Abstract
Denna metod beskriver ett känsligt, specifikt, tillförlitlig och reproducerbar omvänd fas HPLC (RP-HPLC) analys utvecklats och validerats för kvantifiering av extracellulära purinnukleotider och nukleosider som produceras av renat kronisk lymfatisk leukemi (KLL) celler under olika odlingsbetingelser . Den kromatografiska separationen av adenosin-5'-monofosfat (AMP), adenosin (ADO) och inosin (INO) utförs vid RT på en kiseldioxid-baserad, kolonn med omvänd fas som används för polär förening retention. Metoden innefattar en binär rörlig fas, som består av 7 mM ammoniumacetat och acetonitril med en flödeshastighet av 1,00 ml / min. Eluaten övervakas med användning av en fotodiodsystem UV-detektor inställd på 260 nm. En standardkalibreringskurva genereras för att beräkna ekvationen för den analytiska kvantifiering av varje purinföreningen. Systemstyrning, datainsamling och analys utförs därefter. Tillämpa detta protokoll, AMP, INO och ADO elueras vid 7, 11 och 11,9 minuter, respektive, och den totala körtiden för varje prov är 20 minuter. Detta protokoll kan tillämpas på olika celltyper och cellinjer (både fjädring och vidhäftande), med hjälp av odlingsmedier som matris. Fördelarna är enkel och snabb provberedning och kravet på en liten mängd vätska kan användas för analys. Vidare har användningen av ett serumfritt medium medger att hoppa över proteinfällningssteget med acetonitril som påverkar den slutliga koncentrationen av purinföreningar. En av begränsningarna hos metoden är kravet på jämvikts kolonn köras före varje enstaka prov kör, vilket gör den totala körtiden av experimentet längre och förhindra hög kapacitet applikationer.
Introduction
Adenosin (ADO) är ett purin nukleosid med en adenin molekyl kopplad till en ribos sockermolekyl enheten via en glykosidbindning. När de är närvarande i den extracellulära miljön, det skyddar cellerna från överdriven skada genom verkan av immunsystemet. Denna roll har markerats med olika sjukdomsmodeller, såsom kolit 1 diabetes 2, astma 3, sepsis 4, och ischemisk skada 5. En av de viktigaste ADO funktionerna är hämningen av immunsvar hos tumörmikroomgivningen, vilket bidrar till tumörimmunundandragande 6. Av denna anledning, de mekanismer som är involverade i ADO bildning och signalering är av stort terapeutiskt intresse 7.
ADO nivåer i vävnadsmikro är relativt låga under normala fysiologiska förhållanden och säkert under tröskelvärdet av immunceller. Dock under hypoxi, ischemi, inflammation, infektion, metaboliskstress och tumör transformation de snabbt öka 8. De förhöjda extracellulära ADO nivåer som svar på vävnads störande signaler har en dubbel funktion: att rapportera vävnadsskador i en autokrin och parakrin sätt och att generera vävnadssvar som kan generellt ses som cellskyddande.
Extracellulär ADO kan bildas genom olika mekanismer, som omfattar frigivning från intracellulära fack förmedlade av nukleosid transportörer 9 eller ackumulering på grund av försämrad nedbrytning drivs av adenosindeaminas. Den huvudsakliga väg som leder till ökade extracellulära ADO nivåer innebär verkan av en kaskad av ectonucleotidases, som är membranassocierade ectoenzymes genererar ADO genom phosphohydrolysis nukleotider som frigörs från döda eller döende celler. Denna väg går till genom den sekventiella verkan av CD39 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase-1) som omvandlar extracellulär adenosin-5'-trifosfat (ATP) eller adenosin-5'-difosfat (ADP) till adenosin-5'-monofosfat (AMP) och CD73 (5'-nukleotidas), som omvandlar AMP till ADO 10.
