Abstract
Deze methode beschrijft een gevoelige, specifieke, betrouwbare en reproduceerbare omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) assay ontwikkeld en gevalideerd voor de kwantificering van extracellulaire purine nucleotiden en nucleosiden door gezuiverde chronische lymfocytische leukemie (CLL) cellen onder verschillende kweekomstandigheden . De chromatografische scheiding van adenosine 5'-monofosfaat (AMP), adenosine (ADO) en inosine (INO) wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur op silicabasis, omgekeerde fasekolom die wordt gebruikt voor polaire verbinding vasthouden. De werkwijze omvat een binaire mobiele fase, bestaande uit 7 mM ammoniumacetaat en acetonitril met een stroomsnelheid van 1,00 ml / min. De eluaten worden geanalyseerd met een fotodiode array UV detector ingesteld op 260 nm. Een standaard kalibratiekromme wordt gegenereerd om de vergelijking te berekenen voor de analytische kwantificering van elke purine- verbinding. System control, data-acquisitie en analyse worden vervolgens uitgevoerd. Het toepassen van dit protocol, AMP, INO en ADO elueren op 7, 11 en 11,9 min, respectievelijk, en de totale looptijd voor elk monster is 20 min. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende soorten cellen en cellijnen (zowel hechtende en suspensie), gebruikt als kweekmedia matrix. De voordelen zijn gemakkelijk en snel monstervoorbereiding en de eis van een geringe hoeveelheid supernatant voor analyse. Bovendien is het gebruik van een serumvrij medium laat overslaan van de eiwitten neerslaan met acetonitril dat invloed op de uiteindelijke concentratie van purineverbindingen. Een van de beperkingen van de methode is de eis van de verevening kolom lopen voor elke één monster run, waardoor de totale looptijd van het experiment langer en het voorkomen van high throughput screening toepassingen.
Introduction
Adenosine (ADO) is een purine nucleoside met een adenine molecule via een glycosidische binding gehecht aan een ribose suiker molecuul groep. Wanneer aanwezig in het extracellulaire milieu beschermt de cellen tegen overmatige beschadiging door de werking van het immuunsysteem. Deze rol is aangegeven door middel van verschillende ziektemodellen, zoals colitis 1, 2 diabetes, astma 3, 4 sepsis en ischemisch letsel 5. Een van de belangrijkste functies ADO de remming van immuunresponsen bij de tumor micro bijdragen aan tumor immune evasion 6. Daarom zijn de bij ADO vorming en signalering mechanismen van aanzienlijk therapeutisch belang 7.
ADO niveaus in het weefsel micro relatief laag onder normale fysiologische omstandigheden en zeker onder de drempel van immuuncellen. Echter, tijdens hypoxie, ischemie, ontsteking, infectie, metabolestress en tumor transformatie ze snel toenemen 8. De verhoogde ADO extracellulaire niveaus als reactie op weefsel storende signalen een dubbele functie: weefselschade melden op een autocriene en paracriene manier en weefselreacties die in het algemeen kan worden beschouwd als cytoprotectieve genereren.
Extracellulaire ADO kan worden gevormd door een verscheidenheid van mechanismen, die afgifte van intracellulaire compartimenten gemedieerd door nucleoside transporteurs 9 of accumulatie vanwege verminderde afbraak uitgevoerd door adenosine deaminase bevatten. De belangrijkste route leidend tot verhoogde extracellulaire ADO niveaus gaat de werking van een cascade van ectonucleotidases dat membraangeassocieerd ectoenzymes genereren ADO door phosphohydrolysis nucleotiden vrij van dode of stervende cellen. Deze route gaat via de opeenvolgende werking van CD39 (ectonucleoside trifosfaat diphosphohydrolase-1), die extracellulaire adenosine 5'-trifosfaat omgezet (ATP) of adenosine-5'-difosfaat (ADP) adenosine 5'-monofosfaat (AMP) en CD73 (5'-nucleotidase), die wordt omgezet AMP ADO 10.
