingsspolene på rask skanning kryss-loop resonator. Den raske skanderingsspolene på hurtig skanning kryss-sløyfe-resonator generere et stort homogent magnetfelt, som sveipes ved frekvenser mellom 3 og 15 kHz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oppsett av Rapid Scan Coil Driver på 250 MHz

  1. Beregning av Rapid Scan Eksperimentelle betingelser
    Merk: Den viktigste parameteren i RS-EPJ er scan rate α, som er produktet av frekvensen og skanning bredde (ligning 3). For trange skanne bredder, er raskere skannefrekvenser som brukes, og for bredere sweep bredder, blir tregere skanne priser brukt. Følgende instruksjoner går gjennom det siste tilfellet, og viser hvordan du kommer til den eksperimentelle polen driver parametere av 7 mT sweep bredde og 6,8 kHz frekvensen.
    1. Bestem resonator båndbredde (BW Res).
      ligning 1 (1)
      hvor v res er driftsfrekvensen for resonatoren, og Q er kvalitetsfaktoren. Q = 90, er felles for hurtig skanning resonatoren anvendt for å oppnå dataene i Representative resultater.
    2. Bestem rask scan rate α, alleskyldig av resonatoren båndbredde ligning 2 (2)
      ligning 3

      hvor N er en konstant ofte konservativt valgt til å være 5-6, er A b s topp-til-topp-derivat linjebredde på mT, og en er skannehastigheten dersom T / s for en Lorentzian linjebredde.
      Merk: En felles valuta for de radikale i den representative delen er ligning 4 = 0,1 mT. Sammenlignet med tidligere rask skanning litteratur; Ligning 2 er utledet ved å sette signalbåndbredden (BW sig) lik BW Res.
    3. Bestem maksimal rask skanning frekvens tillates av prisen.
      ligning 5 (3)
      ligning 6
      hvor w er bredden av SCAn og f er skanningen frekvens. En sveipebredde på 7 mT dekker 100% av spekteret for strømtenger som benyttes in vivo. Bruk denne verdien og prisen beregnet i (ligning 2) for å bestemme frekvensen.
      ligning 7
  2. Valg av tuning kondensatorer og tuning av rask skanning polen driver
    Merk: Den raske scan polen driver er vanligvis kjører i en gjenklang modus generere en sinusbølge. Resonans opptrer ved en skanne frekvens hvor de induktive og kapasitive reaktanser er like stor og motsatt fortegn, slik at det totale reaktans er nær null.
    1. Finne den riktige kapasitans for den frekvens som bestemmes i 1.1.3 hjelp av induktans, L, av den raske skanderingsspolene og (ligning 4).
      ligning 8
      ligning 9
    2. Fordel C TOT fra (ligning 4) i to for å få kondensator verdier for hver side av den spoledriver kondensatoren boksen.
      ligning 10
      ligning 11
      Merk: Den raske scan polen driver har to forsterkere. Ved valg av en kondensator, må kondensatoren boksen som skal balanseres med en like stor kapasitans på hver side av boksen. De to sider er i serie.
    3. Skru av toppdekselet på kondensator boksen og sett kondensatorer på begge sider som er lik verdien bestemmes i trinn 1.2.2.
    4. Sett på toppen av kondensatoren boksen og skru den ned for å sikre at det forblir på.
    5. Bruke frontpanelet på gjenklang polen driver, justerer utgangsfrekvensen til sinusbølgeform har maksimal amplitude.

