Abstract
מעקב וניתוח המשובטים יחיד ברמה השלמה-לב יכולים לקבוע התנהגות תא ובתאי לב והבחנה במהלך התפתחות של לב, ולאפשר לחקר הבסיס התאי והמולקולרי של המורפוגנזה לב נורמלית נורמלית. טכנולוגיות מתפתחות אחרונות של ניתוחים משובטים יחיד רטרוספקטיבית לעשות לחקר המורפוגנזה לב ברזולוצית תא בודד ריאלית. עם זאת, אטימות רקמות אור פיזור של הלב כעומק הדמיה הוא גדל הדמיה כולו-לב לעכב ברזולוציה תא בודד. כדי להתגבר על המכשולים הללו, מערכת סליקת מחיטה עוברת שיכול להפוך בלב מאוד שקוף לתאורה וזיהוי שניהם חייבים להיות מפותח. למרבה המזל, בשנים האחרונות, מתודולוגיות רבות למערכות סליקה כל-אורגניזם כגון CLARITY, SCA le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, מעוקב, DBE, באב ו PACT דווחו. מעבדה זו מעוניינת המנגנונים התאיים ומולקולריים של כרטיסmorphogenesis IAC. לאחרונה, הקמנו שושלת תא בודדת התחקות דרך ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-קונפטי מערכת לתאי תווית בדלילות במהלך התפתחות של לב. התאמנו מספר מתודולוגיות כולו סליקה-העובר כולל Sca le ו מעוקב (ברור, קוקטיילי הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) כדי לנקות את העובר בשילוב עם מכתים הר שלם כדי שיבוטים יחידים תמונה בתוך הלב. הלב היה צלם בהצלחה ברזולוצית תא בודדת. מצאנו כי Sca le יכול לנקות את הלב העוברי, אך לא ניתן לנקות את הלב לאחר הלידה ביעילות, תוך מעוקב יכול לנקות את הלב לאחר הלידה, אך נזקים בלב העוברית על ידי המסת רקמות. השיטות שתוארו כאן תאפשרנה המחקר של תפקוד גן ברזולוצית שיבוט אחד במהלך המורפוגנזה לב, אשר, בתורו, יכול לחשוף את הבסיס התאי ומולקולרי של מומי לב מולדים.
Introduction
המורפוגנזה לב היא אירוע רציף הדורש ארגון spatiotemporal של ארבעה סוגים שונים של ובתאים לב למגזרים ברורים של הלב, וגם דורשת רשתות רגולטוריות גנטיות מרובות לתזמר את התהליך הזה כדי ליצור את 1,2 הלב הפונקציונלי. מפרט, בידול, דפוסי לב, והתבגרות קאמרית מוסדרים 3 גורמי שעתוק קרדיוגני. מוטציה גנטית או סטיית posttranscriptional של גורמים אלה ובתאי לב יכולה לגרום גם קטלני עובריים או מומי לב מולדים (CHD) 4. המחקר של המורפוגנזה לב דורש הבנה של פרטים מבניים טמונים בשלושה ממדים (3D) ואת שושלת תא אב לב יחידה שכותרתו התחקות במהלך התפתחות לב יקדם את ההבנה של המורפוגנזה לב. מספר שיטות טומוגרפיה מבוסס סעיף ברזולוציה גבוהה פותחו הדואר האחרונים עשרות שנים מבנה האיבר תמונה 5,6; עם זאת, שיטות אלו דורשות מכשירים יקרים, מיוחדים, עבודה רבה, ועל חוסר ארגון מבני מפורט ברזולוצית תא בודדת בתוך הנפח הסופי משוחזר תמונה 7,8.
הדמית נפח 3D ברמת התא הבודדה מספקת אמצעי ללמוד התמיינות תאים ובתאים והתנהגות הסלולר in vivo 7. עם זאת, פיזור אור הרקמות נשאר המכשול העיקרי הדמית תאים ומבני 3D עמוק בתוך הלב ללא פגע. ליפידים הם מקור עיקרי של פיזור אור, והסרת שומנים ו / או התאמה של ההבדל מקדם השבירה בין שומנים בסביבותיה שלהם גישות פוטנציאל להגדלת רקמת שקיפות 8. בשנים האחרונות, מספר שיטות סליקה רקמות פותחו, המקטינים אטימות רקמות פיזור אור, כמו באב (בנזיל אלכוהול ו benzoat בנזילתערובת ה) ו- DBE (tetrahydrofuran ו dibenzylether); אבל בשיטות האלה, מרווה הקרינה נשארת בעיה 8-10. הממס מבוסס שיטות הידרופילי, כגון SeeDB (פרוקטוז / thioglycerol) ו 3DISCO (dichloromethane / dibenzylether), לשמר אותות ניאון, אבל לא להפוך כל האיבר 7,8,11 שקוף. לשם השוואה, שיטת רקמות סליקת CLARITY הופכת את האיבר שקוף, אבל זה דורש מכשיר אלקטרופורזה מיוחד כדי להסיר שומנים 8,12, כפי שעושה PACT (טכניקת בהירות פסיבית), אשר גם דורשת הידרוג'ל הטבעת 7,13. לקבלת מידע מפורט לגבי כל שיטות ניקוי הרקמות הזמינות, עיין בטבלת 1 ב ריצ'רדסון ליכטמן, et al. 7.