Extracellulär ADO framkallar sina fysiologiska reaktioner genom att binda till fyra trans ADO receptorer, nämligen A1, A2A, A2B och A3. Varje receptor har olika affinitet för ADO och specifik vävnadsfördelning. Alla receptorer har sju transmembrandomäner och är G-proteinkopplad till intracellulära GTP-bindande proteiner (G-proteiner), som kan inducera (Gs-protein) eller hämma (Gi-protein) adenylatcyklasaktivitet och därefter framställning av intracellulärt cAMP. Därför förändringar i cytoplasma cAMP-nivåer påverkar intracellulära proteinkinas aktivitet under fysiologiska reaktioner 11. Under fysiologiska förhållanden extracellulärt ADO ligger under 1 um, som kan aktivera åtskillnad A1, A2A och A3-receptorer. Emellertid aktiveringen av A2B subtyp kräver betydligt högrekoncentrationer av nukleosid, såsom de som genereras i patofysiologiska tillstånd. Alternativt kan extracellulär ADO brytas ned till inosin (INO) av adenosindeaminas (ADA) och CD26, en ADA komplexprotein lokaliserande ADA på cellytan. En annan möjlighet är att ADO internaliseras av cellen genom de ekvilibrativ nukleosid transportörer (ENT) och fosforylerat till AMP från ADO kinasprotein 12,13.
Syftet med detta protokoll är att beskriva en analysmetod av omvänd fas HPLC (RP-HPLC) för att kvantifiera i en enda körning substrat AMP och produkter ADO och INO, som genereras av humana lymfocyter. Vår erfarenhet ursprungligen erhölls med användning av celler från kronisk lymfatisk leukemi (KLL) patienter, som kännetecknas av utbyggnaden av en mogen population av CD19 + / CD5 + B-lymfocyter konstitutivt uttrycker CD39 14,15. Vi visade cirka 30%av KLL patienter uttrycker CD73 ectoenzyme och att denna fenotyp korrelerar med en dålig prognos 16. Denna subpopulation av leukemiceller co-uttrycker CD39 och CD73 kan aktivt producera extracellulärt ADO från ADP och / eller AMP. Preinkubation av CD73 + CLL-celler med α, β-metylen-ADP (APCP), en känd inhibitor av CD73 enzymatisk aktivitet, fullständigt blockerar extracellulärt ADO-syntes som bekräftar att CD73 representerar buteljhalsen enzym i nämnda kaskad 16.
CLL-celler uttrycker också ADA och ADA komplex proteinet CD26, som ansvarar för omvandlingen av ADO i INO. Genom att använda särskilda ADA-inhibitorer, såsom erytro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) Jag wiadenine (EHNa) hydroklorid och deoxikoformycin (DCF), är det möjligt att blockera extracellulärt ADO nedbrytning i INO. Vidare förbehandling med en ADA-inhibitor i kombination med dipyridamol, som blockerar nukleosid transportörer, förstärker ADO ackumulering i cellensupernatanter.
Vi har sedan utvidgats detta protokoll till celler som härrör från andra linjer, inklusive T-lymfocyter och myeloidceller, bekräftar CD73-beroende ADO produktion. Dessa fynd tyder på att denna HPLC-protokollet är mycket mångsidig och att den kan tillämpas på olika cellinjer och olika odlingsbetingelser (Figur 1).
Figur 1. Schematisk representation av enzymatiska maskineri som ansvarar för extracellulär ADO produktion. Adenosin 5'-trifosfat (ATP) och / eller adenosin-5'-difosfat (ADP) kan brytas ned genom CD39 till adenosin-5'-monofosfat (AMP), som i sin tur omvandlas av CD73 till nukleosiden adenosin (ADO). När ADO produceras i det extracellulära utrymmet, kan den inträda i cellen genom de nukleosid-transportörer (ENT), omvandlas till inosin (INO) ellerbinda till olika typer av P1 ADO receptorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
KLL blodprov erhålls i enlighet med institutionens riktlinjer och Helsingforsdeklarationen.
1. Isolering av leukemi lymfocyter från blodprover från CLL patienter
- Samla blodprov i natriumheparin (grön-top) rör 17.
- Göra en: 3 utspädning av helblod med RT 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Rena perifera mononukleära blodceller (PBMC) från blodprover genom densitetsgradientcentrifugering.
- Underlag 5 ml densitetscentrifugering medier (t.ex., Ficoll) i ett 15 ml centrifugrör och noggrant överföra 10 ml utspätt blod. centrifugera omedelbart vid 1500 xg under 20 min vid RT.