2. Utarbeidelse av reagenser og Phantoms

  1. Utarbeidelse av radiCAL
    1. Fjern 15 N-PDT fra fryseren og tillate beholderen å komme til romtemperatur (10-15 min).
    2. Vei opp 1,4 mg av 15 N-PDT ved å bruke en analytisk vekt.
    3. Legge til 1,4 mg av 15 N-PDT til 15 ml deionisert (DI) H 2 O for en endelig konsentrasjon på 0,5 mM.
      Merk: 4-okso-2,2,6,6-tetra (2-CH3) metyl-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-karbamoyl-2,2,5,5-tetra (2-CH3) metyl-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) og 3-karboksy-2,2,5,5-tetra (2- H 3) metyl-1- (3,4,4- 2H-3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-Proxyl) 25 (figur 1E-G) radikalene har langtidsstabilitet (2 år) i vandig oppløsning og ved romtemperatur. Deres faste former blir vanligvis lagret i en fryser eller kjøleskap for å holde disse radikalene stabilt i mange år.Stabiliteten av nitroksid-radikaler generelt gjøre dem ikke-toksiske, og deres fremstilling kan utføres på en vanlig benkeplaten når løsningsmidlet er vann. Ved bruk av organiske løsemidler, forberede nitroksydet løsninger inne i et avtrekksskap mens utstyrt med riktig personlig verneutstyr (PVU).
  2. Utarbeidelse av pH-følsomme trityl radikaler
    1. Vei opp 0,7 mg av triaryl metylradikal (ATAM 4) 26 radikal (1400 g / mol) og oppløses i 200 mL absolutt etanol.
    2. Vei 0,00681 g KH 2PO 4 (136,1 g / mol) og oppløses i 50 ml DI-vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
    3. Vei opp 2,8 g KOH (56 g / mol) og oppløses i 50 ml DI-vann til en endelig konsentrasjon på 1 M.
    4. Legg KOH dråpevis til fosfatbuffer (2.2.2) for å justere pH til 7,0.
    5. Legg 800 pl 1 mM fosfatbuffer og 200 pl ATAM 4 i absolutt etanol til en sluttkonsentrasjonentration på 0,5 mM i buffer 80:20: etanol.
    6. Gjenta trinn 2.2.1-2.2.5 å skape Atam fire prøven ved pH = 7,2.
    7. Plasser Atam 4, pH = 7,0 og Atam 4, pH = 7,2 i separate kvarts prøverør 6 mm.
    8. Plassere begge 6 mm kvarts EPR-rør inn i en 16 mm kvarts EPR tube, med en 2 mm tykk Styrofoam avstandsstykke i mellom.
      Merk: Veggene av kvarts prøverør som er 0,5 mm tykk, og i tillegg til 2 mm avstandsstykke, hvilket ga en 3 mm atskillelse mellom ATAM prøvene. PH-sensitive trityl radikale ble syntetisert ved Ohio State University 26. Eksempelet som ble brukt for bildebehandling kalles ATAM 4. Reaksjonen som utgjør den pH-følsomhet er vist i Figur 1A.
  3. Generering av BMPO-OH
    1. Vei ut 680 mg av KH 2PO 4 og oppløses i 100 ml DI-vann til en endelig konsentrasjon på 50 mM.
    2. Tilsett 1 M KOH slippe kloktil fosfatbuffer til pH = 7,3.
    3. Vei opp 50 mg BMPO (199,25 g / mol).
    4. Bland 50 mg av BMPO med 5 ml fosfatbuffer i en 16 mm kvarts bestråling tube.
    5. Tilsett 100 ul av 300 mM hydrogenperoksyd.
    6. Bestråle blandingen i 16 mm kvarts bestråling rør med en middels trykk 450 W UV-lampe i 5 min.
    7. Ved hjelp av en glass overføring pipette, overføres 2,5 ml av bestrålt BMPO-OH-løsning av kvartsbestrålingsrøret og inn i en side av en 16 mm kvarts prøverør med 3 mm skillelinjen.
    8. Overfør den gjenværende 2,5 ml av bestrålt BMPO-OH inn i den andre siden av 16 mm kvarts prøverør med 3 mm skillelinjen.
  4. Utarbeidelse av dinitroxide radikal
    1. Veie ut 24,7 mg 2 H, 15 N-disulfid dinitroxide (figur 1C) i 1 ml DMSO til en stamoppløsning på 47,5 mM.
    2. Forbered 10 mM Tris-buffer og juster til pH 7,2.
    3. ta 40ul dinitroxide stamløsning og fortynnet med Tris-buffer til en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
    4. Plasser 250 ul dinitroxide oppløsning i buffer i en 16 mm kvarts prøverør med en 10 mm skillevegg i midten.
    5. Vei ut 154 mg av glutation og for å legge til 5 ml Tris-buffer til en endelig konsentrasjon på 100 mM.
    6. Tilsett 5 ul av 100 mM glutation oppløsningen til 250 ul av 1 mM dinitroxide løsning på den ene side av 10 mm deleren for å omdanne diradikal til mono.
  5. Utarbeidelse av nitronyl nitroksyd
    1. Fjern den radikale fra fryseren og tillate beholderen å komme til romtemperatur (10-15 min).
    2. Vei opp 1,9 mg av nitronyl (390 g / mol).
    3. Vei opp 0,56 mg KOH og oppløses i 10 ml DI-vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
    4. Bland 1,9 mg nitronyl inn i 10 ml 1 mM KOH-løsning for en endelig konsentrasjon på 0,5 mM nitronyl.
      Merk: Hvis nødvenAry, bruk en vortexer eller ultralyd til hastighet samle av nitronyl.