בשנת 2011, חאמה et al. גילה serendipitously תערובת הידרופילי 'Sca le' (אוריאה, גליצרול טריטון תערובת X-100) אשר משבש את המוח העכבר transpar העובראף אוזן גרון תוך שמירת פלורסנט אותות לחלוטין שיבוטים שכותרתו 14. זה מאפשר הדמיה של המוח ללא פגע בעומק של כמה מילימטרים ושחזור בקנה מידה גדול של אוכלוסיות נוירונים ותחזיות ברזולוציה subcellular. Susaki et al. נוספים שיפרו Sca le ידי הוספת aminoalcohols ופיתח את 'מעוקב' (ברור, קוקטיילים הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) שיטת הסליקה רקמות, שהגדילה solubilization פוספוליפידים, זמן סליקה מופחת, ואיפשר פלורסנט ססגוניות הדמיה 8. במחקר הנוכחי, מנצל את Sca le וטכניקות סליקת רקמות מעוקבות חתך אופטי 3D ברזולוציה גבוהה, שיבוטי פרט בתוך הלב במהלך cardiogenesis אותר באמצעות Rosa26Cre ERT2 15, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר. השילוב של מכתים הר השלם (WMS) השיטה שפותח בעבר 21,22 עם שיטות סליקת רקמות מותרות נוסף עבור המכתים של חלבונים אחרים שיבוטי שכותרתו לחקר התנהגותם בהקשר נפח 3D. השילוב של סליקת רקמות WMS מאפשר הבנה טובה יותר של התפקידים של גנים וחלבונים שונים במהלך התפתחות של לב, ואת האטיולוגיה של מומי לב מולדים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד התמיינות תאים ובתאים אחרות, התנהגות הסלולר, ואירועי morphogenesis האיבר במהלך פיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) Albany Medical College וביצע בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנות פתרון
הערה: 15 Rosa26Cre ERT2, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר נרכשו מסחרית cTnT-Cre 18 היה מתנה ד"ר ג'יאו באוניברסיטת אלבמה Nfatc1-Cre.. היה מתנה ד"ר בן ג'ואו בבית אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה 19. עכברים היו מורדמים משאיפת פחמן דו חמצני בתא סגור במשך 60 שניות לפחות ואחריו באמצעים פיזיים של אימות למוות על ידי פתיחת בית החזה בין שתי המדינות, עריפת ראש או נקע בצוואר הרחם.
- כן טמוקסיפן. ממיסים 10 מ"ג טמוקסיפן ב 10 מ"ל של אוי זרעי חמניותl. ברגע שזה נמס לגמרי, aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
- כן פוספט בופר (PBS). ממיסים 4 Na 2 HPO (1.41960 גרם), KH 2 PO 4 (0.24496 גרם), NaCl (8.0669 גרם) ו KCl (0.20129 גרם) ב 1 ליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל -7.4.
- הכן PBST: 0.1% פתרון Tween-20 ב PBS על ידי המסת 100 μl של Tween-20 ב 100 מ"ל של PBS.
- כן חיץ חסימה. הפוך אלבומין 3% שור (BSA) פתרון חסימת ידי המסת 3 גרם של BSA ב 100 מ"ל של PBST המכיל 0.2% Tween-20.
- כן-1 מעוקב (מגיב 1). מערבבים 25% WT אוריאה, 25% WT N, N, N ', N'-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine ו -15% WT טריטון X-100 ב DH 2 O.
- כן-2 מעוקבים (מגיב 2). מערבבים 50% WT סוכרוז, 25% WT אוריאה, 10% WT 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol ו -0.1% (v / v) טריטון X-100 ב DH 2 O.
- הכן Sca le A2: 4 אוריאה M, 10% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -7.7.
- כן B4 Sca le: 8 אוריאה ז ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -8.7.
- הכן Sca le 70: 4 אוריאה M, 70% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O.