- Aspirera en del av den överstående lösningen med ett glas pasteurpipett förbunden med en vakuumpump och samla PBMC ring vid interfas mellan densitetscentrifugering media och utspädd plasma med en 5 ml pipett. Överför till en 50 ml centrifugrör och tvätta med PBS (50 ml slutlig volym). Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten med ett glas pasteurpipett, resuspendera pelleten i 50 ml PBS och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Stain PBMCs med anti-CD19 och -CD5 antikroppar för flödescytometri efter ett standardprotokoll för immunfärgning och kontrollera om PBMC subpopulation komposition 18.
Obs: CLL lymfocyter är CD19 + / CD5 +. - Kontrollera% av CD19 + / CD5 + celler med hjälp av en flödescytometer 18. Rena B-lymfocyter från patienter med ≥95% av CD19 + / CD5 + leukemiceller efter instruktionerna i steg 2 för den negativa isolering av B-celler 19.
2. Rening av leukemi B-celler genom negativ Isolering
- Resuspendera 10 7 PBMCs / ml i PBS 0,1% bovint serumalbumin (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (isoleringsbuffert).
- tillsätt 101; g av mus monoklonal anti-CD3, -CD14 och -CD16 primära antikroppar i 10 7-celler och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med isoleringsbuffert och centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i isoleringsbuffert vid 10 7 PBMCs / ml.
- Före inkubering med cellerna, resuspendera får-anti-mus-IgG-magnetiska pärlor i flaskan. Överför 100 | il pärlor per 10 7-celler till ett rör.
- Tillsätt 1 ml isoleringsbuffert och placera röret i en magnethållare under 1 min. Kassera supernatanten med en 5 ml pipett.
- Ta bort röret från magneten och resuspendera de tvättade pärlorna i 100 pl isoleringsbuffert.
- Inkubera 10 7-celler med 100 | il av magnetiska pärlor för 30 min vid 4 ° C med försiktig lutning och rotation.
- Placera röret i magnethållaren under 2 minuter och överför supernatanten med CD19 + / CD5 + obundna cellertill ett nytt rör med en 5 ml pipett.
- Vid slutet av isoleringsprotokollet, färga 100 pl celler med anti-CD19 och -CD5 antikroppar för flödescytometri och inkubera 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta cellerna med 3 ml PBS 1% BSA, kassera överskottet av vätskan och kontrollera B-cell-renhet igen genom flödescytometri 19.
Obs: Genomför en ytterligare negativ isoleringssteg om B-cellrenhet är lägre än 95%.
3. Beredning av standard och hämmare Stamlösningar
- För att förbereda AMP, väg upp 0,00345 g AMP och upplösa den i 5 ml serumfritt medium för att ha en 2 mM standardlösning av AMP.
- För att förbereda ADO, väga 0,00265 g ADO och upplösa den i 5 ml serumfritt medium för att ha en 2 mM standardlösning av ADO.
- För att förbereda INO, väga 0,00268 g INO och upplösa den i 5 ml serumfritt medium för att ha en 2 mM standardlösning av INO.
- Förbered en 400 ^ M lösning av AMP, ADO ochINO genom att blanda 1 ml av den 2 mM stamlösning i 4 ml serumfritt medium (5 ml slutlig volym).
- Göra en: 4 spädning av varje 400 | iM standardlösning för erhållande av en 100 ^ M koncentration genom att pipettera 500 | il av 400 | iM lösning i 1500 | il serumfritt medium (2 ml slutlig volym).
- Förbereda seriespädningar av varje förening i serumfritt medium för att erhålla följande koncentrationer: 100 pM - 50 pM - 25 pM - 10 pM - 5 | iM - 2,5 | iM - 1 pM - 0,5 pM - 0,25 ^ M.
Obs: Till exempel, pipettera 1 ml av 100 | iM lösning i 1 ml serumfritt medium: att (1 2 utspädning) erhålla 50 ^ M koncentration och fortsätta med de kvarvarande spädningar.