3. Oppsett av Rapid Scan Instrument på 250 MHz

Merk: Innstilling av resonatoren med en vandig prøve av nitroksid-radikal, som har en lignende effekt på resonatorens Q og tuning som bufferoppløsning, er en god måte å sette opp for prøven som skal avbildes

  1. Tune resonator med en vandig prøve av nitroksid-radikal.
    1. Sett de 15 ml 0,5 mm 15 N-PDT i vannprøven i et 16 mm kvarts EPR tube.
    2. Sett kvartsrøret inn i deteksjons side av den tverr sløyfe RS-EPR resonatoren.
    3. Endre frekvensen av instrumentet kilden inntil den samsvarer med frekvensen til påvisning side som inneholder prøven. endres manuelt bærefrekvensen for kilden 250 MHz ved å legge inn den ønskede verdi i programvare.
    4. Endre frekvensen av eksitasjon side for å samsvare med frekvenskaper fra forsøket kilden og deteksjons side av resonatoren. Endre frekvensen av den eksitasjon side ved å dreie en variabel kondensator i resonansrommet i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
  2. Sett opp Instrument Console og Main Magnet
    1. Slå på spektrometeret og velg et eksperiment som registrerer forbigående data med tid på abscissen.
    2. I programvaren, angir antall poeng til 65536 og tiden basen til 10 nanosekunder.
    3. Sett antall gjennomsnitt til 10 000 for en sterk eller smal signal, og til 45 000 for en bred eller svakt signal.
    4. Trykk på "delta" -knappen i programvaren til å sende de eksperimentelle parametre fra programvaren til konsollen og energi til hovedfeltet magnet.
    5. Still hoved magnetfeltet til 9 mT.
    6. Sett strøm demping knotten til 50 dB, og slå på 7 W høy effektforsterker.

4. Gjennomføringav Rapid Scan Experiment

Merk: Spesifikke instruksjoner knyttet til analyse av fantomer som inneholder BMPO-OH 24, er pH-sensitive TAM radikaler 19,27 og redoks sensitive dinitroxides 28 gitt i litteraturen.