2. טמוקסיפן אינדוקציה, בידוד העובר קיבוע
- טמוקסיפן אינדוקציה בידוד העובר
- באמצעות פרוטוקול שאושר על צינורית הזנה מעוקלת (ACUP 13-12,007), gavage עכברי R26Cre ERT2 קונפטי הנקבה (פקוק על ידי עכברי זכרי R26Cre ERT2) עם 10 מיקרוגרם / g של טמוקסיפן ביום התפתחות עוברי E7.75 33. ביום העוברי 9.5 (E9.5) או E10.5, להרדים את העכברות עם CO 2 ו נקע בצוואר הרחם.
- לאחר וידוא הריגה העכבר (ראה סעיף 1 הערה), לפתוח את חלל הבטן העכבר עם מספריים לנתח את קרן הרחם, להסיר את שכבות צינור הרחם בעזרת מספריים פינצטה, מחדשלחכור את העוברים מן 23,24 צינור הרחם.
- מעבירים את העוברים על צלחת פטרי המכילה PBS (pH 7.4). תחת המיקרוסקופ לנתח, להסיר את השכבות הלא-עובריים (סיסית, שק החלמון ואת amnion) בעזרת פינצטה.
- בעזרת פינצטה ומספריים, לאסוף את הזנב העכבר העובר נקבה דגימות עבור genotyping כפי שדווח בעבר 22. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את כל העובר אל באר צלחת 48 היטב המכיל 1 מ"ל של 1x PBS.
- תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לזהות את ה- GFP / RFP / עובר חיוב CFP באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מצלמה. קלף את קרום הלב באמצעות פינצטה לסובב את העובר בלב / בעזרת פינצטה מעוקלת כדי לקבוע את מספר שיבוטי ניאון משני צידי הלב עם מסנני GFP / RFP / CFP. שום חתכים נדרשים.
- לאחר זיהוי GFP / RFP / עובר חיוב CFP, ובמהירות לשטוף את העוברים פעמים (2 דקות כל אחד) עם PBS 1x ב הדואר 48 היטב צלחת על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר (RT). פעולה זו תסיר דם עודף.
- תקן בלב העובר / העוברי באמצעות paraformaldehyde 4% (PFA) ב RT. השעה קיבעון תלוי בגודל גיל רקמה עוברית. לקבלת E9.5 לתקן את העובר עבור שעה 2 ב RT. עובר בשלב העוברי מאוחר דורש זמן קיבעון יותר, אשר יכול גם להיות ממושך עד 24 שעות עבור לב לאחר לידה.
זהירות: Paraformaldehyde רעיל, להימנע ממגע עם עור, עיני קרום רירי. - לאחר קיבוע, לשטוף את העובר / לב ב -48 ההצלחה היטב פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS 1x על שייקר צלחת ב RT. פעולה זו מסירה את PFA עודף מעובר / הלב. עובר אז הם עיבוד נוסף עבור מכתים הר שלם וסליקת רקמות.
3. הר שלם מכתים
הערה: לאחר קיבוע PFA העובר / הלב נתונה הר שלם מכתים כדלקמן.
- Permeabilize העובר / הלב בצלחת היטב 48 באמצעות 1 מ 'l של PBST 0.1% עבור 2 שעות על שייקר צלחת ב RT.
- בעקבות permeabilization, לטבול את העובר / לב ב 1 מ"ל של חיץ חסימת עבור 2 שעות או למשך הלילה על שייקר צלחת ב 4 ºC.
- לטבול את העובר / הלב אל PECAM נוגדנים ספציפיים תא האנדותל (CD31), מדולל (1: 100) ב 0.3 מ"ל חסימת חיץ במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את העובר / הלב באמצעות PBST 5 פעמים, 30 דקות כל אחד ב RT על שייקר צלחת. פעולה זו מסירה את הנוגדן הראשוני כבול הלא ספציפית עודף מן הרקמה.
- לטבול את העובר / לב אלקסה פלואוריד 647 נוגדנים משני אנטי עכברוש עיזים, מדולל (1: 1,000) ב 1 מ"ל חיץ חסימת במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס.
- חזור על שלב 3.4 לשטוף את הנוגדנים משני.
- פוסט לתקן את העובר / הלב עם 4% PFA עבור שעה 1 ב RT על שייקר צלחת ולשטוף פעמיים עם דק PBS 5 כל אחד.
- הכתם העובר / לב עם גרעיני כתם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (מדולל PBST בכל concentמנה של 0.01 מ"ג / מ"ל) במשך 10 דקות על שייקר צלחת ב RT. עקוב עם שני שוטף PBS 5 דקות כל אחד.
4. עובר / ניקוי לב עם Sca l e או שיטה מעוקבת
הערה: לאחר מכתים הר שלם, העובר / לב נתונה גם את Sca le או שיטת סליקת רקמות מעוקבת. בחירת השיטה תלוי בגודל הרקמה וגיל עוברי. עבור E11.5 או קודם לכן עוברים גיל, שימוש Sca שיטת הסליקה l e רקמות, בעוד עוברי מבוגרים או לבבות לאחר הלידה שיטת הסליקה רקמות מעוקב הוא העדיף.