Extracellulaire ADO lokt haar fysiologische reacties door te binden aan vier transmembraan ADO-receptoren, te weten A1, A2A, A2B en A3. Elke receptor heeft verschillende affiniteiten voor ADO en specifieke verdeling weefsel. Alle receptoren hebben zeven transmembraandomeinen en zijn G-proteïne gekoppelde intracellulaire GTP-bindende eiwitten (G-eiwitten), die kan induceren (Gs eiwit) of remmen (Gi-eiwit) adenylaatcyclase-activiteit en vervolgens de productie van intracellulair cAMP. Daarom veranderingen in cytoplasmatische cAMP effect op intracellulair proteïne kinase activiteit tijdens fysiologische reacties 11. Onder fysiologische omstandigheden extracellulaire ADO is dan 1 uM, die zonder onderscheid A1, A2A en A3 receptoren activeert. De activering van A2B subtype vereist aanzienlijk hogereconcentraties van het nucleoside, bijvoorbeeld ontstaan onder pathofysiologische omstandigheden. Alternatief kan extracellulaire ADO worden afgebroken tot inosine (INO) van adenosine deaminase (ADA) en CD26, een ADA complexerende eiwit lokaliseren ADA op het celoppervlak. Een andere mogelijkheid is dat ADO wordt geïnternaliseerd door de cel door de equilibrerende nucleoside transporters (KNO) en gefosforyleerd aan AMP door ADO kinase eiwit 12,13.
Het doel van dit protocol is een analytische werkwijze voor omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) beschrijven kwantificeren in een enkele run het substraat AMP en de producten ADO en INO, zoals gegenereerd door menselijke lymfocyten. Onze ervaring was oorspronkelijk verkregen met cellen van chronische lymfocytische leukemie (CLL) patiënten, die worden gekenmerkt door de expansie van een volwassen populatie van CD19 + / CD5 + B-lymfocyten constitutief CD39 14,15. We toonden ongeveer 30%van CLL drukken de CD73 ecto-enzym en dat dit fenotype correleert met een slechte prognose 16. Deze subpopulatie van leukemische cellen co-expressie CD39 en CD73 kunnen actief produceren extracellulaire ADO van ADP en / of AMP. Voorincubatie van CD73 + CLL cellen met α, β-methyleen-ADP (APCP), een bekende remmer van CD73 enzymatische activiteit blokkeert volledig extracellulaire ADO synthese bevestigd dat CD73 vertegenwoordigt het knelpunt enzym van deze cascade 16.
CLL cellen ook de expliciete ADA en het ADA complexerende eiwit CD26, die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van ADO in INO zijn. ADA door specifieke remmers, zoals erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNa) hydrochloride en deoxycoformycine (dCF), is het mogelijk om ADO extracellulaire afbraak blok in INO. Bovendien voorbehandeling met een ADA-remmer in combinatie met dipyridamol, blokkeert nucleoside transporteurs, verbetert ADO accumulatie in celsupernatanten.
We hebben vervolgens uitgebreid dit protocol om cellen afkomstig van andere geslachten, waaronder T-lymfocyten en myeloïde cellen bevestigt CD73-afhankelijke ADO productie. Deze bevindingen suggereren dat dit HPLC protocol is zeer veelzijdig en kan worden toegepast op verschillende cellijnen en verschillende kweekomstandigheden (figuur 1).
Figuur 1. Schematische weergave van de enzymatische machinerie belast extracellulaire ADO productie. Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) en / of adenosine 5'-difosfaat (ADP) kan worden afgebroken door CD39 adenosine 5'-monofosfaat (AMP), die op zijn beurt wordt omgezet door CD73 in de nucleoside adenosine (ADO). Zodra ADO wordt in de extracellulaire ruimte, kan de cel door de nucleoside transporteurs (ENT) opnieuw in te voeren, worden omgezet in inosine (INO) ofbinden aan verschillende types van P1 ADO receptoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
CLL bloedmonsters worden verkregen in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en de Verklaring van Helsinki.
1. Isolatie van leukemische lymfocyten uit bloedmonsters van CLL
- Verzamel bloedmonster in natrium heparine (groen-top) tube 17.
- Maak 1: 3 verdunning van volbloed met RT 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Zuiver perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit bloedmonsters door dichtheidsgradiënt centrifugatie.