  1. Strøm metning av standard nitroksyd prøve
    Merk: Det er fordelaktig å gjøre en kraftmetningskurve på en standard nitroksyd radikal prøven under de samme eksperimentelle betingelser som vil bli brukt til å se på radikaler som er følsomme for pH eller redoks-status.
    1. Slå på den raske skanning polen driver med verdiene fra Seksjon 1 (frekvensen på 6,8 kHz og skanning bredde på 7 mT).
    2. Starter på 50 dB, samle en rask skanning spektrum med 100k gjennomsnitt. Minske dempningen 3 dB og gjenta målingen. Fortsette inntil en attenuator innstilling fra 0 dB, eller så lenge som isolasjonsmåling på broen avlesning er <0.
    3. Transfer than rå raske skannedata til en deconvolution program (for eksempel skrevet i Matlab) og behandle rådata til absorpsjon spekteret.
    4. Skriv inn frekvensen, feie bredde, antall poeng og timebase inn i programmet, og kjøre programmet for å behandle rå rask skanning signal til et absorpsjon signal.
    5. Plott amplituden av absorpsjon signal som en funksjon av kvadratroten effekt (i Watt) innfallende på resonatoren. I den ikke-metning regime, er amplituden lineært avhengig av kvadratroten av den innfallende strøm.
    6. Monter en trendlinje som starter på 0,0 og inkluderer alle datapunkter som faller inn i lineær respons regionen. I den lineære respons-området, signal amplituden øker proporsjonalt med kvadratroten av mikrobølgeeffekt.
    7. Ekstrapolere denne trenden til høyere makter, og sammenligne EPR signal intensitet. Bruk den høyeste kraft som signalamplituden ikke avviker mer enn 3% fra den ekstrapolerte trendlinjen. i order for dekonvolveringen av den raske skanne signal skal fungere skikkelig, må signalet fremdeles være i den lineære respons-området i forhold til innfallende strøm.
      Merk: Overføring av rå raske skannedataene kan gjøres over en nettverkstilkobling eller via minnepinne. I dette tilfellet er overføring nødvendig fordi programmet å behandle rådata (Matlab) er ikke på samme datamaskin som har datainnsamling programvare. Dekonvolveringen algoritme som behandler rådata er beskrevet i 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Produktet fra forsøket er et sett av fremspring som er rekonstruert i to-dimensjonale (en spektral, en romlig) bilder med en falsk farge skala som representerer signalamplituden. Deep blue betegner baseline der ingen signal er til stede, er grønn lav amplitude og rødt er høyest. Skiver langs x-aksen (spektral dimensjon) viser EPR-signalet (EPR overgang) på et magnetisk felt akse. Langs y-aksen (romlig dimensjon), separering mellom signaler tilsvarer den fysiske romlig adskillelse mellom prøver i resonatorene.

Figur 3 viser en sammenligning av to bilder, ervervet med CW (figur 3B) eller RS (figur 3a) av et fantom med tre ulike typer av 15 N-substituerte nitroksid-radikaler (figur 3D). Den bredeste signalet tilsvarer 15 N-Proxyl, en fem-medlem pyrrolidine ring med en negativ ladning ved fysiologisk pH, noe som kan bidra til å målrette molekylet til spesifikke cellulære rom. Den dublett signal representerer 15 N-mHCTPO og er resultatet av et enkelt hydrogen blant annet er fullført deuterering. Denne ene splitting er optimalisert for å overvåke endringer i oksygenkonsentrasjonen 30. Den smaleste signalet kommer fra 15 N-PDT, en fleksibel piperidinringen som er helt deuterert. Den kan brukes til å overvåke oksygenkonsentrasjon, eller redoks-miljø (reduksjon av strukturen fører til reduksjon i EPR-signalet).

For det samme fem-minutters akkvisisjonstid viser RS ​​bilde overlegen romlig oppløsning og klarhet av den spektrale mønster for hver radikal. En grunn for forbedring av RS enn CW kan sees ved å sammenligne spektra ved to forskjellige styrker gradient mellom de to teknikker (figur 3C). Som gradient styrken økerspektralsignalet utvides. Betydelig nedbrytning av CW spektrum under de store stigninger (1 mT / cm) som koder for romlig informasjon.