- רקמות סולם שיטת הסליקה
- דגירה העובר / לב עם 1 מ"ל של תמיסת A2 דואר Sca l בבקבוקון נצנץ (עטוף בנייר כסף) עם רעד עדין מדי פעם (ביד) במשך 48 שעות ב 4 ° C..
- לאחר Sca הדגירה l e A2, דגירה העובר / לב עם 1 מ"ל של תמיסת B4 דואר Sca l ב 4 ° C באותו בקבוקון עם רעד עדין מדי פעם עבור anot48 השעות שלה.
- דגירה העובר / הלב במשך 48 אחר שעה עם e 1 מ"ל Sca l 70 ב 4 ° C עם רעד עדין מדי פעם. העובר הר באמצעות גליצרול 90% (ראה סעיף 5.1).
- רקמות מעוקב שיטת הסליקה
- לסליקה מעוקב עובר / בלב שלם, לטבול כל עובר / לב ב 1 מיליליטר של מעוקב-1 עם רעד עדין מדי פעם במשך 48 שעות ב 37 ºC 7. לאחר 48 שעות, להחליף את פתרון עם נפח זהה של מגיב מעוקב טרי 1, ו דגירה המדגם עבור 48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד מדי פעם עם היד.
- לשטוף את העובר בלב / מטופלים מעוקב-1 עם זמני 1x PBS כמה בטמפרטורת החדר עם רעד עדין עם היד. פעולה זו מסירה את הפתרון מעוקב-1 עודף.
- לאחר השטיפה החוצה מעוקב-1 עם PBS, לטבול את העוברים / לבבות בתמיסה מעוקבת-2 (1 גרם לכל עובר / לב) למשך 48 שעות ב 37 ºC עם רעד עדין מדי פעם עם יד. זאת בעקבות עובר / לב גובר באמצעות גליצרול (ראה סעיף 5.2).
שמה והדמיה לדוגמא 5.
הערה: עוברים או איברים שנסלקו Sca l e 70 או מעוקב-2 פתרון ניתן הדמיה ישירות עם סולם 70 ו מעוקב-2 פתרון כמדיום הדמיה, בהתאמה. עם זאת, בהתחשב בפגיעות של דגימות עובריות ריאגנטים סליקה, אם הדגימות הן לא להיות צלמו מייד, אבל מאוחסנות לטווח ארוך, לאחסן דגימות גליצרול 90% בעקבות הפרוטוקול להלן.
- ישירות לטבול את Sca le פינה מדגם ב 1 מ"ל של גליצרול ולאחסן 90% ב 4 ° C עד הדמיה.
- לשטוף את המדגם מעוקב שטופלו 1x PBS פעמיים, 5 דקות כל אחד ברצף דגירה המדגם עם 1 מ"ל של 30%, 50%, 70% ו פתרון גליצרול 90% כל אחת למשך 30 דקות.
- עבור הדמיה, להעביר את המדגם כדי צלחת תחתית זכוכית פטרי עם כמות מינימלית של שיבוטים גליצרול ותמונה 90% עם מיקרוסקופ confocal מצויד בשתי יכולות פוטון.
- תמונה בלב או העובר גליצרול עם 10X / 0.3 NA, טבילה 25x / 0.8 NA, או עדשה אובייקטיבי מתקנת מים 40X / 1.2 NA. תמונה DAPI באמצעות עירור 2-פוטון מתוך טיטניום קוהרנטית: לייזר זיקית ספיר. הבחירה של המיקרוסקופ עדשה אובייקטיבית תהיה תלויה לצורך הניסויים, למשל עבור סופר-רזולוציה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליון יכול להיות מנוצל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה בלב העוברי הפינה
היווצרות לב החולייתנים היא תהליך morphogenic מוסדר spatiotemporally ותלוי הארגון וההבחנה של ובתאים מארבעה מקורות שונים 1. תאים משדה הלב הראשון של סהר הלב יתקפלו לכיוון קו אמצע הגחון כדי ליצור צינור לב ליניארי. התאים משדה הלב השני, בתחילה המתגוררים dorsomedially לשדה הלב הראשון, ובהמשך translocate אל mesoderm הבלוע ו splanchnic, ממקום שבו הם נודדים אל הגרדום קיים של צינור הלב ליניארי. תאי שדה לב שני יתרמו את זכות חדר, בדרכי יצוא (OFT) לשריר לב ואת לכמה endocardium 25-28. תאי הרכס העצבי לב (CNCC), שמקורם rhombomeres postotic 6, 7 ו -8, ינדדו הלוע הזנב ולתרום מובהקcantly לשכבת השריר החלק וכריות endocardial של OFT. הם גם תורמים להיווצרות מחצה aorticopulmonary 29,30. אוכלוסיית הרביעי מכילה תאי epicardial נגזרו איבר פרו-epicardial (PEO), ותורם פיברובלסטים, תאי שריר חלק סוגי תאי לב אפשרי אחרים 31. Epicardium מסדיר פיתוח כלי דם הכליליים, צמיחת לב ומורפוגנזה 21.