- Förbered en 10 mM stamlösning av APCP upplöst i PBS; portion och lager vid - 30 ° C.
- Förbered 10 mM stamlösningar av EHNa hydroklorid, dCF och dipyridamol upplöst i dimetylsulfoxid (DMSO); portion och lager vid -30° C.
4. Programmera HPLC metod
- Bered en 7 mM ammoniumacetatbuffert genom upplösning av 0,770 g ammoniumacetat i 2 L av dubbelt avjoniserat vatten (buffert A). Justera till pH 3,0 med saltsyra.
- Förbereda en glasflaska som innehåller åtminstone två L av ultrarent acetonitril för HPLC (buffert B) och anslut skyddskolonnen och kolonnen till HPLC.
Notera: De kolumner och buffertar är vid RT under användning. - Logga in på HPLC programvara och välj "bläddra projekt". Gå till menyn "Arkiv" och välj "ny metod" och sedan "instrument metoden".
- Programmet jämviktkolonnmetoden enligt tabell 1. Ställ in en flödeshastighet av 1,00 ml / min och programmera UV-detektor för att läsa vid 260 nm. Spara instrumentmetod och välj igen "ny metod" i menyn "File" och sedan "-metoden set". Välj instrument metoden tidigare sparadeoch spara den aktuella metoden med samma namn.
| Tid | Flödeshastighet (ml / min) | %EN | % B |
| 1,00 | 100 | 0 | |
| 1,24 | 1,00 | 100 | 0 |
| 6,22 | 1,00 | 2 | 98 |
| 18,65 | 1,00 | 2 | 98 |
Tabell 1: Jämviktskolonnmetod Schematisk representation av lösningsmedels förändringar för ekvilibrering av kolonnen.. Buffert A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffert B: acetonitril.
- Upprepa steg 4,3 för att programmera run provmetod som anges i tabell 2. Ställ en flödeshastighet av 1,00 mL / min och programmet UV-detektorn för att läsa vid 260 nm. Spara instrumentmetod och upprepa samma procedur som beskrivs i steg 4,4 för att spara den metod som anges ..
| Tid | Flödeshastighet (ml / min) | %EN | % B |
| 1,00 | 0 | 100 | |
| 3,74 | 1,00 | 0 | 100 |
| 13,71 | 1,00 | 15 | 85 |
| 17,00 | 1,00 | 100 | 0 |
| 20,00 | 1,00 | 100 | 0 |
Tabell 2: Kör provmetod. Schematisk representation av lösningsmedels förändringar för HPLC-mätning av purinföreningar. buffer A: 7 mM ammoniumacetat, pH 3,0. Buffert B: acetonitril.
- Välj knappen "kör prov", välj "nytt prov som metod" i menyn "Arkiv".
- Välj "tom" och ange numret på flaskan (i autosampler), provnamn, injektionsvolym (50 ^). Välj den metod som anges sparas innan för "-metoden set" kolumn och ange den totala körtiden (min).
Obs: Skriv in jämviktskolonnmetoden (tabell 1) i "metoden set" kolumn före varje provkörning och ange den totala körtiden (min).
5. Framställning av en standard kalibreringskurva för varje förening
- Injicera 50 | il av blank (specifik serumfritt medium, som inte innehåller adenosindeaminas) och för varje standardprov efter de metoder som beskrivs i tabell 1 och tabell 2.
- Använd jämvikts kolumnenmetoden (tabell 1) innan varje prov drivet och ställa in de gradientbetingelser som beskrivits i tabell 2 för att erhålla lämplig topp separation. Se tabell 3 för rapporterade retentionstider av AMP, ADO och INO under dessa HPLC-betingelser.
| Retentionstid | λ max | |
| AMP | 8,00 min | 260 |
| INO | 11,00 min | 260 |
| VÄSEN | 11,90 min | 260 |
Tabell 3: Retentionstider av purinföreningar Typiska retentionstider observerats för AMP, ADO och INO.. UV-detektorn är programmerad att läsa vid 260 nm.
- Plotta toppytor mot den nominella koncentrationen av varje standard för att erhålla nio punkter kalibreringskurva (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 M).