- Onderlaag 5 ml dichtheidscentrifugatie media (bijvoorbeeld Ficoll) in een 15 ml centrifugebuis en zorgvuldig overdracht 10 ml verdund bloed. Onmiddellijk centrifuge bij 1500 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspiraat deel van het supernatant met een glazen Pasteur pipet verbonden met een vacuümpomp en verzamel de PBMC ring aan de interfase tussen dichtheidscentrifugatie media en verdund plasma met een 5 ml pipet. Over te dragen aan een 50 ml centrifugebuis en wassen met PBS (50 ml eindvolume). Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig het supernatant met een glazen Pasteur pipet, resuspendeer de pellet in 50 ml PBS en tel de cellen met een hemocytometer.
- Vlek PBMCs met anti-CD19 en -CD5 antilichamen voor flowcytometrie volgens een standaardprotocol voor immunokleuring en controleer PBMC subpopulatie compositie 18.
Opmerking: CLL lymfocyten CD19 + / CD5 +. - Controleer het% CD19 + / CD5 + cellen met een flow cytometer 18. Zuiver B-lymfocyten van patiënten met ≥95% CD19 + / CD5 + leukemische cellen te instructies in stap 2 de negatieve isoleren van B-cellen 19.
2. Zuivering van leukemische B cellen door Negative Isolation
- Resuspendeer 10 7 PBMC / ml in PBS 0,1% runderserumalbumine (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (buffer isolatie).
- Voeg 101, g muizen monoklonaal anti-CD3, -CD14 en -CD16 primaire antilichamen gedurende 10 7 cellen en incubeer 30 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen met de isolatie buffer en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in de isolatie buffer bij 10 7 PBMC's / ml.
- Vóór incuberen met de cellen, resuspenderen schaap anti-muis IgG magnetische kralen in de flacon. Transfer 100 pl parels per 10 7 cellen met een buis.
- Voeg 1 ml isolatiebuffer en plaatst de buis in een magneethouder gedurende 1 min. Verwijder het supernatant met een 5 ml pipet.
- Haal de buis uit de magneet en resuspendeer de gewassen parels in 100 pl isolatiebuffer.
- Incubeer 10 7 cellen met 100 ul van magnetische korrels gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig kantelen en roteren.
- Plaats de buis in de magneethouder gedurende 2 minuten en breng het supernatans met de CD19 + / CD5 + ongebonden cellennaar een nieuwe buis met een 5 ml pipet.
- Aan het einde van de isolatieprotocol, vlek 100 gl cellen met anti-CD19 en -CD5 antilichamen voor flowcytometrie en incubeer 30 min bij 4 ° C. Was de cellen met 3 ml PBS 1% BSA, gooi de overmaat supernatant en controleer B-cel puurheid door 19 flowcytometrie.
Opmerking: Voer een additionele negatieve isolatiestap indien B-cel zuiverheid hoger dan 95%.
3. Voorbereiding van Standard en Remmers Stock Solutions
- AMP bereiden, afgewogen 0,00345 g AMP en oplossen in 5 ml serum-vrij medium om een 2 mM standaardoplossing van AMP hebben.
- ADO bereiden, afgewogen 0,00265 gram ADO en oplossen in 5 ml serum-vrij medium om een 2 mM standaardoplossing van ADO hebben.
- Om INO bereiden, afgewogen 0,00268 gram INO en oplossen in 5 ml serum-vrij medium om een 2 mM standaardoplossing van INO hebben.
- Bereid een 400 uM oplossing van AMP, ADO enINO door het mengen van 1 ml van 2 mM voorraadoplossing in 4 ml serumvrij medium (5 ml eindvolume).
- Maak 1: 4 verdunning van elk 400 uM standaardoplossing om een 100 uM concentratie kopen door pipetteren 500 pi van 400 pM oplossing 1500 gl serumvrij medium (2 ml eindvolume).
- Bereid seriële verdunningen van elke verbinding in serumvrij medium met de volgende concentraties te verkrijgen: 100 pM - 50 uM - 25 pM - 10 uM - 5 pM - 2,5 uM - 1 pM - 0,5 uM - 0,25 pM.
Noot: Bijvoorbeeld, pipet 1 ml van 100 uM oplossing in 1 ml serumvrij medium (1: 2 verdunning) aan 50 uM concentratie te verkrijgen en verder met de resterende verdunningen.
- Bereid een 10 mM voorraad oplossing van APCP opgelost in PBS; hoeveelheid en voorraad bij - 30 ° C.