המושג החשוב ביותר על המורפוגנזה לב הוא כי במהלך התפתחות לב, נדידת תאים חריגים / בידול של אוכלוסיות תאי ארבע אב יגרום מומים או מומי לב מולדים 4,22,32, המהווה את גורם מספר אחד של מומים מולדים בעולם . קביעת מנגנוני המורפוגנזה לב ברמה התאית ומולקולרית היא צעד חיוני לשיפור אבחון וטיפול אפשרי עבור CHDs.לכן, חשוב לדימוי התהליך של המורפוגנזה לב ברמה בלב השלמה עם החלטת תא בודדת. כדי להשיג זאת, אנו שכותרתו cardiomyocytes ידי חציית קו Cre בשליטת T טרופונין ספציפית לב (cTnT), אשר באה לידי ביטוי במיוחד ב cardiomyocytes 18, עם קו כתב mTmG. עוברים ב E8.5 נקצרו מוכתם עבור PECAM להבחין בין תאים endocardial ו האנדותל מן cardiomyocytes. עובר פונו מכן על ידי Sca le והלב היה צלם. שריר הלב היה שכותרתו על ידי ה- GFP בשל cTnT מונחה Cre בתיווך רקומבינציה של הכתב mTmG, ואת endocardium סומן עם PECAM (איור 1A ו משלים סרט 1). Cardiomyocytes ניתן לצפות ברזולוציה תא בודד (איור 1 א). מבני בלב חלק ההדמיה, כגון החדר הפרימיטיבי OFT ניתן לזהות בבירור לאחר שחזור 3D באמצעות מחדש 3Dתוכנת בנייה (איור 1B ו משלים סרט 2).
הדמיה שיבוטים אחד של הלב העוברי פינה
המורפוגנזה לב תלויה בידול שושלת לב ארגון תאים בודד ברמה בלב השלמה 22, וכך, זה חיוני להתמיינות תאים ובתאי לב יחידה תמונת סוגי תאי לב שונים, ובכדי גם מורפולוגיה תאי תמונה ברזולוצית תא בודדת. כדי להשיג זאת, Rosa26Cre ERT2 15 נחצה כדי R26R-קונפטי 16, והנקבה בהריון היה gavaged עם טמוקסיפן בריכוז נמוך. לאחר 48 שעות, העובר היה לקצור ב E9.5, ואת ההר שלם מוכתם עבור PECAM, ולאחר מכן בלב השלם היה צלם. מצאנו כי יש רק אשכול אחד של תאים, נקודות OFT, ו שיבוט זה היה 8 תאים בהתבסס on התמונה המשוחזרת וחתכים רצופים (איורים 2A, סרט 2B משלים 3), המציין כי תאים אלה לקוחים מתוך תא אב יחיד. מורפולוגיה הסלולר התנהגות הסלולר כגון התפשטות הגירה הסלולר ניתן להסיק את המיקום הסופי של התאים (איור 2 א). יישמנו את השיטה מעוקב כדי לנקות את הלב העוברי ב E9.5 ו E10.5, ומצא כי גם לאחר רק 24 שעות של דגירה עם מגיב 1, העוברים היו מומסים בעדינות ואת מבנה רקמות הושפע לרעה (מידע לא מוצג ).
הדמיה של לאחר לידת פינה ולבבות עובריים מאוחר
יישמנו הוא Sca l e ו מעוקב לנקות לבבות לאחר לידה. לבבות P2 עם גנוטיפ של αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre מתבטא דווקא cardiomyocytes <sup> 17) נוקו עם דואר Sca l במשך 48 שעות, אך לא להציג שום שקיפות יותר הלבבות שטופלו PBS בלבד (מידע לא מוצג), המציין כי Sca סליקת l e אינה יעילה עבור לבבות לאחר לידה. כאשר לבבות P2 פונו עם מגיב מעוקב 1 למשך 48 שעות, ולאחר מגיב 2 למשך 96 שעות, הם היו הרבה יותר שקופים מאשר לבבות פינה עם מגיב 1 במשך 48 שעות ו מגיב 2 במשך 48 שעות. עומק ההדמיה הוגדל באופן משמעותי עם 96 שעות של דגירה מגיב 2 (סרטים משלימים 4 ו -5), המציין כי דגירה כבר עם ריאגנטים מעוקב מקדם שקיפות מספקת לעליית עומק הדמיה. הצורה והגודל של כל cardiomyocyte יכול להיות מזוהה על ידי ה- GFP קרום מקומי (איור 3 א), אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות היפרטרופיה.