- Beräkna ekvationen för en rak linje för AMP, ADO och INO: y = mx + b,
där x är iM koncentration och y motsvarar topparean.
Figur 2. Framställning av en intern standardkurva. Representativa kalibreringsstandardkurva för ADO och den relativa ekvation erhålls. Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.
6. Förbehandling med hämmare och inkubation med substratet (AMP)
- För att testa AMP konsumtion, ADO och INO generation utan hämning av CD73, ADA och nukleosid transportörer, resuspendera 2 x 10 6 CD19 + / CD5 + CLL celler (isoleras och renas i steg 1 och 2) i 250 pl serumfritt medium och platt celler i en 48-brunnsplatta (eller i en 1,5 ml mikrocentrifugrör).
- Att blockera CD73 enzymatisk aktivitet, utspädd 1: 1000 i stamlösning av APCP (10 mM) i odlingsmediet för att erhålla en 10 | iM slutkoncentration. Resuspendera 2 x 10 6 CLL-celler i 250 | il odlingsmedium innehållande APCP och förbehandla 60 min vid 37 ° C i en cellodlingsinkubator.
- Att blockera omvandlingen av ADO i INO, späd 1: 1000 stamlösningen av EHNa hydroklorid och / eller dCF (båda 10 mM) i serumfritt medium för att ha en 10 ^ M slutlig koncentration.Resuspendera 2 x 10 6 CLL celler i 250 pl odlingsmedium innehållande EHNa och / eller dCF. Inkubera i 30 min vid 37 ° C i cellkultur inkubator.
- Att blockera upptagningen av ADO genom de nukleosid-transportörer, späd 1: 1000 stamlösningen av dipyridamol (10 mM) i serumfritt medium för att ha en 10 | iM slutkoncentration. Resuspendera 2 x 10 6 CLL-celler i 250 | il odlingsmedium innehållande dipyridamol och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C i cellkultur inkubator.
- Förbered enkla lösningar av APCP, EHNa, dCF och dipyridamol utspädd 1: 1000 i 400 iM AMP.
- Lägg 250 ul av 400 iM AMP eller AMP plus hämmare för att erhålla en slutlig koncentration av 200 iM AMP. Innehålla villkoret i frånvaro av substratet som skall användas som blankprov.
- Inkubera från 30 till 60 minuter vid 37 ° C.
Obs: Den optimala koncentrationen av AMP och inkuberingstiden var experimentellt. - vid than slutet av inkubationstiden, samla 500 ul av supernatanterna i kalla mikrocentrifugrör (på is) och centrifugera omedelbart vid 17.000 xg vid 4 ° C under 5 min.
- Överför supernatanterna i nya 1,5 ml mikrocentrifugrör och omedelbart lagra vid -80 ° C eller fortsätta att provberedning för HPLC körs.
7. Prov Förberedelse för HPLC
- Filtrera supernatanterna i nya 1,5 ml mikrocentrifugrör med 0,2 um sprutfilter. Använd 1 ml sprutor för filtrering.
- Om HPLC-systemet är försett med en automatisk provtagare, förbereda de glasflaskor för HPLC och använda 0,1 ml mikroinläggen för små volymer av prov.
- Överföring på minst 100 ul av provet i glasflaska med en mikropipett eller ett glas pasteurpipett. Var noga med att överföra utan bubblor och stänga flaskan med skruvlocket.
- Prover är nu redo för analys med RP-HPLC.
8. HPLC Measurements av puriner
- Välj knappen "kör prov"; välj "nytt prov som metod" i menyn "Arkiv".
- Välj "tom" och ange: antalet flaskan (i autosampler), provnamn, injektionsvolym (50 ^).
- Välj jämviktkolonnmetod och körningen provmetod som beskrivs i Tabell 1 och Tabell 2, respektive, för alla nollprovet och körningar som följer.
Obs: Ställ in jämviktskolonnmetoden (tabell 1) före varje provkörning. - Injicera 50 pl tomt (serumfritt medium) och av varje prov.
- Bestäm koncentrationen av puriner i varje prov, kvantifiera AMP, ADO och INO genom att erhålla toppområdena vid retentionstiderna som beskrivs i tabell 3.