- Bereid 10 mM voorraad oplossingen van EHNa hydrochloride DCF en dipyridamol opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO); hoeveelheid en voorraad bij -30° C.
4. Programmeer de HPLC Methode
- Bereid een 7 mm ammoniumacetaatbuffer door het oplossen van 0,770 g ammoniumacetaat in 2 L dubbel gedeïoniseerd water (Buffer A). Op pH 3,0 met zoutzuur.
- Bereid een glazen fles met tenminste 2 liter ultrazuiver acetonitril gedurende HPLC (buffer B) en sluit de voorkolom en de kolom aan de HPLC.
Opmerking: De kolommen en buffers bij kamertemperatuur tijdens het gebruik. - Log in op de HPLC-software en selecteer de "browse project" knop. Ga naar het menu "Bestand" en kies "nieuwe methode" en vervolgens "instrument methode".
- Programmeer de werkwijze evenwicht kolom volgens tabel 1. Stel een stroomsnelheid van 1,00 ml / min en het programma van de UV detector afgelezen bij 260 nm. Sla het instrument methode en selecteer nogmaals "nieuwe methode" in het menu "file" en dan "methode set". Kies het instrument methode eerder opgeslagenen opslaan van de huidige methode set met dezelfde naam.
| Tijd | Debiet (ml / min) | %EEN | % B |
| 1.00 | 100 | 0 | |
| 1.24 | 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1.00 | 2 | 98 |
| 18.65 | 1.00 | 2 | 98 |
Tabel 1: Evenwicht kolom Werkwijze Schematische weergave oplosmiddel veranderingen voor de equilibratie van de kolom.. Buffer A: 7 mM ammoniumacetaat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Herhaal de stap 4.3 om de run monster methode aangegeven in tabel 2. programmeren Stel een debiet van 1,00 mL / min en programmeer de UV detector afgelezen bij 260 nm. Sla het instrument methode en herhaal dezelfde procedure zoals beschreven in stap 4.4 gebruiken om de methode op te slaan ..
| Tijd | Debiet (ml / min) | %EEN | % B |
| 1.00 | 0 | 100 | |
| 3.74 | 1.00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1.00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1.00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1.00 | 100 | 0 |
Tabel 2: Run sample methode. Schematische weergave van oplosmiddel veranderingen voor HPLC meting van purineverbindingen. bruingeeler A: 7 mM ammoniumacetaat, pH 3,0. Buffer B: acetonitril.
- Selecteert u de knop "run samples", kies "nieuwe sample set methode" in het menu "file".
- Selecteer de optie "leeg" en voer het nummer van de flacon (in de autosampler), de naam monster, de injectie volume (50 pi). Selecteer de methode set opgeslagen voordat voor de kolom "methode set" en voer de totale looptijd (min).
Opmerking: Voer de methode equilibratie kolom (tabel 1) in de "methode set" kolom voor elk monster run en voer de totale looptijd (min).
5. Het genereren van een standaard kalibratiecurve voor elke verbinding
- Injecteer 50 pi plano (specifiek serum-vrij medium, dat adenosine deaminase bevat) en elk standaardmonster volgens de in tabel 1 en tabel 2 beschreven werkwijzen.
- Gebruik het evenwicht kolomWerkwijze (Tabel 1) voorafgaand aan elk monster uitvoert en de in Tabel 2 beschreven gradiëntvoorwaarden adequate piek scheiding te verkrijgen. Zie Tabel 3 voor de gerapporteerde retentietijden van AMP, ADO en INO onder deze HPLC-omstandigheden.
| Retentietijd | λ max | |
| AMP | 8.00 min | 260 |
| INO | 11.00 min | 260 |
| ADO | 11.90 min | 260 |
Tabel 3: De retentietijden purineverbindingen Typische retentietijden waargenomen voor AMP, ADO en INO.. De UV-detector is geprogrammeerd afgelezen bij 260 nm.
- Zet de piekoppervlakken tegen de nominale concentratie van elke standaard de negen punten ijkcurve te bepalen (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 pM).
- Bereken de vergelijking van een rechte lijn voor AMP, ADO en INO: y = mx + b,
waarbij x de uM concentratie en y komen overeen met het piekoppervlak.