גם פינינו Nfatc1-Cre; קונפטי (נקבה קונפטי פקוק עם Nfatc1Cre זכר) לבבות E17.5 (Nfatc1-Cre מתבטא בתאים endocardial לב 19) עם מגיב מעוקב 1 במשך 48 שעות ו מגיב 2 במשך 48 שעות. הלבבות הם שקופים, ואת חלבוני ניאון כולל GFP, YFP, CFP ו RFP ציפו התווית תאים endocardial ותאי הנגזרות מהם; עם זאת, רק GFP ו YFP יכול להיות צילמו באמצעות בלב שלם (איורים 3 ב, 3 ג וסרטים משלים 6 ו -7), ואת CFP ו RFP לא ניתן היה לזהות (מידע לא מוצג). מכתים עבור PECAM (אלכסיה פלואוריד 647) גם לא ניתן היה לזהות (מידע לא מוצג), דבר המצביע על כך מגיב מעוקב מסביר גורמת לדיכוי CFP, RFP ואת fluorophore מצומדות נוגדנים בפרוטוקול זה.
איור 1:. הדמית דואר Sac / פינה בלב עוברי (א) op אחתפרוסת tical של לב E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) מוצגת. V: חדר; OFT: בדרכי יצוא. (ב) מציג את מבנה לב המשוחזר של 93 פרוסות אופטיות ברציפות עם לעומק כולל של 110.4 מיקרומטר. בר סולם = 20 מיקרומטר א אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדמית שיבוט אחד של SCA / e פינת לב עוברי (א) סעיף אופטי אחד שיבוט הבא מלב E9.5 עם גנוטיפ של ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-קונפטי. נקודות החצים כדי בליטה הסלולר של cardiomyocyte. (ב) מציג את השיבוט המשוחזר באזור OFT של לב E9.5 עם 10 פרוסות אופטיות ו -36 מיקרומטר לעומק כולל. בר סולם = 20 מיקרומטר א אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3: הדמיה לאחר הלידה פינה מעוקב ולבבות עובריים מאוחר (א) מציג סעיף אופטי אחד של לב P2 עם גנוטיפ של αMHC-Cre; mTmG; כל אחד מהסעיפים אופטי מוצגים משלים סרט 5. (ב) מראה חלק אחד של הלב E17.5 עם גנוטיפ של Nfatc1-Cre; ROSA26-קונפטי. (ג) מציג את מבנה לב המשוחזר 106 פרוסות אופטיות עם לעומק כולל של 630 מיקרומטר. סרגל הסולם = 20 מיקרומטר A ו- הוא 100 מיקרומטר ב אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. סרט משלים 1: הדמית Sca le פינת לב עוברי (קליק ימני להוריד) סרט 1 מציג חלקים אופטיים של Sca le מטופלי לב E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) מפני שטח לב לומן לב. העומק הוא 110.4 מיקרומטר ויש 93 פרוסות בסך הכל.
סרט משלים 2:. הדמית Sca le פינת לב עוברי (קליק ימני להוריד) Movie 2 מראה את תמונת משטח 3D של הלב המשוחזר סרט 1, reconstrucטד באמצעות תוכנת שחזור 3D. סימנים צהובים ביטוי PECAM ותוויות ירוקות כל cardiomyocytes.
סרט משלים 3: דימות שיבוט אחד של Sca le פינת לב עוברי (קליק ימני להוריד). סרט 3 מציג קטעי שיבוט הבא מלב E9.5 עם גנוטיפ של ROSA26-Cre ERT2.
הסרט משלים 4: הדמיה בליבם לאחר הלידה פינה מעוקב (קליק ימני להוריד). סרט 4 מראה קטעי לב P2 מעוקב מטופלים (& #945; MHC-Cre; mTmG) מפני שטח לב לומן לב. לב P2 זה נוקה עם מגיב מעוקב 1 במשך 48 שעות, ו מעוקב מגיב 2 למשך 96 שעות.
סרט 5 משלים: הדמיה בליבם לאחר הלידה פינה מעוקב (קליק ימני להוריד). סרט 5 מראה לב כי נוקה עם מגיב 1 מעוקב במשך 48 שעות ו מגיב מעוקב 2 במשך 48 שעות. העומק הוא 136 מיקרומטר עם 6 מיקרומטר לכל סעיף בסרט 4 ואת העובי הוא 76 מיקרומטר עם 6 מיקרומטר לכל סעיף בסרט 5.