Fordi et derivat signal utvider raskere enn en absorpsjon signal, SNR for den høyeste gradient CW fremspring (rød kurve) er meget dårlig sammenlignet med den høyeste gradient RS spring (blå strek). Linjebredde som en funksjon av romlig posisjon kan utvinnes fra en 2D-plot. Linjebredde vil være bred eller smal basert på endringer i oksygenkonsentrasjonen eller viskositeten rundt nitroksyd sonden. Fantom avbildet på figur 3A var ved værelsestemperatur og åpen til luft. Ettersom oksygeninnhold og viskositet (bestemt ved temperatur) holdt seg stabil, må linjebredden av hver sonde være konstant over bredden av hvert rør inneholdende en radikal. Figur 4 viser spredningslinjebredder i passe stykker fra gjennom 2D-bilde sammenlignettil den sanne linewidth verdi (svart horisontal linje). De image slice verdier, spesielt for 15 N-PDT, er en bedre match til den sanne linewidth verdi for RS (figur 4A) enn for CW (figur 4B). Dette er også et resultat av den forbedrede SNR av RS over CW teknikk.

En annen fordel med RS teknikk er evnen til å generere store magnetiske homogene felt sveip i en meget kort tid. En typisk frekvensen for eksperimenter på 250 MHz er 9 kHz, tilsvarende 0,11 msek. Dette er 0,11 msek om feltet sweep er 0,5 mT eller 5.0 mT. Sammenlign dette med CW, hvor en 5.0 mT sveip tar titalls sekunder til minutter. Med hurtig skanning blir det mulig raskt å samle 100% av den spektrale informasjon i tider som er mottagelig for in vivo avbildning.

Figur 5 viser bredt spekter RS-EPJ imaging brukt til å spinne fangst modeller. Viktige signalmolekyler, som OH • og NEI • er endogene frie radikaler med meget korte levetid. For å studere disse molekylene, blir "spin feller" anvendt. Et eksempel på omsetning av spinnfelle 31 (BMPO) med OH • er vist i figur 1B. Avbildning av et fantom inneholdende 5 uM BMPO-OH adduktet er vist i fig 5 (A, B). Spin-felle adduktet signal er avhengig av utgangskonsentrasjon av OH • og har en halveringstid på 30 minutter som tillater undersøkelse av eventuelle prosesser som genererer OH •. Den nitronyl nitoxide 32 ble brukt som et eksempel på bredt spekter bildebehandling, men har blitt brukt tidligere for spin-fangst av NO • 33,34. Avbildning av et fantom innehold nitronyl er vist i figur 5 (C, D). for spi feller, fange hele spekteret tillater bedre betegnelse av de opprinnelige transiente radikale arter som var til stede.

Følsomhet for fysiologiske endringer som pH og redox status er avledet fra endringer i hele spekteret. Figur 6 viser avbildning med Atam 4. I figur 6B, profilen til ATAM 4 ved pH = 7,0 (blå) har mange spektrale egenskaper, og et stykke fra bildet samsvarer godt med den tilsvarende null-gradient-spektrum (grønn). Sammenligne dette med profilen til ATAM 4 ved pH = 7,4, figur 6C, med færre spektrale egenskaper og fremdeles i god overensstemmelse med den tilsvarende null-gradient spektrum. Avbildning av fantomene innehold av dinitroxide i sin dimer, og redusert monomer form er vist i figur 7. De to forskjellige spektra er generert ved spalting av et disulfid (SS), og så formidle følsomhet for redoks-environment 1,35.

