Summary
Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.
Abstract
Bu oksijen yoğunluğu, pH, redoks ile in vivo koşullarında sayısal bilgiler sağlayabilir hızlı tarama elektron paramanyetik rezonans (RS-EPR) kullanılarak 250 MHz'de kararlı bir radikal haberci moleküllerinin 2B spektral mekansal görüntüleme üstün bir yöntem ortaya koymaktadır durumu ve sinyal moleküllerinin konsantrasyonu (yani, OH, • NO). RS-EPR tekniği standart sürekli dalga (CW) tekniğine göre daha yüksek bir hassasiyet, gelişmiş uzaysal çözünürlüğü (1 mm) ve kısa edinme süresi vardır. Fantom yapılandırmaları çeşitli 1 ila 6 mm arasında değişen uzamsal çözünürlük ve 16 μT (160 mg), 5 mt (50 g) arasında değişen haberci moleküllerinin spektrum genişliği ile test edilmiştir. Hızlı tarama efekti EPR sinyali artan, daha fazla güç doygunluk önce spin sisteminin giriş olmasını sağlar iken bir çapraz döngü bimodal rezonatör, uyarma ve algılama, gürültü azaltma decouples. BuGeleneksel CW EPR deneylerde belirgin şekilde daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı yol açmaktadır.
Introduction
Diğer tıbbi görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında, elektron paramanyetik rezonans görüntüleme (EPRI) kantitatif görüntü difüzyon pH 1-3, pO2 4-7 sıcaklığı 8, perfüzyon ve dokuların 9 canlılığı, microviscosity ve kullanım kolaylığı da dahil olmak üzere fizyolojik özelliklerini benzersiz yapabiliyor küçük moleküller 10 ve oksidatif stres 11. Dokuda glutatyon (GSH) ve hücreler 12,13 ile disülfid bölünme kolaylığı Tahmini redoks durumuna ilişkin rapor edebilirsiniz. Bu frekanslar yoğunlukları dielektrik kayıp etkilerle azalmadı edildiği küçük hayvanlar için görüntüler oluşturmak için (birkaç cm kadar) doku penetrasyonu yeterli derinlikte sağlar, çünkü in vivo görüntüleme için, 250 MHz, 1 GHz frekans aralığında EPR seçilir. Örneğin 9.5 GHz 14 (x-bant) ve 17 GHz (K U -BAND) 15,16 gibi daha yüksek frekanslar, cilt ve saç ya da tek hücre görüntüleme için kullanılabilir, sırasıyla. tüm frekanslarda EPRI başarısı konumları ve kader yansıması, böylece dokular için spesifik olan paramanyetik spin sondası bağlıdır.
bir elektron spin sondası çevre mekansal heterojen ise, EPR spektrumu bütün yerlerden katkısının toplamına eşittir. Spektral-uzamsal görüntüleme küçük mekansal kesimleri bir diziye numunenin hacmi böler ve bu segmentlerin 17 her biri için EPR spektrumu hesaplar. Bu EPR spektrumunda mekansal değişimi ölçerek yerel çevrenin haritalama sağlar. Manyetik alan gradiyentleri projeksiyonları denir EPR spektrumları, içine uzamsal bilgiyi kodlamak için kullanılır. Spektral ve mekansal görüntü bu projeksiyonlar 18,19 den yeniden yapılmıştır.
RS-EPR manyetik alan (Şekil 2) 20,21 elektron spin gevşeme süreleri kısa akrabası olan bir süre içinde rezonans ile taranır. D Hızlı tarama sinyalinin econvolution geleneksel birinci türev CW spektrumun birinci integrali eşdeğer absorpsiyon spektrumu verir. eğirme sistemi tepkisinin hem emme ve dağıtma bileşenleri ölçülür, böylece hızlı tarama sinyali, kareleme tespit edilir. Bu temelde iki birim zamanda veri miktarını topluyor. Yüksek güçler doygunluğu için endişe olmadan kullanılabilir böylece hızlı bir tarama deneyinde sinyalin Doygunluk, CW için daha yüksek güçlerde olur. 20,22 Çok daha fazla ortalama CW kıyasla birim zamanda yapılabilir. Yüksek güç, doğrudan dördün algılama ve birim zamanda daha fazla ortalama yüksek kalitede görüntülere lider, özellikle mekansal ayrılık tanımlayan yüksek gradyan projeksiyonları, Hızlı tarama daha iyi bir sinyal-gürültü oranı (SNR) vermek için birleştirir. Hızlı tarama 23 gibi CW için sürece yaklaşık 10 kez gerekli bir hayalet bir görüntü için aynı SNR hakkında elde etmek.
tert "> yüksek SNR ayrıca OH reaksiyonu ile oluşturulmuş düşük konsantrasyonda spin tuzağına ilave maddeleri ile 250 MHz'de deneyler sağlar 5-ters-bütoksikarbonil-5-metil-1-pyrroline- N-oksit (BMPO-OH) olacaktır bir disülfıd bağlayıcı ile bağlı CW yöntemine 24 görünmez. Dinitroxides glutatyon ile bölünmeye karşı duyarlı olan ve bu nedenle hücresel redoks durumuna ilişkin rapor edebilirsiniz. Denge var, di ve mono-radikal formlar arasında, glutatyon mevcut konsantrasyonuna bağlıdır. bu değişiklikleri gözlemleyerek tüm 5 mT geniş spektrumlu yakalama gerektirir ve bir CW deneyde manyetik alan adım kıyasla hızlı tarama EPR ile çok daha hızlı elde edilebilir.spektrometre, ana alan mıknatıs, hızlı tarama bobin sürücü ve hızlı tarama çapraz döngü rezonatör: Tam bir hızlı tarama sistemi dört bölümden oluşmaktadır. Ana Zeeman alan ayarı spektrometresi ve CW deneyde aynı ana alan mıknatıs işlevi,ve rezonatör veri toplama. Hızlı tarama bobin sürücü hızlı tarama çapraz döngü rezonatör üzerinde özel olarak tasarlanmış hızlı tarama bobinleri gider sinüzoidal tarama akımı üretir. Hızlı tarama çapraz döngü rezonatör üzerinde hızlı tarama bobinleri 3 ve 15 kHz arası frekanslarda süpürüldü bir büyük homojen bir manyetik alan üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
250 MHz'de Hızlı Tarama Bobin Driver 1. Kur
- Hızlı Tarama Deneysel Koşullar hesaplanması
Not: RS-EPR en önemli parametre tarama sıklığına ve tarama genişliği (Denklem 3) ürünüdür tarama hızı, α vardır. Dar tarama genişlikleri için, hızlı tarama hızları kullanılır ve geniş süpürme genişlikleri için, yavaş tarama hızları kullanılır. Aşağıdaki yönergeler ikinci durumda adım ve 7 mT tarama genişliği ve 6.8 kHz tarama frekansı deneysel bobin sürücü parametrelerine ulaşmak için nasıl gösterir.- Rezonatör bant genişliği (BW Res) belirleyin.
(1)
nerede v res rezonatör çalışma frekansı ve Q kalite faktörü olduğunu. Q = 90, Temsilcisi Sonuçlar verileri elde etmek için kullanılan hızlı tarama rezonatör yaygındır. - Tüm α, hızlı tarama oranını belirlemekrezonatör bant genişliği ile borçlu
(2) 
N, genellikle konservatif 5-6 olacak şekilde seçilir, bir sabit olduğu, ΔB s mT tepe-tepe türevi çizgi kalınlığı olan ve bir Lorentz çizgi kalınlığı için T / S, tarama oranıdır.
Not: temsilci bölümünde radikallerin için ortak bir değerdir
= 0.1 mT. Daha önce hızlı tarama literatür ile karşılaştırıldığında; Denklem 2 BW Res eşit sinyal bant genişliği (BW sig) ayarlayarak elde edilir. - oranı ile izin verilen maksimum hızlı tarama frekansını belirlemek.
(3) 
burada W SCA genişliğidirn ve f tarama frekansı. 7 mT bir tarama genişliği in vivo kullanılan geçerli problar için spektrumun% 100 karşılayacaktır. Tarama sıklığını belirlemek için bu değeri ve (Denklem 2) hesaplanan oran kullanın.
- Rezonatör bant genişliği (BW Res) belirleyin.
- Ayar kapasitörler seçimi ve hızlı tarama bobin sürücü ayar
Not: Hızlı tarama bobin sürücü tipik bir sinüs dalgası üreten bir yankı buldu modunda çalıştırın. Rezonans toplam reaktans sıfıra yakın olacak şekilde endüktif ve kapasitif reactances, eşit büyüklük ve zıt işaretler olduğu bir tarama frekansta oluşur.- Hızlı tarama bobinlerin indüktans, L kullanılarak 1.1.3 belirlenen frekansta ve (Denklem 4) için uygun kapasitans belirleyin.
- Bobin sürücü kondansatör kutusunun her iki tarafı için kondansatör değerlerini almak için yarım (Denklem 4) C TOT bölün.
Not: Hızlı tarama bobin sürücü iki amplifikatörler vardır. bir kondansatör seçerken, kapasitör kutusu kutunun her iki tarafında eşit bir kapasitans ile dengelenmelidir. iki taraf seri vardır. - Kondansatör çerçevenin üst kapağı çıkarın ve aşama 1.2.2 belirlenen değere eşit olan her iki tarafta kondansatörler yerleştirin.
- kondansatör kutusunun üst değiştirin ve üzerinde kalmasını sağlamak için aşağı vida.
- sinüs dalga maksimum genliği vardır kadar yankı buldu bobin sürücü ön panelini kullanarak, çıkış frekansı ayarlayın.
- Hızlı tarama bobinlerin indüktans, L kullanılarak 1.1.3 belirlenen frekansta ve (Denklem 4) için uygun kapasitans belirleyin.
(1) 
(2) 
= 0.1 mT. Daha önce hızlı tarama literatür ile karşılaştırıldığında; Denklem 2 BW Res eşit sinyal bant genişliği (BW sig) ayarlayarak elde edilir. 
(3) 
Reaktifler ve Hayaletler 2. Hazırlık
- Radi hazırlanmasıCAL
- Dondurucudan 15 N-FDT çıkarın ve konteyner oda sıcaklığında (10-15 dk) gelmek için izin verir.
- Bir analitik terazi kullanılarak 15 N-PDT 1.4 mg tartın.
- 0.5 mM'lik bir son konsantrasyon için 15 ml iyonu giderilmiş (Di) H2O için 15 N-PDT 1.4 mg ekleyin.
Not: 4-okso-2,2,6,6-tetra (2H 3) metil-1- (3,3,5,5- 2H 4, 1 15 K) piperdinyloxyl (15 N-PDT) 4- 1 H-3-karbamoil-2,2,5,5-tetrahidro (2H 3) metil-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) ve 3-karboksi-2,2,5,5-tetra (2 H3) metil-1- (3,4,4-2H 3, 1 15 K) pirolidiniloksi (15 N-PROXYL) 25 (Şekil 1 E-G) kökleri, sulu çözelti içinde uzun vadeli stabilite (2 yaş) ve oda sıcaklığında. Bunların katı formlar genellikle uzun bir süre stabil olan bu radikaller tutmak için bir dondurucu veya buzdolabı depolanır.nitroksit köklerinin stabilite genellikle bunları toksik olmayan hale ve çözücü su olduğunda bunların hazırlanması normal sıra üzerine yapılabilir. organik çözücüler kullanıldığında uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) ile donatılmış iken, bir davlumbaz içine nitroksid çözümleri hazırlamak.
- PH duyarlı tritil radikalleri hazırlanması
- Kökü triaril metil 0.7 mg (atam 4) 26 kökü (1400 g / Mol) tartılır ve mutlak etanol içinde 200 ul içinde çözülür.
- KH 2 PO 4 (136.1 g / mol) 0,00681 g tartılır ve 1 mM nihai konsantrasyon 50 ml Dİ su içinde çözülür.
- KOH (56 g / mol), 2.8 g tartılır ve 1 M arasında nihai bir konsantrasyona DI 50 ml su içinde çözülür
- KOH 7.0 pH değerini ayarlamak için, fosfat tamponu (2.2.2) damla damla ekleyin.
- Nihai konsantre 1 mM fosfat tampon 800 ul mutlak etanol içinde atam 4 200 ul ekle80:20 tampon içinde 0.5 mM entration: etanol.
- Tekrarlayın pH = 7.2 Atam 4 örnek oluşturmak için 2.2.1-2.2.5 adımları.
- Ayrı 6 mm kuvars numune tüpleri içine Atam 4, pH = 7.0 ve Atam 4, pH = 7.2 yerleştirin.
- arasında 2 mm kalınlığında Strafor spacer, 16 mm kuvars EPR tüp içine de 6 mm kuvars EPR tüpleri yerleştirin.
Not: kuvars numune tüpü duvarları atam örnekleri arasında, 3 mm ayırma verim 0.5 mm kalınlığında, ve 2 mM aralama ek olarak. Kullanılan pH duyarlı tritil radikalleri Ohio State University'de 26 sentezlenmiştir. Görüntüleme için kullanılan, Örnek atam 4 adlandırılır. PH duyarlılığı oluşturan Reaksiyon Şekil 1A'da gösterilmiştir.
- BMPO-OH Üretimi
- KH 2 PO 4 680 mg tartılır ve 50 mM'lik bir son konsantrasyon için, 100 ml Dİ su içinde çözülür.
- 1 M KOH damla damla ekleyinpH = 7.3 fosfat tampon.
- BMPO 50 mg (199,25 g / Mol) tartılır.
- 16 mm kuvars ışınlama tüp içinde fosfat tampon solüsyonundan 5 ml BMPO 50 mg birleştirin.
- 300 mM hidrojen peroksit, 100 ul ekle.
- 5 dakika boyunca orta basınç 450 W UV lambası ile 16 mm kuvars ışınlama tüp karışımı ışın tedavisi.
- cam aktarım pipeti kullanarak, kuartz ışın tüpü üzerinden 3 mm bölücü ile 16 mm kuvars numune tüpün bir tarafına ışınlanmış BMPO-OH çözeltisine 2.5 ml aktarın.
- 3 mm bölücü ile 16 mm kuvars örnek tüp diğer tarafında içine ışınlanmış BMPO-OH kalan 2.5 ml aktarın.
- Dinitroxide kökü hazırlanması
- 47.5 mM'lik bir stok çözeltisi 1 ml DMSO içinde 2 saat, 15 N-disülfid dinitroxide (Şekil 1C) 24.7 mg tartılır.
- 10 mM Tris tamponu hazırlamak ve pH 7.2 olacak şekilde ayarlanır.
- 40 atınul stok solüsyonu dinitroxide 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar Tris tamponu ile seyreltilir.
- merkezinde 10 mm bölücü 16 mm kuvars tüpte tampon dinitroxide çözeltisi 250 ul koyun.
- glutatyon 154 mg tartılır ve 100 mM'lik bir son konsantrasyon için Tris tamponu, 5 ml ekle.
- monoradikaline içine diradikali dönüştürmek için 10 mm bölücünün bir tarafında 1mM dinitroxide çözeltisi 250 ul 100 mM glutatyon solüsyonuna 5 ul ekle.
- Nitronyl nitroksitten hazırlanması
- dondurucu radikal çıkarın ve konteyner oda sıcaklığında (10-15 dk) gelmek için izin verir.
- nitronyl (390 g / mol) 1.9 mg tartılır.
- KOH 0.56 mg tartılır ve 1 mM nihai konsantrasyon 10 ml Dİ su içinde çözülür.
- 0.5 mM nitronyl bir son konsantrasyon için, 1 mM KOH çözeltisi 10 ml nitronyl 1.9 mg karıştırın.
Not: Gerekli olduğunda iseli, nitronyl hızı solvation bir vorteks veya sonikatör kullanın.
250 MHz'de Hızlı Tarama Aracı 3. Kur
Not: tampon çözelti olarak rezonatör Q ve ayar üzerinde benzer bir etkiye sahiptir radikal nitroksitten sulu numune ile rezonatörün Tuning yansıması örnek için kurmak için iyi bir yoldur
- Dinle radikal nitroksitten sulu numune ile rezonatör.
- 16 mm kuvars EPR tüp içine su numunesinde 0.5 mM 15 N-PDT 15 ml ekleyin.
- Çapraz döngü RS-EPR rezonatör algılama tarafına kuvars tüp yerleştirin.
- bu örnek içeren algılama tarafında sıklığını kavuşana kadar enstrüman kaynağının frekansı değiştirin. El ile yazılımda istenilen değeri girerek 250 MHz kaynağının taşıyıcı frekansı değiştirin.
- FREKAN eşleştirmek için uyarım yan frekansını değiştirmekrezonatörün Deney kaynağı ve algılama tarafının leri. üreticinin protokolüne uygun olarak rezonatör boşluğu içinde değişken bir kondansatör çevirerek uyarım yan sıklığını değiştirir.
- Enstrüman Konsolu ve Ana Magnet kurmak
- spektrometre açın ve apsis üzerinde zamanla geçici verileri kaydeden bir deney seçin.
- yazılım içinde, 65.536 kadar noktalarının sayısını ve 10 nsaniye zaman tabanını ayarlayın.
- Güçlü ya da dar sinyal için 10.000 ortalamalara sayısını ayarlayın ve geniş veya zayıf sinyal için 45.000.
- konsola yazılım deneysel parametreleri göndermek ve ana alan mıknatıs enerji için yazılımdaki "meşgul" düğmesine basın.
- 9 mT ana manyetik alanını ayarlayın.
- 50 dB Güç zayıflama düğmesini ayarlayın ve 7 W yüksek güç amplifikatörü açın.
4. YürütmeHızlı Tarama Deney
Not: BMPO-OH 24 ihtiva fantomların analizi ile ilgili özel talimatlar, pH duyarlı TAM kökleri 19,27 ve redoks duyarlı dinitroxides 28 literatürde verilmektedir.
- Standart nitroksid numune güç doyma
Not: pH veya redoks durumuna hassas radikalleri bakmak için kullanılacak aynı deney koşulları altında, standart bir nitroksit radikali örnek üzerinde bir elektrik doyum eğrisini yapmak avantajlıdır.- Bölüm 1 (6.8 kHz tarama frekansı ve 7 mT tarama genişliği) değerleri ile, hızlı tarama bobin sürücüsü açın.
- 50 dB başlayarak, 100k ortalamaları ile hızlı bir tarama spektrum toplamak. 3 dB zayıflama azaltmak ve ölçümü tekrarlayın. Ya da köprü üstünde, izolasyon ölçümü <0 olduğu sürece 0 dB zayıflatıcı ayarına kadar devam eder.
- aktarım to bir Dekonvolüsyonun programına ham hızlı tarama verileri (Matlab yazılı örneğin) ve emilim spektrumu içinde ham verileri işlemek.
- programa noktaları ve zaman tabanı tarama sıklığı, süpürme genişliği, numarasını girin ve bir emme sinyal içine çiğ hızlı tarama sinyalini işlemek için programı çalıştırın.
- rezonatör kare kökü (Watt) güç olayın bir fonksiyonu olarak emme sinyalinin genliği çizilir. olmayan doyurarak rejiminde, genlik olay gücünün kare kökü doğrusal bağlıdır.
- 0,0 başlayan bir trend çizgisi Fit ve doğrusal tepki bölgeye giren tüm veri noktalarını içerir. Lineer tepki bölgesinde, mikrodalga gücünün kare kökü ile orantılı sinyal genliği artar.
- yüksek güçlere bu eğilimi tahmin ve EPR sinyal yoğunluğu karşılaştırın. sinyal genliği çıkarsamalı trend çizgisi fazla% 3 sapma olmadığı için yüksek güç kullanın. ordedüzgün çalışması için hızlı tarama sinyalinin Dekonvolüsyonun r, sinyal hala olay gücüne göre doğrusal tepki bölgede olmalıdır.
Not: Ham hızlı tarama veri transferi bir ağ bağlantısı üzerinden veya başparmak götürmek aracılığıyla yapılabilir. Bu durumda transfer programı veri toplama yazılımına sahip aynı bilgisayarda değil (Matlab) ham verilerin işlenmesi nedeniyle gereklidir. Ham veriyi işler ters evrişim algoritması 29 tarif edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney ürün sinyal genliği temsil etmek yanlış bir renk skalası ile görüntüleri (tek spektral bir mekansal) iki boyutlu olarak yeniden inşa edilir projeksiyonlar kümesidir. hiçbir sinyal mevcut olduğu Masmavi taban çizgisini gösterir, yeşil düşük genlikli ve kırmızı en yüksek olmasıdır. x ekseni (spektral boyutta) boyunca dilimler manyetik alan eksen üzerinde EPR sinyali (EPR geçiş) tasvir. y ekseni (mekansal boyut) boyunca, sinyaller arasındaki ayrım rezenatörlerde numuneler arasındaki fiziksel mekansal ayrılık karşılık gelir.
Şekil 3 CW (Şekil 3B) ya da 15 N ikame nitroksid radikaller (Şekil 3D) üç farklı türde bir hayalet RS (Şekil 3A) ile elde edilen iki görüntü, bir karşılaştırmasını gösterir. Geniş sinyal 15 N-PROXYL, beş elemanlı bir pirol tekabülBelirli bir hücre bölmeleri molekülü hedef yardımcı olabilir fizyolojik pH'da negatif yük ile -piridin halkadır. Çift sinyalin 15 N-mHCTPO ait ve aksi takdirde tam bir deuteration arasında tek bir hidrojen sonucudur. Bu tek bölme oksijen konsantrasyonunun 30 değişiklikleri izlemek için optimize edilmiştir. Dar sinyal 15 N-PDT tamamen dötere esnek bir piperidin halkası gelir. Oksijen konsantrasyonu, veya redoks ortamı izlemek için kullanılabilir (yapının azaltılması EPR sinyali azalmaya neden olur).
Aynı 5 dakikalık edinme süre için, RS görüntü her radikal spektral desen üstün uzaysal çözünürlüğü ve netlik gösterir. CW fazla RS iyileştirilmesi için bir nedeni, iki teknik (Şekil 3C) arasında iki farklı degrade güçlü Spectra karşılaştırılarak görülebilir. gradyan mukavemeti arttıkçaspektral sinyal genişletilir. uzamsal bilgiyi kodlayan yüksek geçişlerini (1 mT / cm) altında CW spektrumunun önemli bozulması.
Bir türev sinyali bir emilim sinyali daha hızlı genişletir, çünkü en yüksek gradyan CW projeksiyon için SNR (kırmızı iz) en yüksek degrade RS projeksiyon (mavi iz) ile karşılaştırıldığında çok kötü. mekansal konumunun bir fonksiyonu olarak çizgi genişliği 2B grafiğinden elde edilebilir. Çizgi kalınlığı nitroksid prob etrafında oksijen konsantrasyonu veya viskozite değişikliklere dayalı geniş ya da dar olur. Şekil 3A görüntülü fantom, oda sıcaklığında ve havaya açık. Oksijen miktarı ve (sıcaklık tarafından belirlendiği gibi) viskozite sabit kaldı için, her prob çizgi genişliği. Radikal içeren her tüpünün eni boyunca sabit Şekil 4 Çizgi genişlikleri de dağılım göre 2D görüntü üzerinde dilim uygun gösterir olmalıdırGerçek çizgi kalınlığı değeri (siyah yatay çizgi). Özellikle 15 N-PDT için görüntü dilim değerleri, CW (Şekil 4B) için daha RS (Şekil 4A) için de geçerlidir çizgi kalınlığı değeri daha iyi bir maç vardır. Bu aynı zamanda CW tekniği üzerinde RS geliştirilmiş SNR bir sonucudur.
RS tekniğin bir başka yararı, çok kısa bir süre içinde geniş bir manyetik alan homojen temizleyicileri üretme yeteneğidir. 250 MHz'de deneyler için tipik bir tarama frekansı 0.11 msn karşılık gelen 9 kHz. Bu alan süpürme 0.5 mT veya 5.0 mT olup olmadığı 0.11 msn olduğunu. 5,0 mT süpürme dakika saniye onlarca alacak CW, bu karşılaştırın. Hızlı tarama ile hızlı bir şekilde in vivo görüntüleme için uygun olan zamanlarda spektral bilgi 100% toplamak mümkün olur.
Şekil 5 geniş spektrumlu RS-EPR göstermek imaging yakalama modelleri dönmeye başvurdu. OH • ve NO • gibi önemli sinyal molekülleri, çok kısa ömür ile endojen serbest radikallerin vardır. Bu molekülleri incelemek için, "spin tuzakları" kullanılmıştır. OH • spin tuzağına 31 (BMPO) reaksiyon bir örneği Şekil 1B 'de gösterilmiştir. 5 uM BMPO -OH ilave maddeyi ihtiva eden bir hayali Görüntüleme Şekil 5 (A, B) 'de gösterilmektedir. Spin tutucu katkı maddesi sinyali OH • başlangıç konsantrasyonuna bağlıdır ve • OH oluşturmak herhangi bir proseslerin çalışma izin 30 dakikalık bir yarı ömre sahiptir. Nitronyl nitoxide 32 geniş spektrumlu görüntüleme Başka bir örnek olarak kullanılmıştır, ama hayır • 33,34 spin-yakalama için geçmişte kullanılmıştır. Nitronyl içeren bir fantom görüntüleme Şekil 5 (C, D) gösterilir. sptuzakları, tüm spektrumu yakalama mevcuttu orijinal geçici radikal türlerinin daha iyi tanımlanmasına olanak verir.
PH ve redoks durumu gibi fizyolojik değişikliklere duyarlılık. Tüm spektrumda değişiklikler türetilmiş Atam 4 ile 6 gösterileri görüntüleme Şekil edilir. Şekil 6B, pH Atam 4 profili = 7.0 (mavi) birçok spektral özelliklere sahiptir ve görüntüden bir dilim gelen sıfır degrade spektrumunun (yeşil) ile iyi bir uyum. İlgili sıfır degrade spektrumunun ile iyi bir anlaşma hala az spektral özelliklere sahip, pH = 7.4, Şekil 6C'de de Atam 4 profiline bu karşılaştırın ve. Bunu dimerik de dinitroxide ihtiva fantomların görüntüleme ve monomerik formda indirgenmiş iki farklı spektrumları bir disülfid (SS) yarılmasıyla üretilir. Şekil 7'de gösterildiği üzere, ve bu nedenle env redoks hassasiyeti ifade edilir1,35 ironment.
Şekil 1. EPR probları bir çok fizyolojik değişikliklere duyarlıdır. (A) pH'a duyarlı tri-aril-metil (TAM) köklerinin 26 bir örneği. (B) Spin tuzak BMPO. (C), 15 N-dinitroxide. (D) nitronyl. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Hızlı EPR doğal daha iyi SNR vardır tarayın. (A) In CW EPR amplitüd H manyetik alan modülasyon ile belirlenen toplam sinyal, küçük bir kısmı vardır. Doğrudan tespit hızlı tarama (B), tam sinyal genliği tespit edilir. Gürültü artışı sinyali süperoksit E. tarafından oluşturulan deney açıktır faecalis X-bandında BMPO ile tutulur. Aynı 30 sn edinme kez, neredeyse hiç sinyal güçlü bir sinyal hızlı tarama spektrumunun (D) 36 gözlenirken CW spektrumun (C) gözlemlenebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SNR Geliştirilmiş Şekil 3. iyi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Aynı 5 dakikalık edinme süre için, RS görüntü (
Şekil 4. hızlı bir tarama görüntüsünün bilgi içeriğinin CW için daha yüksektir. 2B RS görüntü (A) Dilimleri. 2B CW görüntü (B) Dilimleri. Her numunenin gerçek çizgi genişliği (siyah yatay çizgi) karşılaştırma için gösterilmiştir. 23 referans Bkz. Için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.
Süpürme Şekil 5. Hızlı alan birkaç saniye içinde bütün bir yelpazenin yakalama sağlar. BMPO-OH adüktü oluşan bir fantom (A) 2D spektral-mekansal görüntü. (B) 250 MHz sıfır gradyan BMPO -OH spektrumuna bir simülasyon uygun başlangıç BMPO-OH, görüntü uygun ve BMPO-OH ihtiva eden bölgeler ve gürültü ihtiva eden bölgeler arasında ayırt etmek için kullanıldı. (C), in vivo olarak, nitrik oksit yakalama için kullanılabilir kökü 14 N nitronyl. Her spektrum ila (D) Dilimler 250 MHz'de bir spektrum göstermektedir. 19 referans Bkz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. yelpazenin hiçbir kısmı fizyolojik kaynaklı spektral değişiklikler daha iyi izlenmesine izin dışında bırakılmıştır. (A) 2D spektral ve mekansal görüntü radikal Atam 4 hassas pH İki tüpten oluşan bir hayalet evi. (B) pH Atam 4 spektral profili = 7.0 (mavi) ve karşılık gelen sıfır degrade spektrumu (yeşil). (C) pH Atam 4 spektral profili = 7.4 B (mavi) ve karşılık gelen sıfır degrade spektrumu (yeşil). Referanslar 19,26,37 bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Hızlı tarama. 250 MHz'de in vivo redoks izleme kapıyı açar 15 N-dinitroxide (A) 2D spektral-uzamsal görüntüler. (B) iki resim üst (mavi iz) ve alt (kırmızı iz) bölmeleri ile Dilimleri. (C), üst bölme aynı kalır, ancak üst bölme glutatyon ile düşürüldü. (D) Dilim Her resim nesnesi üzerinden alt bölmesi 1D spektrumunda değişim gösteren. Referanslara bakınız 1,28,35. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hızlı tarama sinyalleri CW daha yüksek frekans bileşenleri ve Çizgi genişlikleri gevşeme sürelerine bağlı olarak daha büyük bir rezonatör bant genişliği, ve hızlı tarama hızı gerektirir. Belirli bir deney için gereken bant genişliği çizgi genişliği ve manyetik alan (Denklem 2) tarama hızına dayanır. Çalışmanın altında prob gevşeme süreleri bağlı (T 2 ve T 2 *), ve tarama hızı, salınımlar sinyalin firar kenarında görünebilir. 250 MHz'de T 2 ~ 500 NSEC ile nitroksid radikalleri için (Manyetik Rezonans 57 inci Rocky Mountain Konferansı, Epel, B, ve ark., 2015), deneysel tarama hızları genellikle herhangi bir salınımların gözlemlemek için yeterince yüksek değildir.
Deneysel bant genişliği tipik haliyle rezonans bant genişliği ile sınırlıdır. hızlı bir tarama deneyinin her yarım döngüsü azalan veya alan / artan sıklıkla biriyle kaydedilir, böylece deneysel bant genişliği ½ t(Eşitlik 1) 'de gösterildiği gibi o bant genişliği Resonator. Deneysel bant parametre seçimi ile sınırlı ise bu rezonans bant genişliğinden daha fazla olduğu ve salınımlar deconvolved doğrultusunda sonuçlar genişletilmesi, bastırılır, öyle ki. Deney bant genişliği çalışılan oranı ve radikal LineWidth tarafından belirlenir yana, bu özellikleri anlamak hızlı tarama deney önemli bir bileşenidir.
Geçerli protokol 250 oksijen, viskozite, pH, endojen geçici sinyal molekülleri duyarlı sondalar içeren fantomların MHz (yani, OH, • NO) ve redoks statüsünde Epri gösteriyor. 1 ila 3 mm arasındaki mekansal çözünürlükleri 29 saniyede (2 satır 15 N spektrumunun tek hat, Şekil 3) ve 15 dakika arasında bir deney elde etme süreleri ile gösterilmiştir (bütün spektrumu 5 uM BMPO -OH, Şekil 5). fantomları gösterileri ile yöntem geliştirmeRS-EPR görüntülerin kullanılması geleneksel CW-EPR görüntüleme tekniği 23,24 yerini ve EPR problar kullanılarak in vivo görüntüleme için yeni yollar açar.
EPR sondalar, in vivo fenomen daha geniş bir duyarlı olarak EPRI, flüoresan veya fosfor göre başka in vivo görüntüleme teknikleri avantajlıdır. daha derin bir düzeyde anormal doku ele alınabilir, böylece ek olarak, 250 MHz RF penetrasyon, ~ 7 cm. Nükleer manyetik rezonans görüntüleme (MRG) çok detaylı anatomik haritalar sağlar, ancak nicel fizyolojik bilgi sağlamak için mücadele eder. MRG ve EPRI bir arada olabilir bir pozitron emisyon tomografisi (PET) / bilgisayarlı tomografi (BT) tarayıcının bir bütün manyetik rezonans sürümünde bir gün sonuç. Böyle bir enstrüman PET / BT'nin aynı yararı sağlayacak, ama olur ağır radyasyon dozları ya da pahalı radyo izleyiciler olmadan.
fantom ile Yöntem geliştirme t zorlamaya devam ediyoro RS-EPR sınırlar, ama nihai hedefi hayvan modelleri kullanarak laboratuvarlarda teknik uygulamaktır. görüntü rekonstrüksiyon için Hesaplamalar 4D deneyde (3 uzamsal, 1 spektral boyut) için veri toplamayı hızlandırmak için geliştirilmiş olması gerekir. Gelişmiş bir algoritma şu anda gelişmiş ve in vivo uygulamalar için gerekli ancak prensip kanıtı 2B görüntüleme ile yapılabilir olduğunu ediliyor.
Fantom kullanılan radikaller, örneğin 15 N-PDT, çoğu sadece 60 saniye yarı ömür in vivo koşullar altında hızlı bir şekilde bozulmasına yol açar. In vivo olarak indirgenmesinde 39 gelişmiş bir direnci olan radikaller sentezlenmiş ve in vivo olarak yeteri kadar yüksek seviyede yapı için önemli olan edilmiştir. CW-EPR 24 üzerinde RS-EPR gelişmiş duyarlılığı bu sorunun çözümünde başka bir yararı olacaktır. Hızlı tarama duyarlılığı henüz fantom 5 uM ve 100 uM ve 5 mm arasında, bağlıSonda Chicago Üniversitesi'nde gerçekleştirilen hayvan çalışmaları için, yansıması (kişisel iletişim, Maggio, M., 2015). RS yöntemi, bu açığı kapatmak için geliştirilmeye devam edecektir, ancak uygulama zaten in vivo uygulamalarda gerçek taşınmak başladı (57 inci Rocky Mountain Konferansı Manyetik Rezonans üzerinde, Epel, B, ve ark., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH tarafından bu işin kısmi destek GRE, Howard J. Halpern, PI NIBIB EB002807 ve CA177744 (GRE ve SSE) ve P41 EB002034 verir ve Denver Üniversitesi tarafından minnetle kabul edilmektedir. Mark Tseytlin NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar mHCTPO sentezi için pH duyarlı TAM radikallerin sentezi için Ohio State Üniversitesi'nde şimdi Batı Virginia Üniversitesi Valery Khramtsov, ve Illirian Dhimitruka minnettarız ve Maryland Üniversitesi'nde Gerald Rosen ve Joseph Kao , PROXYL, BMPO ve nitronyl radikalleridir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) | CDN Isotopes | M-2327 | 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada |
| 4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29 |
| 3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25 |
| 4 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | 707-SQ-100M | |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) | CDN Isotopes | D-2328 | 98% atom D, Quebec Canada |
| pH sensitive trityl radical (aTAM4) | Ohio State University | N/A | Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26 |
| Potassum Phosphate, Monobasic | J.T. Baker Chemicals | 1-3246 | |
| 6 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-5M-6M-0-250/RB | |
| 8 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-7M-8M-0-250/RB | |
| 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30 |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 SIGMA | 30% |
| 16 mm Quartz EPR tube | Wilmad Glass | 16-7PP-11QTZ | |
| Medium Pressure 450 W UV lamp | Hanovia | 679-A36 | Fairfield, NJ |
| L-Glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G470-5 | |
| Nitronyl | NA | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31 |
| Sodium Hydroxide | J.T. Baker Chemicals | 1-3146 |
References
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
- Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I.
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
- Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
- Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
- Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
- Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
- Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
- Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
- Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
- Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
- Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
- Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
- Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
- Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
- Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
- Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
- Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
- Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
- Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
- Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
- Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
- Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
- Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
- Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
- Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
- Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
- Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).