סרט משלים 6: הדמיה אמברי מאוחר פינה מהעוקבתלב onic (קליק ימני להוריד) סרט 6 מציג קטעי לב E17.5 מעוקב מטופלים (Nfatc1-Cre; ROSA26-קונפטי). מפני שטח לב לומן לב. העומק הוא 630 מיקרומטר עם 6 מיקרומטר לכל סעיף.
סרט 7 משלים: הדמיה בלב העוברי מאוחר פינה מהעוקב (קליק ימני להוריד). סרט 7 מראה את תמונת משטח 3D של לב סרט 6, משוחזר באמצעות תוכנת שחזור 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבידוד העובר הוא צעד מאוד קריטי. עובר E9.5 הם שבירים מאוד קטנים בגודלם, כך משנת זהירות יש לנקוט לא לפגוע מבנים עוברים / לב במהלך בידוד. שני הרבדים הנוספים שאינם עובריים העוטף את העובר / הלב צריך להסיר בזהירות במיוחד כאשר הדמיה העובר כולו. זה מאפשר חדירת תערובת נוגדנים וסליקה עמוקה בתוך הרקמות העובריות, וגם עוזר בהסרת אות הרקע כאשר הדמיה. נוגדנים מרובים כולל נוגדנים נגד PECAM, טובולין-α acetylated ו β1 integrin נבדקו וכל אותרו בהצלחה (מידע לא מוצג) 33. מכך ניתן להסיק כי השלמות המולקולרית, שלמות הסלולר ותאימות אנטיגן לא שובשו במהלך תהליך ניקוי זה.
מעביר את העובר / לב בעזרת פיפטה העבירה פה רחבה (לחתוך את הקצה). זה ימנע נזק במהלך הטיפול. ה- GFP / YFP / RFP / דפוס הביטוי CFP ו nאדמדם של שיבוטים יש לרשום בקפידה בלב כדי לקבוע את המינון המתאים לתייג שיבוט אחד לכל לב או כל לאיברים אחרים. בשל המינון הנמוך של טמוקסיפן (10 מיקרוגרם / g), לפעמים הלב אינו מכיל שיבוטים או קשה לזהות כל שיבוטים. לכן, מומלץ להשתמש שק החלמון כדי לקבוע אם העובר יש כל GFP / YFP / RFP / שיבוטים CFP.
הקיבעון העובר או לב הוא שלב קריטי, כמו יתר הקיבעון יגרום רקע גבוה תוך תחת הקיבוע יגרום מכתים עני. מומלץ לתקן את העובר כולו E8.5-E10.5 עבור שעה 2 ב RT על שייקר צלחת. בעוד עוברי E11.5-E15.5, ההמלצה היא לבודד את הלב בקפידה ולתקן אותה עם 4% PFA עבור שעה 2 ב RT. לאחר הבטיח להסיר את השכבות סביב הלב אם עיבוד העובר כולו, את עוברי E13.5 E11.5- יכולים גם להיות קבועים במשך 3-4 שעות ב RT אבל זה דורש זמן סליקת רקמה מוגבר. E16.5-P1 (לאחר לידהלבבות יום 1) הם קבועים עבור 3-4 שעות ב RT על שייקר צלחת. כאשר תיקון העובר כולו, לקדמת הבמה ואת הגפיים אחוריים להסירו כפי שהם לעכב את הדמית הלב.
הדגימות ומחייבות מעוקב Sca le צלוחיות נצנץ למזער ייבוש מדגם. ראינו סליקה טובה יותר של דגימות עם שיטת סליקת רקמות מעוקב ב 37 מעלות צלזיוס, תוך שהוא מותיר le Sca נעשית באופן אופטימלי על 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדמיה, הדגימות ניתן לאחסן לטווח קצר מעוקב-2 או Sca le 70. הדגימות תמיד צריכות להיות מכוסות בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת קרינה.
יש רקמות ואיברים עובריות שומנים פחות בתצהיר תאי מטריקס, שתוצאתה זמן סליקה פחות. מצד השני, הם פגיעים יותר ריאגנטים הסליקה. ריאגנטים הסליקה עשויים להשפיע על שלמות מבנה רקמות אנטיגן, וכתוצאה מכך המרווה של CFP, RFP נוגדני conjufluorophore מגודרת. לכן, פעמים קיבעון יותר עשויה למנוע מרווה. מרווה של חלבוני ניאון גם יכול להיות בגלל רגישותם כימיקלים pH כפי שדווח בעבר 34. מתכונים כימיים אחרים, pH, fixatives, ואורך דגירה צריכים להיחקר כדי למזער את המרווה של חלבוני הניאון.