- Välj "process" -knappen och nästa alternativet "integrera". Alternativt väljer manuellt starta ennd ändpunkter varje enskild topp för att få mätområdet. Detta görs genom att spåra en linje mellan start- och slutpunkterna för den topp.
- Bestämma iM koncentration tillämpa ekvationen erhölls för standardkurvan: y = mx + b, där x representerar den koncentration pM och y är arean av toppen mätt från det okända provet.
Notera: Ett exempel på ADO kalibreringsstandardkurvan redovisas i figur 2, där: x = (y område - 981,02) / 40026
- Med tanke på att 2 x 10 6 celler återsuspenderades i 0,500 ml medium, beräkna xmol AMP, ADO och INO konsumeras och / eller produceras av 10 6 CLL celler tillämpar följande andel:
xmol: 1,000 ml = x ^ mol: 0,250 ml
Obs: De fimol i 1000 ml (antal jimol i ett L) är ekvivalent med koncentrationen iM och x är xmol nucleotide eller nukleosid som produceras av 10 6 celler.- Slutligen, konvertera mikromol i nmol konsumeras och / eller produceras av 10 6 CLL celler:
nmol = umol x 1000
- Slutligen, konvertera mikromol i nmol konsumeras och / eller produceras av 10 6 CLL celler:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera den procentuella (%) av leukemiska celler i färsk renade PBMC från en representativ CLL patient ska celler märkta med anti-CD19 och anti-CD5-antikroppar. Den vänstra panelen i figur 3 representerar en cytofluorimetric punktdiagram med en selektiv grind på levande celler. Figur 3 visar ett exempel på PBMC från en CLL patient före (mitten panel) och efter (höger panel) B-cellsrening.
Ett exempel på HPLC kvantifiering av purinföreningar i CD73 + CLL-celler är representerad i figur 4A. De olika retentionstider av AMP, INO och ADO vid 260 nm medger samtidig kvantifiering av föreningarna. När analysen körs på rätt sätt, alla nukleotider och nukleosider har en lämplig topp separation. Med början från en koncentration av 200 | iM AMP som substrat, topparna som erhölls för ADO och INO är klartsynliga och koncentrationerna är i området av standardkalibreringskurvan. Emellertid kommer med användning även lägre koncentrationer av substratet (t.ex., 100 ^ M) ger goda resultat. Efter toppintegrering, är de områden av varje topp omvandlas till iM koncentration och slutligen i nmol förening som produceras av 10 6 CLL lymfocyter genom användning av standardkurvor.
HPLC-kromatogrammet av ADO produceras av CD73 + celler efter 60 min av förbehandling med 10 | iM APCP indikerar en fullständig blockering av extracellulär ADO-syntes (Figur 4A). Grund av den snabba enzymatiska omvandlingen av ADO in INO drivs av ADA / CD26-komplexet, är förbehandling av CLL-celler med 10 | iM EHNa hydroklorid eller 10 pM dCF krävs för att inhibera ADA nedbrytning. Under dessa förhållanden extracellulära ADO koncentrationer avsevärt. Representativa kromatogram av Figur 4 belyser hur förbehandling med EHNa hydroklorid och / eller dCF (Figur 4B - C) hämmar fullständigt ADO omvandling till INO.
Figur 3. Cytofluorimetric analys av% av CD19 + / CD5 + leukemiceller i färskt renade PBMC av ett representativt KLL patient. Efter gating på levande celler (till vänster), utvärderas den% av CD19 + / CD5 + CLL celler. Innan negativa isolering av B-celler (mitten panel) motsvarar% av leukemiceller till 75%. Efter rening (högra panelen) den% av CLL B-lymfocyter når 95%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av extracellulära purinnukleotider och nukleosider förbrukats och producerats av leukemiceller efter exponering för AMP och olika inhibitorer. (A) Representativa kromatogram av ADO och INO genereras av CD73 + leukemiska lymfocyter med eller utan förbehandling med α, β-metylen- ADP (APCP, 10 ^ M, 60 min), en specifik hämmare av CD73 enzymatisk aktivitet. (B) Representativa HPLC-kromatogram som erhållits från supernatanter av CD73 + CLL-celler förbehandlade eller ej med adenosindeaminas (ADA) -inhibitor erytro-9- (2-hydroxi-3-nonyl) adenin (EHNa) hydroklorid (10 | iM, 30 min) före inkubation med AMP som substrat (200 | iM, 30 min). (C) representant kromatogram som erhållits från supernatanter av CD73
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här medger att utvärdera aktiviteten av CD39 / CD73 adenosinergic maskiner i cellkulturmedia från renade humana leukemiceller. Genom denna HPLC-metoden kan vi följa och kvantitativt mäta den enzymatiska generationen ADO (CD73-beroende) och dess efterföljande nedbrytning till INO (CD26 / ADA beroende). Användningen av enzymhämmare gör det möjligt att styra protokollet och att ha interna kontroller. Fördelarna och nyheterna i detta protokoll är att i) den kan tillämpas på celler som växer i kultur, att ii) det kräver en liten mängd odlingsmedia och att iii) provberedningen är extremt lätt.
Vårt system består av en separationsmodul utrustad med en kvaternär lågtrycksblandningspump och inline vakuumavgasning tillsammans med en autosampler. Den kromatografiska separationen av AMP, ADO och INO uppnås på en kiseldioxid-baserad, kolonn med omvänd fas som används för polär förening retention. the binära mobilsystem fasen består av en buffert A (7 mM ammoniumacetat i dubbelt avjoniserat vatten, pH 3,0 justerat med saltsyra) och buffert B (acetonitril).
Denna HPLC-metoden är känslig, pålitlig och reproducerbar och kan tillämpas på olika cellodlingsmodeller, både adherenta och suspensionsceller. Det skulle kunna tillämpas också för att jämföra olika odlingsbetingelser, såsom normoxi (21% av O 2) och hypoxi (1-3% O2), eller för att jämföra olika aktiveringstillstånd av celler. Här utför vi behandling av celler med purinföreningar i cellodlingsplattor, men kan vara också används mikrocentrifugrör för korta tids behandlingar.
Den metod som beskrivs här gör det möjligt för kvantifiering av extracellulära purinnukleotider och nukleosider konsumeras och produceras i reaktionen att undvika användningen av radiomärkta föreningar, såsom de som användes i den tunnskiktskromatografi (TLC) -analyser 10. Dessutom HPLC-systemet är också mer känsliga och selektiva jämfört med TLC-metoden. Emellertid är en RP-HPLC-system med tandem masspektrometrisk (MS / MS) detektion nu anses vara det bästa valet för kvantitativa mätningar av nukleotider och nukleosider. En begränsning av denna HPLC-metoden är kravet på en jämviktskolonn köra innan varje enskilt prov körning, vilket gör den totala körtiden för experimentet längre och betydligt begränsa möjligheterna till hög genomströmning visningar. Snabbare alternativa metoder representeras av malakitgrönt fosfatanalys, en kolorimetrisk metod som tillåter den indirekta mätningen av AMP omvandling till ADO, och bythe luciferas-baserad metod 20. Emellertid inte båda dessa metoder erbjuder inte en direkt mätning av adenosin.
Provet bearbetning för denna analys är minimal och proteinutfällning med acetonitril inte krävs, eftersom protokollet är baserat på användning av ett serumfritt medium. Ett alternativtill serumfritt medium kan vara att återsuspendera cellerna i PBS 5 mM glukos före inkubering med substratet.
Huvud kritiskt steg inom protokollet är att erhålla en ren population av B-celler. I själva verket kan mätningarna av AMP, ADO och INO vara falskt på grund av närvaron av andra cellpopulationer som uttrycker de ectoenzymes involverade i denna kaskad (t.ex., T-lymfocyter). En andra kritisk punkt är att injicera filtrerad odlingsmedier i HPLC-systemet utan någon förorening cell som kan påverka integriteten och livet av kolonnen.
Sammanfattningsvis är denna analys relativt snabbt och mycket tillförlitliga, vilket möjliggör realtidsövervakning av nukleotid konsumtion och nukleosid generationen i olika cellpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M.
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M.
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