Figuur 2. Het genereren van een interne standaard curve. Vertegenwoordiger calibratie standaard curve voor ADO en de relatieve vergelijking verkregen. Klik op haare voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Voorbehandeling met de remmers en incubatie met substraat (AMP)
- AMP consumptie, ADO en INO generatie testen zonder remming van CD73, ADA en nucleoside transporteurs, resuspendeer 2 x 10 6 CD19 + / CD5 + CLL cellen (geïsoleerd en gezuiverd in stappen 1 en 2) in 250 ul serumvrij medium en plaat cellen in een 48 well plaat (of in een 1,5 ml microcentrifugebuis).
- Om CD73 enzymactiviteit blokkeren, verdund 1: 1000 van de voorraadoplossing van APCP (10 mM) in het kweekmedium tot een eindconcentratie 10 uM te verkrijgen. Resuspendeer 2 x 10 6 CLL cellen in 250 gl kweekmedium dat APCP voorbehandelen en 60 min bij 37 ° C in een celkweek incubator.
- Om de omzetting van ADO in INO blokkeren, verdunnen 1: 1000 de voorraad oplossing van EHNa hydrochloride en / of dCF (beide 10 mm) in serum-vrij medium tot een 10 uM uiteindelijke concentratie hebben.Resuspendeer 2 x 10 6 CLL-cellen in 250 pl kweekmedium dat EHNa en / of dCF. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de celkweek incubator.
- Om de opname van ADO via nucleoside transporters blokkeren, verdund 1: 1000 van de voorraadoplossing van dipyridamol (10 mM) in serumvrij medium een 10 uM uiteindelijke concentratie. Resuspendeer 2 x 10 6 CLL cellen in 250 gl kweekmedium dat dipyridamol en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de celkweek incubator.
- Bereid enkele oplossingen van APCP, EHNa DCF en dipyridamol verdund 1: 1000 in 400 pm AMP.
- Voeg 250 ul van 400 pM of AMP AMP plus remmers tot een eindconcentratie van 200 uM AMP verkrijgen. Onder voorwaarde in de afwezigheid van het substraat te gebruiken als blanco monster.
- Incubeer 30-60 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: De optimale concentratie van AMP en de incubatietijd werden experimenteel bepaald. - op thij einde van de incubatietijd, verzamelen 500 ul van de bovenstaande vloeistoffen in koud microcentrifugebuizen (op ijs) en onmiddellijk centrifugeren bij 17.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Breng de supernatanten nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuizen en onmiddellijke opslag bij -80 ° C of naar het bereiding van het monster voor HPLC uitgevoerd.
7. Monsters Voorbereiding voor HPLC
- Filter de supernatanten nieuwe 1,5 ml microcentrifuge buizen met de 0,2 pm spuitfilters. Gebruik 1 ml spuiten voor filtering.
- Als het HPLC systeem voorzien van een autosampler, bereidt de glazen flesjes voor HPLC en gebruik 0,1 ml micro-implantaten voor kleine volumes monster.
- Zet minimaal 100 gl monster in het glazen flesje met een micropipet of een glazen Pasteur pipet. Wees voorzichtig om te dragen zonder bubbels en sluit de flacon met de schroefdop.
- Monsters zijn nu klaar voor analyse door RP-HPLC.
8. HPLC measusingen van Purines
- Selecteer de knop "run samples"; kies "nieuwe sample set methode" in het menu "file".
- Selecteer de optie "leeg" en vermeld: het nummer van de flacon (in de autosampler), de steekproefnaam, het injectievolume (50 ui).
- Selecteer de methode equilibratie kolom en de run monster methode in de tabellen 1 en 2 beschreven, respectievelijk voor de blanco en monster runs die volgen.
Opmerking: Stel de methode equilibratie kolom (tabel 1) voor elk monster run. - Injecteer 50 pi plano (serumvrij medium) en elk monster.
- Het gehalte aan purines in elk monster te kwantificeren AMP, ADO en INO door het verkrijgen van de piekoppervlakken van de retentietijden in tabel 3 beschreven.
- Selecteer het "proces" knop en vervolgens de "integreren" optie. U kunt ook handmatig kiezen voor het starten van eennd eindpunten van iedere enkele piek naar het gebied meting te verkrijgen. Dit gebeurt door een lijn, tussen de begin- en eindpunten van de piek.