Figur 1
Figur 1. EPR-prober er følsomme for mange fysiologiske forandringer. (A) Et eksempel på de pH-følsomme tri-aryl-metyl- (TAM) radikaler 26. (B) Spin felle BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) nitronyl. (E) 15 N-Proxyl. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Rapid skanne EPR har iboende bedre SNR. (A) Jegn CW EPR amplituden h er en liten brøkdel av det totale signalet, bestemmes av det magnetiske felt modulasjon. (B) I direkte oppdaget rask skanning, er det full signal amplitude oppdaget. Signal til støyøkning er tydelig i forsøket hvor superoksid generert av E. faecalis er fanget med BMPO på X-band. For den samme 30 sek oppkjøpet tid, knapt noen signal er observerbare i CW spektrum (C), mens et sterkt signal er observert i rask skanning spektrum (D) 36. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Bedre SNR gir bedre romlig oppløsning. For samme 5-minutters oppkjøpet tid, RS bilde ( (B). (C) Det er god overensstemmelse mellom anslag innhentet med rask skanning (blå) og CW (rød) når ingen gradient er tilstede (0 mT / cm) (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. informasjonsinnholdet i et hurtig skanning bilde er høyere enn for CW. (A) Skiver av 2D RS bildet. (B) Skiver av 2D CW bildet. Den sanne linjebredde (sort horisontal linje) av hver prøve er vist for sammenligning. Se referanse 23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5. Rapid felt feiing tillater fangst av et helt spektrum i noen få sekunder. (A) 2D spektral-romlig bilde av et fantom bestående av BMPO-OH-addukt. (B) En simulering skikket til null-gradient BMPO-OH-spektrum ved 250 MHz ble brukt til å passe den innledende BMPO-OH bilde og skille mellom områder som inneholder BMPO-OH og støyinneholdende regioner. (C) 14 N nitronyl radikal som kan brukes for fangst av nitrogenoksid in vivo. (D) Slices gjennom hvert spektrum viser den spektrale formen på 250 MHz. Se referanse 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 6
Figur 6. Ingen del av spekteret er utelatt, slik at bedre overvåking av fysiologisk indusert spektrale endringer. (A) 2D spektral-romlig bilde av et fantom som består av to rør av pH sensitive ATAM 4 radikal. (B) Spectral profil ATAM 4 ved pH = 7,0 (blå) og den tilsvarende null-gradient-spektrum (grønn). (C) Spectral profil ATAM 4 ved pH = 7,4 B (blå) og den tilsvarende null-gradient-spektrum (grønn). Se referanser 19,26,37. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Rapid skanning åpner døren til in vivo redox overvåking på 250 MHz. (A) 2D spektral-romlige bilder av 15 N-dinitroxide. (B) Slices gjennom toppen (blå strek) og bunn (rød kurve) avdelinger i de to bildene. (C) Det øverste rommet forblir den samme, men det nedre rom er blitt redusert med glutation. (D) skjærer seg gjennom hvert bildeobjekt som viser endringen i 1D spekteret for det nedre rom. Se referanser 1,28,35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapid-scan signaler har komponenter med høyere frekvens enn CW, og krever en større båndbredde resonator avhengig av linjebredder, relaksasjonstider, og hastigheten av den raske-skanninger. Båndbredden som kreves for et gitt eksperiment er basert på den linjebredde og skanningshastighet av det magnetiske felt (ligning 2). Avhengig av relaksasjonstider til sonden under studie (T 2 og T 2 *) og skannehastighet, kan svingninger vises på den bakre kant av signalet. For nitroksydet radikaler med T 2 ~ 500 nanosekunder på 250 MHz (57 th Rocky Mountain konferansen om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015), eksperimentelle skanne priser er ofte ikke høy nok til å observere eventuelle svingninger.

Den eksperimentelle båndbredde er vanligvis begrenset av resonatoren båndbredde. Hver halvperiode av en hurtig skanning forsøket registreres med enten redusere eller øke feltet / frekvens, slik at den eksperimentelle båndbredden er ½ than resonator båndbredde, som vist i (ligning 1). Dersom den eksperimentelle båndbredden er begrenset av valget av parametere slik at den er større enn resonator båndbredde og oscillasjoner dempes, og utvider resultater i dekonvolveres linje. Siden forsøket båndbredden bestemmes av hastigheten og linjebredden av den radikale som studeres, forstå disse egenskaper er en viktig del av den raske skanningen eksperimentet.