השיטה של transparentizing איבר שלם או סליקה רקמות חוללה מהפכה הדמיה 3D נפח. שיטת ההדמיה הקודמת עבור המורפוגנזה לב, שכללה את שחזור 2D או 3D הידני של קטעי סדרתי, זה זמן רב מכשיר בדרישת 5,6. מיקרוסקופיה episcopic ברזולוציה גבוהה (HREM) בשילוב עם מודלים 3D יכול להיות מיושם על המחקר של המורפוגנזה של הלב העכבר מספק תיאור אנטומי מעולה של אדריכלות trabecular בעובר העכבר המתפתח 35. עם זאת, HREM אינו מאפשר זיהוי של fluorescחלבון הנקרא אף אוזן גרון תאים או תאים מוכתם נוגדן משאר תאי 35. באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, עם מאמץ מינימאלי ויעילות עלות גבוהה, יש לנו בהצלחה שמרו על אותות ניאון בלב העוברי באמצעות Sca le או שיטות סליקת רקמות מעוקב (איורים 1 - 3). בשילוב עם מינון נמוך (10 מיקרוגרם / g) של טמוקסיפן לגרום אירועי רקומבינציה Cre וליצור כמה שיבוטים בתוך העובר כולו בלב, מערכת זו יכולה לשמש כדי לעקוב וללמוד התמיינות תאים ובתאים יחידה לב והתנהגויות הסלולר vivo (איור 2 א) 33. בנוסף, בשילוב עם מחיקת גן בתיווך Cre או ביטוי יתר ו Cre בתיווך תיוג תא בודד, מערכת הדמיה זו ניתן להחיל ללמוד אובדן גנטי של פונקציה או רווח של פונקציה על התמיינות תאים ובתאים והתנהגות הסלולר במהלך המורפוגנזה לב, ובכך מספקת חזק כלי study האטיולוגיה של מומי לב מולדים.
Sca מערכות סליקת שתי הרקמות / e ו מעוקב השתמש במחקר זה הראה יעילות סליקה שונות, אשר עוד מבדיל בין המערכות המבוססות על גיל עוברי, עובי רקמה ומשך זמן סליקת רקמות. לקבלה-E10.5 E9.5 בעוברים בראשית התפתחותם, מערכת Sca / ה לא רק שניתנה הרקמה ברורה אך גם מגנה על המורפולוגיה עובר ושמרה את אותות הניאון, ואילו הטיפול מעוקב הביא לפירוק עובר. זו עשויה להיות התוצאה של aminoalcohols נוספת ריכוז גבוה של טריטון X-100 ב הפתרונים מהעוקבים 8. עבור לבבות מבוגרים, מערכת Sca / e נכשלה כדי לנקות את הרקמה אפילו לחלוטין עם זמן דגירה כבר. פתרון הסליקה מהעוקב שניתן רקמה המבוגרת ברורה (איור 3). עם זאת, זמן הדגירה גדל הביא אותות חלשים ורק מוגן GFP אנדוגני, בעוד RFP, CFP אותות מצומדות נוגדןהיו אבודים. מסיבה זו, מתכון מותאם יותר של חומרים כימיים סליקה וזמן דגירה יותר יידרש volumetrically לבבות תמונה או איברים עם ספקטרום גדול של תוויות ניאון.
מחקר זה הוכיח כי אפשר לתייג, זכר, ומשכפל לב יחיד תמונה בשילוב עם מכתים הר שלם של PECAM סמן תא endocardial / האנדותל של הלב מתפתח. מכתים ההר השלם של PECAM ו DAPI במערכת זו לא רק עוזר לזהות את סוגי התאים ומורפולוגיה תא של התאים שכותרתו בתוך לב, אלא גם מאפשר הלימוד של משובטי דפוס, הגירה והתנהגותם במהלך המורפוגנזה לב. באיור 2A צפינו שיבוט עם 8 תאים OFT. שימוש במספר הנוכחי תא שיבוט זה תוך התייחסות זמן תיוג, שיעור התפשטות תאים ניתן לחשב בקלות. במחקר אחר משתמש באותה מערכת זיהינו את דפוס חלוקת התא אוריינטציה migrדפוס ation של cardiomyocyte יחיד במהלך תהליך trabeculation 33. היישום של פרוטוקול זה כדי לחקור את ההשפעות של אובדן הגנטי של פונקציה או רווח של פונקצית spatiotemporally על התמיינות תאים ובתאי לב שכותרתו, דפוס משובט והתנהגות הסלולר אינו ריאלי, ויסייע במחקרים על האטיולוגיה של מומי לב מולדים בבית גנטי ברמה המולקולרית בהקשר 3D. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד המורפוגנזה במערכות איבר אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