- Bepaal de concentratie uM toepassing van de vergelijking verkregen voor de standaardcurve: y = mx + b, waarbij x de uM concentratie en y het gebied van de piek gemeten van het onbekende monster.
Opmerking: Een voorbeeld van de ADO calibratie ijkcurve beschreven in figuur 2, waarbij: x = (y area - 981,02) / 40026
- Aangezien 2 x 10 6 cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 0,500 ml medium Bereken het umol AMP, ADO en INO verbruikt en / of door 10 6 CLL cellen toepassing van de volgende verhouding:
umol: 1000 ml = x umol: 0,250 ml
Opmerking: De umol in 1000 ml (aantal pmol in 1 L) of gelijkwaardig zijn aan de uM concentratie en X umol nucleotide of nucleoside door 10 6 cellen.- Ten slotte zet de umol in nmol verbruikt en / of geproduceerd door 10 6 CLL-cellen:
nmol = umol x 1000
- Ten slotte zet de umol in nmol verbruikt en / of geproduceerd door 10 6 CLL-cellen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het percentage (%) van de leukemische cellen in vers gezuiverde PBMC van een representatieve CLL patiënt te evalueren, worden cellen gemerkt met anti-CD19 en anti-CD5-antilichamen. Het linker paneel van figuur 3 stelt een cytofluorimetric puntenplot met een selectieve poort aan levende cellen. Figuur 3 toont een voorbeeld van PBMC van een patiënt voor CLL (middelste paneel) en na (rechter paneel) B-cel zuivering.
Een voorbeeld van HPLC kwantificatie van purineverbindingen in CD73 + CLL cellen is weergegeven in Figuur 4A. De verschillende retentietijden van AMP, INO en ADO bij 260 nm laat de gelijktijdige kwantificering van de verbindingen. Wanneer de test correct wordt uitgevoerd, alle nucleotiden en nucleosiden een adequate piek scheiding. Uitgaande van een concentratie van 200 M AMP als substraat, de verkregen voor ADO en INO pieken zijn duidelijktoegankelijk en de concentraties in het bereik van de standaard kalibratiecurve. Het gebruik ook lagere concentraties van het substraat (bijvoorbeeld 100 uM) zullen goede resultaten. Na piekintegratie, worden de gebieden van elke piek omgezet in pM concentratie en uiteindelijk in nmol verbinding die door 10 6 CLL lymfocyten door middel van standaard curves.
De HPLC chromatogram van ADO door CD73 + cellen na 60 minuten voorbehandeling met 10 uM APCP geeft een volledige blokkade van extracellulaire ADO synthese (Figuur 4A). Door de snelle enzymatische omzetting van ADO in INO die door de ADA / CD26-complex en voorbehandeling van CLL-cellen met 10 uM EHNa hydrochloride of 10 uM dCF moeten ADA afbraak te remmen. Onder deze omstandigheden extracellulaire ADO concentraties aanzienlijk worden verhoogd. Representatieve chromatogrammen van Figuur 4 benadrukt hoe voorbehandeling met EHNa hydrochloride en / of dCF (Figuur 4B - C) ADO omzetting volledig remt in INO.
Figuur 3. Cytofluorimetric analyse van het% CD19 + / CD5 + leukemische cellen in vers gezuiverde PBMC van een representatieve CLL patiënten. Na gating op levende cellen (linker paneel), wordt het% CD19 + / CD5 + CLL cellen geëvalueerd. Voor de negatieve isoleren van B-cellen (middelste paneel), het% leukemische cellen overeen met de 75%. Na zuivering (rechter paneel) het% van CLL B-lymfocyten 95% bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Kwantificering van extracellulaire purine nucleotiden en nucleosiden geconsumeerd en geproduceerd door leukemiecellen na blootstelling aan AMP en verschillende remmers. (A) Representatieve chromatogrammen van ADO en INO gegenereerd door CD73 + leukemische lymfocyten met of zonder voorbehandeling met α, β-methyleen ADP (APCP, 10 uM, 60 min), een specifieke remmer van CD73 enzymatische activiteit. (B) Representatieve HPLC chromatogram verkregen supernatanten van CD73 + CLL cellen voorbehandeld indien met de adenosine deaminase (ADA) remmer erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNa) hydrochloride (10 uM, 30 min) vóór incubatie met AMP als substraat (200 uM, 30 min). (C) Vertegenwoordiger chromatogram verkregen uit supernatanten van CD73
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol mogelijk maakt de activiteit van de CD39 / CD73 adenosinergic machines in celkweekmedia van gezuiverde humane leukemiecellen evalueren. Via deze HPLC-methode kunnen we volgen en kwantitatief meten van de enzymatische generatie van ADO (CD73-afhankelijk is) en de daaropvolgende degradatie naar INO (CD26 / ADA afhankelijk). Het gebruik van enzymremmers maakt het protocol controle en interne controles. De voordelen en nieuwigheden van dit protocol is dat i) kan worden toegepast op cellen die groeien in de cultuur, dat ii) het vereist een kleine hoeveelheid van de cultuur media en dat iii) de bereiding van de monsters is zeer eenvoudig.
Ons systeem bestaat uit een separatiemodule met een quaternair lagedruk mengpomp en inline vacuüm ontgassen samen met een autosampler. De chromatografische scheiding van AMP, ADO en INO wordt bereikt op silicabasis, omgekeerde fasekolom die wordt gebruikt voor polaire verbinding vasthouden. the binair fase-systeem mobiele bestaat uit een buffer A (7 mM ammoniumacetaat in de dubbele gedemineraliseerd water, pH 3,0 ingesteld met zoutzuur) en Buffer B (acetonitril).
Deze HPLC-werkwijze is gevoelig, betrouwbaar en reproduceerbaar en kan worden toegepast op verschillende celkweekmodellen, zowel hechtende en suspensiecellen. Het kan ook worden toegepast op verschillende kweekomstandigheden, zoals normoxia (21% O2) en hypoxie (1-3% O 2) te vergelijken of om verschillende toestanden activering van cellen te vergelijken. Hier voeren we behandeling van cellen met purineverbindingen in celkweek platen, maar kan ook gebruikt microcentrifugebuizen gedurende korte tijd behandelingen.
De hier beschreven methode maakt de kwantificering van extracellulaire purine nucleotiden en nucleosiden verbruikt en bij de reactie vermijden van het gebruik van radioactief gemerkte verbindingen zoals toegepast bij de dunnelaagchromatografie (TLC) assays 10. Bovendien, de HPLC systeem is gevoeliger en selectief ten opzichte van de TLC-methode. Echter, is een RP-HPLC systeem met tandem massaspectrometrie (MS / MS) detectie nu beschouwd als de beste keuze voor kwantitatieve metingen van nucleotiden en nucleosiden. Een beperking van deze HPLC-methode is de eis van een verevening kolom lopen voordat ieder afzonderlijk monster run, waardoor de totale looptijd van het experiment langer en aanzienlijk beperken van de mogelijkheden voor high throughput screening. Snellere alternatieve methoden worden voorgesteld door de malachietgroen Phosphate assay een colorimetrische methode die indirecte meting van AMP omzetting in ADO maakt en byThe-luciferase gebaseerde methode 20. Echter, deze beide methoden bieden geen directe meting van adenosine.
Het monster verwerking voor deze test is minimaal en eiwitprecipitatie met acetonitril is niet nodig, omdat het protocol is gebaseerd op het gebruik van een serumvrij medium. Een alternatiefde serumvrij medium kan zijn om cellen in PBS 5 mM glucose resuspendeer vóór de incubatie met het substraat.
De belangrijkste kritische stap in het protocol is een zuivere populatie van B-cellen te verkrijgen. Inderdaad, kunnen de metingen van AMP, ADO en INO vals zijn door de aanwezigheid van andere celpopulaties de expressie ectoenzymes betrokken bij deze cascade (bijvoorbeeld T-lymfocyten). Een tweede kritische punt is gefilterde kweekmedium te injecteren in het HPLC-systeem zonder cel besmetting dat de integriteit en het leven van de kolom kan beïnvloeden.
Samenvattend, deze test is relatief snel en zeer betrouwbaar, waardoor real-time monitoring van nucleotide consumptie en productie nucleoside in verschillende celpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 mm x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M.
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M.
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