Den nåværende protokoll demonstrerer EPRI på 250 MHz av fantomer som inneholder prober følsomme for oksygen, viskositet, pH, endogen forbigående signalmolekyler (dvs. OH •, NO •) og redox status. Romlig oppløsning på mellom 1 og 3 mm er påvist, med eksperimentelle innhentingstider mellom 29 sekunder (eneste linje med en 15 N spektrum 2 linje, figur 3) og 15 minutter (hele spekteret av fem mikrometer BMPO-OH, figur 5). Metodeutvikling med fantomene showbruk av RS-EPJ bilder erstatter den konvensjonelle CW-EPR avbildningsteknikk 23,24, og åpner nye veier for in vivo avbildning ved hjelp EPJ sonder.

EPRI er fordelaktig i forhold til andre vivo avbildningsteknikker i basert på fluorescens eller fosforescens, som EPR prober er følsomme for et bredere utvalg av in vivo fenomener. I tillegg RF penetrering ved 250 MHz er ~ 7 cm, slik at unormal vev på et dypere nivå kan studeres. Nuclear magnetic resonance imaging (MRI) gir svært detaljerte anatomiske kart, men sliter med å gi kvantitative fysiologiske informasjon. En kombinasjon av MRI og EPRI kunne en dag resultat i et all magnetisk resonans versjon av et positron-emisjon-tomografi (PET) / computertomografi (CT) skanner. Et slikt instrument ville gi den samme fordelen med PET / CT, men uten de tunge stråledoser eller dyre radio-sporstoff.

Metodeutvikling med fantomer fortsetter å presse tHan begrenser av RS-EPR, men det endelige målet er å implementere teknikken i laboratorier bruker dyremodeller. Beregninger for bilde rekonstruksjoner må bli bedre til å øke hastigheten datainnsamling for en 4D eksperiment (3 romlig, en spektral dimensjon). En forbedret algoritme er under utvikling og er avgjørende for in vivo-applikasjoner, men bevis på prinsippet kan gjøres med 2D-avbildning.

Mange av de radikaler, slik som 15 N-PDT, som brukes i fantomer nedbrytes raskt under in vivo-betingelser med halveringstider på bare 60 sekunder. Radikaler med en forbedret resistens overfor in vivo-reduksjon 39 er blitt syntetisert og er viktig for å bygge store nok konsentrasjoner in vivo. Med forbedret sensitivitet på RS-EPR løpet CW-EPR 24 vil være en annen fordel med å løse dette problemet. Sensitiviteten av hurtig skanning er for tiden 5 uM for et fantom, og mellom 100 mM og 5 mm, avhengigsonden som skal avbildes, for dyrestudier ble utført ved University of Chicago (personlig kommunikasjon, Maggio, M., 2015). RS metoden vil fortsette å bli utviklet for å lukke dette gapet, men søknaden har allerede begynt å flytte inn i selve in vivo-programmer (57 th Rocky Mountain konferansen om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Delvis støtte dette arbeidet ved NIH tilskudd NIBIB EB002807 og CA177744 (GRE og SSE) og P41 EB002034 til GRE, Howard J. Halpern, PI, og ved University of Denver er takknemlig erkjent. Mark Tseytlin ble støttet av NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Forfatterne er takknemlige for Valery Khramtsov, nå ved University of West Virginia, og Illirian Dhimitruka ved Ohio State University for syntese av pH-følsomme TAM radikaler, og til Gerald Rosen og Joseph Kao ved University of Maryland for syntese av mHCTPO , proxyl, BMPO og nitronyl radikaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Bioteknologi elektron paramagnetisk resonans (EPR) rask skanning nitroksydet, 250 MHz pH oksygenkonsentrasjon redox status signalmolekyler biofysikk
Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Åpner nye muligheter for Imaging Fysiologisk viktige parametere<em&gt; I Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, J. R., Mitchell, D. G.,… More

Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter