Abstract
Bütün kalp seviyesinde tek klonal izleme ve analiz kalp gelişimi sırasında kalp progenitör hücre davranışını ve farklılaşmasını belirlemek ve normal ve anormal kalp morfolojilerinden hücresel ve moleküler temeli çalışması için izin verebilirsiniz. retrospektif tek klonal analizler Son gelişen teknolojiler tek bir hücre çözünürlükte kalp morfolojilerinden çalışma mümkün olun. Ancak, doku donukluk ve görüntüleme derinliği gibi kalbin ışık saçılması tek bir hücre çözünürlükte hinder bütün kalp görüntüleme artar. Bu engelleri, geliştirilmesi gerekir aydınlatma ve tespiti hem son derece şeffaf kalbi işleyebilir bir bütün embriyo takas sistemini aşmak için. Neyse ki, son birkaç yıl içinde, bu tür CLARITY olarak tüm organizma temizleme sistemleri, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb ve PACT için birçok yöntemler bildirilmiştir. Bu laboratuvar kartının hücresel ve moleküler mekanizmalar ilgileniyorIAC morphogenesis. Son zamanlarda, biz ROSA26-Cre ERT2 üzerinden izleme tek bir hücre soyu kurulmuş, seyrek etiket hücrelere ROSA26-Konfeti sistemini kalp gelişimi sırasında. Biz kalp içinde görüntü tek klonlar bütün montaj boyama ile birlikte embriyo temizlemek için Sca le ve CUBIC (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analizi) dahil olmak üzere birçok bütün embriyo-takas yöntemleri uyarladı. Kalp başarıyla tek bir hücre çözünürlükte görüntülendi. Biz CUBIC doğum sonrası kalbi temizlemek süre Sca le, embriyonik kalbi temizlemek, ancak etkili bir doğum sonrası kalbi temizlemek olamayacağını bulundu, ancak zarar dokuyu eriterek Embriyonik kalp. Burada açıklanan yöntemler sırayla, konjenital kalp defektleri hücresel ve moleküler temelini ortaya çıkarabilir, kalp morfolojilerinden sırasında tek bir klon çözünürlükte gen fonksiyonu çalışma izin verecektir.
Introduction
Kardiyak morphogenesis kalbin farklı sektörleri içine kalp progenitör hücrelerin dört farklı tipte zamanmekansal organizasyon gerektiren bir ardışık bir olay olduğunu ve aynı zamanda fonksiyonel kalp 1,2 oluşturmak için bu süreci düzenlemek için birden fazla genetik düzenleyici ağları gerektirir. Kardiyak şartname, farklılaşma, desenleme ve bölme olgunlaşma kardiyojenik transkripsiyon faktörleri 3 düzenlenir. Genetik mutasyon veya kardiyak progenitör hücrelerin bu faktörlerin posttranskripsiyonel sapmaları embriyonik öldürücülüğü veya konjenital kalp kusurları (KKH) 4 ya neden olabilir. Kalp morfolojilerinden çalışma kardiyak morfojenezinde anlayışı teşvik edecek kalp gelişimi sırasında izleme üç boyutlu (3D) doğasında yapısal detayları ve tek etiketli kalp progenitör hücre soyu anlamayı gerektirir. yüksek çözünürlüklü bölümü tomografi bir dizi yöntem inci geliştirilmiştirGörüntü organ yapısı 5,6 birkaç on yıl geçmiş, e; Ancak, bu yöntemler pahalı, özel araçlar, geniş emek gerektiren ve son hacimsel görüntü 7,8 yeniden tek hücreli çözünürlükte ayrıntılı yapısal organizasyon eksikliği.
Tek hücre düzeyinde 3D hacimsel görüntüleme in vivo 7 progenitör hücre farklılaşması ve hücre davranışlarını incelemek için bir araç sağlar. Ancak, doku ışık saçılması derin bozulmamış kalp içinde 3D hücreleri ve yapıları görüntüleme önündeki en önemli engel olmaya devam etmektedir. Doku şeffaflığı 8 artırmak için potansiyel yaklaşımlar lipidler ışık saçılması önemli bir kaynak ve lipidler ve / veya lipidler ve çevresinde arasındaki kırılma indeksi farkı ayarlama kaldırma are. Son birkaç yıl içinde, doku temizleme bir dizi yöntem, doku donukluk ve ışık saçılması azaltan, geliştirilmiş Babb (benzil alkol ve benzil benzoat gibiE karışımı) ile DBE (tetrahidrofuran ve dibenzylether); ancak bu yöntemlerde, floresans bir sorun 8-10 devam etmektedir. Solvent gibi SeeDB (fruktoz / tiyogliserol) ve 3DISCO (diklorometan / dibenzylether) gibi hidrofilik yöntemleri, bazlı floresan sinyalleri korumak, ancak 7,8,11 şeffaf bütün organı render yoktur. Buna karşılık, CLARITY doku temizleme yöntemi organı saydam yapar, ama aynı zamanda hidrojel 7,13 gömme gerektirir PACT (pasif berraklık tekniği), yaptığı gibi, lipidler 8,12 kaldırmak için özel bir elektroforez aygıtı gerektirir. Tüm doku temizleme yöntemleri hakkında ayrıntılı bilgi için, ark Richardson ve Lichtman, Tablo 1'e bakınız. 7..
2011 yılında, Hama ve ark. Tesadüfen bir hidrofilik karışım 'Sca Le' keşfettik (üre, gliserol ve Triton X-100 karışımı) fare beyin ve embriyo transpar hale getirdiğiKBB tamamen etiketli klonları 14 floresan sinyalleri koruyarak. Bu hücre içi çözünürlükte birkaç milimetre ve nöronal nüfus ve çıkıntılar büyük ölçekli yeniden derinlikte bozulmamış beyin görüntüleme sağlar. Susaki ve ark. ayrıca aminoalkoldür ekleyerek le SCA geliştirilmiş ve fosfolipid çözülmesini arttı 'CUBIC' (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analiz) doku temizleme yöntemi, azaltılmış temizleme zamanı geliştirdi ve çok renkli floresan görüntüleme 8 sağladı. Bu çalışmada, cardiogenesis sırasında kalbin içinde Sca le avantajı ve KÜBİK doku takas teknikleri ve yüksek çözünürlüklü 3D optik bölümlendirilmeleri, bireysel klonlar alarak Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre kullanılarak takip edildi 18, Nfatc1-Cre 19 ve Rosa26-mTmG (mTmG), 20 fare soyları. Tüm montaj boyama (WMS) yönteminin kombinasyonu, daha önce 21,22 daha etiketli klonlar diğer proteinlerin boyama ve 3D hacimsel bağlamında kendi davranış çalışma için izin verilen doku temizleme yöntemleri ile gelişti. Doku temizleme ve WMS kombinasyonu kalp gelişimi sırasında farklı genlerin ve proteinlerin rolleri daha iyi anlaşılması ve konjenital kalp etyolojisinde sağlar. Bu protokol, geliştirme sırasında diğer progenitör hücre farklılaşması, hücre davranışını ve organ morfogenez olayları incelemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Bakımı NIH Kılavuzu'na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre Albany Medical College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. solüsyon preparasyonlarda
NOT: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Konfeti 16, αMHC-Cre 17 ve Rosa26-mTmG (mTmG) 20 fare hatları ticari satın alındı cTnT-Cre 18 Alabama Üniversitesi'nden Dr. Jiao bir hediye oldu Nfatc1-Cre.. Tıp 19 Albert Einstein College of Dr. Bin Zhou bir hediye oldu. Fareler bilateral torakotomi kesilerek ya da servikal bozma ile ölüm doğrulama fiziksel yollarla ve ardından en az 60 saniye boyunca kapalı bir odada, karbon dioksit inhalasyonu ile ötenazi uygulandı.
- Tamoksifen hazırlayın. ayçiçeği oi, 10 ml Tamoksifen 10 mg çözülürl. -20 ° C de tamamen çözüldükten sonra, kısım ve mağaza.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) ve damıtılmış su, 1 L KCl (0,20129 g) çözülür ve pH 7.4 ayarlanır.
- PBST hazırlanması:% 0.1 Tween-20 çözeltisi PBS içinde PBS, 100 ml Tween-20, 100 ul çözülmesiyle.
- tampon engelleme hazırlayın. % 0.2 Tween-20 içeren PBST 100 ml BSA, 3 g çözülmesiyle% 3 sığır serum albümini (BSA) Bloklama çözeltisi, sağlayın.
- CUBIC-1 (reaktif 1) hazırlayın. Ağırlıkça% 25 üre, ağırlıkça% 25 N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin 15 ağırlık% Karışım dH 2 O Triton X-100
- CUBIC-2 (reaktif 2) hazırlayın. Ağırlıkça% 50 sakaroz, ağırlık olarak% 25 üre, ağırlıkça% 10 oranında 2, 2 ', 2' 'karıştırın - nitrilotriethanol ve% 0.1 (v / v) dH 2 O Triton X-100
- Sca Le A2 hazırlanması: 4 M üre,% 10 w / v gliserol ve / Triton V X-10,% 0.1DH 2 O. 0 7.7 pH ayarlayın.
- Sca le B4 hazırlayın: 8 M üre ve / Triton v X-100 w% 0.1 dH 2 O. 8.7 pH ayarlayın.
- Hazırlama Sca Le 70: 4 M üre,% 70 ağırlık / hacim gliserol ve DH 2 O. / Triton v X-100% 0.1
2. Tamoksifen İndüksiyon, Embriyo İzolasyon ve Fiksasyon
- Tamoksifen İndüksiyon ve Embriyo İzolasyonu
- Embriyonik gelişim günde E7.75 33. Tamoksifen 10 ug / g (R26Cre ERT2 erkek fareler tarafından takılı) kavisli bir beslenme tüpü onaylanan protokole (ACUP 13-12007), sonda kadın R26Cre ERT2 Confetti fareler kullanma. Embriyonik gün 9.5 (E9.5) veya E10.5 anda, CO 2 ve servikal dislokasyon ile dişi farelerin euthanize.
- Fare ölüm doğrulanmasının ardından, makasla fare karın boşluğu açın ve uterin boynuz teşrih (Bölüm 1 Not bakınız) makas ve cımbız ve yeniden yardımıyla rahim tüp katmanlarını kaldırmakrahim tüp 23,24 embriyolar kira.
- PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir petri embriyolar aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız yardımı ile embriyonik olmayan katmanları (koryon, yolk kesesi ve amniyon) çıkarın.
- Daha önce 22 bildirildiği gibi cımbız ve makas kullanarak, genotipleme için dişi fare ve embriyo kuyruk örnekleri toplamak. Bir pipet kullanarak, 1x PBS 1 ml içeren 48 çukurlu bir levhanın bir kuyucuğuna, her embriyo transferi.
- Bir floresan mikroskop altında, bir kamera ile bir inverted mikroskop aracılığıyla GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar tespit. uzakta Peel cımbız kullanarak perikard ve GFP / RFP / OBP filtreleri ile kalbin her iki tarafında floresan klonların sayısını belirlemek için kavisli cımbız yardımı ile kalp / embriyo döndürün. Hiçbir kesikler ihtiyaç vardır.
- GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar belirledikten sonra, hızlı bir şekilde th 1x PBS ile iki kez (2 dk her biri) embriyolar yıkayınE 48, oda sıcaklığında (RT), bir plaka karıştırıcısı üzerinde iyi plaka. Bu aşırı kan kaldıracaktır.
- Oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak embriyo / embriyonik kalbini düzelt. sabitleme süresi embriyonik yaş ve doku büyüklüğüne bağlıdır. E9.5 oda sıcaklığında 2 st için embriyo düzeltin. Geç embriyonik evre embriyolar bile doğum sonrası kalp için 24 saat için uzatılabilir uzun fiksasyon süresi gerektirir.
UYARI: Paraformaldehyde toksik, deri, göz ve mukoza zarı ile temasından kaçının. - Tespit edildikten sonra, oda sıcaklığında, bir plaka karıştırıcısı üzerinde iki kez 48 çukurlu plaka içinde 1x PBS (10 dk) embriyo / kalp yıkayın. Bu embriyo / kalp aşırı PFA kaldırır. Embriyolar daha sonra tüm montaj boyama ve doku temizlenmesi için işlenir.
3. Tüm Dağı Boyama
NOT: aşağıdaki gibi PFA Tespit edildikten sonra embriyo / kalp tüm montaj boyama tabi tutulur.
- 1 m kullanarak bir 48 iyi plaka embriyo / kalbi permeabilizeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat boyunca% 0.1 PBST l.
- geçirgenliği sonra, 4 ° C'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat veya gece boyunca bloke tamponu 1 ml embriyo / kalp bırakın.
- 4 ° C'de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 0.3 ml (100 1) ile seyreltildi, endotelyal hücreye özgü antikor PECAM (CD31), embriyo / kalp bırakın.
- plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında PBST 5 kez, 30 dakika her kullanılarak embriyo / kalbi yıkayın. Bu dokudan fazla spesifik olmayan bağlanmış primer antikor kaldırır.
- 4 ° C'de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 1 ml (1.000 1) ile seyreltildi ve Alexa Fluor 647 keçi anti-fare ikincil antikoru embriyo / kalp, bırakın.
- Adımı yineleyin 3.4 ikincil antikor yıkayın.
- plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 PFA ile embriyo / kalp sonrası düzeltmek ve PBS her biri 5 dakika iki kez yıkayın.
- Bir konsantrasyonlarda ise PBST içinde seyreltilmiş Nükleer soya 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (embriyo / kalp LekeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca, 0.01 mg / mL) oranı. Her biri 5 dakika iki PBS yıkama ile takip edin.
4. Embriyo / Sca l e veya KÜBİK Yöntemi ile kalp Takas
NOT: Bütün montaj boyamadan sonra, embriyo / kalp Sca le veya KÜBİK doku takas yöntemiyle ya tabi tutulur. Metodun seçimi dokunun büyüklüğüne ve embriyonik yaşına bağlıdır. E11.5 veya daha önceki yaş embriyolar, kullanım Sca l e doku temizleme yöntemi için eski embriyolar ya da doğum sonrası kalpler için KÜBİK doku temizleme yöntemi tercih edilir.
- Ölçek Doku Takas Yöntemi
- Yumuşak bir arada 4 ° C'de 48 saat süre ile (elle) çalkalanarak (alüminyum folyo ile sarılmış) bir sintilasyon şişesine Sca l e A2 çözeltisinin 1 ml'si ile embriyo / kalp inkübe edin.
- Sca l e A2 inkübasyondan sonra, ara sıra nazik bir anot çalkalanarak aynı şişe içinde, 4 ° C'de Sca l e B4 çözeltisi 1 mL embriyo / kalp inkübeOnu 48 saat.
- Zaman zaman hafifçe çalkalanarak 4 ^ 'de, 1 ml Sca l e 70 sahip bir 48 saat daha embriyo / kalp inkübe edin. % 90 gliserol kullanılarak Dağı embriyo (bakınız bölüm 5.1).
- KÜBİK Doku Takas Yöntemi
- Bütün embriyo / kalp KÜBİK takas için, nazik arada 37 ºC 7'de 48 saat boyunca çalkalanarak CUBIC-1 1 ml her embriyo / kalbi batırmayın. 48 saat sonra, taze, KÜP indikatör 1 aynı hacimde çözelti yerine ve zaman zaman elle çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 48 saat boyunca örnek inkübe edin.
- yumuşak el ile çalkalayarak oda sıcaklığında 1 x PBS ile birkaç kez kübik 1 ile tedavi, kalp / embriyo yıkayın. Bu aşırı CUBIC-1 çözümü kaldırır.
- PBS ile CUBIC-1 yıkanmasından sonra, zaman zaman nazik eliyle çalkalanarak 37 ºC'de 48 saat süreyle CUBIC-2 çözeltisi (embriyo / kalp başına 1 gr) embriyolar / kalpleri batırmayın. Bu gliserol kullanarak montaj embriyo / kalbi izler (bakınız Bölüm 5.2).
5. Numune Montaj ve Görüntüleme
NOT: Sca l e 70 ya da CUBIC-2 çözeltisi içinde temizlenir embriyolar veya organlar sırasıyla görüntüleme aracı olarak Ölçeği 70 ve CUBIC-2 çözeltisi ile doğrudan görüntülenebilir. Numuneler aşağıda protokol izlenerek% 90 gliserol örnekleri saklamak, hemen görüntülü, ancak uzun vadeli saklanabilir değilse Ancak, takas reaktif embriyonik örneklerin açığı göz önüne alındığında.
- Doğrudan Sca Le görüntüleme kadar 4 ° C 'de% 90 gliserol ve deposunun 1 ml örneği temizlenir bırakın.
- Iki kez 1 x PBS ile her biri 5 dakika KÜP muamele edilmiş numune yıkanır ve sırasıyla 30 dakika için% 30,% 50,% 70 ve% 90 gliserol çözeltisi, her biri 1 ml örnek inkübe edin.
- Görüntüleme için, iki foton yetenekleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile% 90 gliserol ve görüntü klonlarının bir az miktarda cam alt Petri kabı örnek aktarmak.
- Görüntü kalp ya da embriyo 10X / 0.3 NA ile gliserol, bir 25X / 0.8 NA daldırma veya 40X / 1.2 NA su düzeltici objektif lens. Görüntü DAPI tutarlı bir titanyumdan 2-foton uyarma kullanarak: safir bukalemun lazer. Mikroskop ve objektif lens seçimi süper çözünürlük için örneğin deneyler, amacına bağlı olacaktır, hafif bir tabaka floresan mikroskop yararlanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
temizlenir embriyonik kalbin görüntülenmesi
Omurgalı kalp oluşumu spatiotemporally düzenlenmiş morfojenik süreçtir ve dört farklı kaynaklardan 1 organizasyon ve progenitör hücrelerin farklılaşması bağlıdır. Kalp hilalin ilk kalp alanından Hücreler doğrusal bir kalp tüp oluşturacak şekilde ventral orta hat doğru katlanır. Başlangıçta ilk kalp alanına dorsomedially ikamet eden ikinci kalp alanından hücreler, daha sonra da lineer kalp tüpü önceden varolan iskele göç yerden, farenks ve splanknik mezoderm transloke. Ikinci kalp alanının hücreleri sağ ventrikül, çıkış yolu (OFT) miyokarda ve bazı endokardiyum 25-28 katkıda bulunacaktır. Kardiyak nöral krest hücreleri (CNCC) postotic rhombomeres 6, 7 ve 8 menşeli, kaudal yutak göç ve belirgin olarak artmış katkıda bulunacakOFT düz kas tabakası ve endokardiyal minderleri derecede. Ayrıca aortikopulmoner septum 29,30 oluşumuna katkıda bulunmaktadır. Dördüncü popülasyon Pro-epikardiyal organ (PEO) türetilen epikardiyal hücrelerinden oluşur, ve fibroblastlar, düz kas hücreleri ve potansiyel olarak diğer kalp hücre tipleri 31 katkıda bulunur. Epicardium koroner damar gelişimi, kalp büyümesi ve morfolojilerinden 21 düzenlemektedir.
Kalp morfolojilerinden ile ilgili en önemli kavram kalp gelişimi, anormal hücre göçü sırasında / dört progenitör hücre popülasyonlarının farklılaşma malformasyonlar veya konjenital kalp kusurları doğum kusurları bir numaralı nedeni dünyada olduğu 4,22,32, neden olacaktır . hücresel ve moleküler düzeyde kalp morfolojilerinden mekanizmalarını belirlenmesi DKH'ler için tanı ve potansiyel tedaviler geliştirmek yönünde önemli bir adımdır.Bu nedenle, görüntü, tek bir hücre çözünürlükte bütün kalp seviyesinde kalp morfolojilerinden süreci önemlidir. Bunu başarmak için, biz özellikle mTmG muhabiri hattı ile kardiyomiyositlerinin 18 olarak ifade edilir kardiyak spesifik troponin T kontrolü (cTnT) altında Cre çizgisini geçerek kardiyomiyositlerde etiketli. E8.5 embriyolar hasat ve kardiyomiyositlerde gelen endokardiyal ve endotel hücrelerini ayırt etmek PECAM için boyandı. Embriyolar daha sonra Sca le tarafından temizlendi ve kalp görüntülendi. Miyokard bağlı mTmG habercisinin cTnT odaklı Cre aracılı rekombinasyon GFP tarafından etiketlenmiştir ve endokard PECAM (Şekil 1A ve Yardımcı film 1) ile işaretlenmiştir. Kardiyomiyositlerde tek bir hücre çözünürlüğü (Şekil 1A) gözlenebilir. Böyle ilkel ventrikül ve OFT olarak görüntülü kısmın kalp yapıları, açıkça 3D yeniden kullanarak 3D rekonstrüksiyon sonra tespit edilebilirinşaat yazılımı (Şekil 1B ve Ek Movie 2).
temizlenir embriyonik kalp tek klonlar Görüntüleme
Kardiyak morphogenesis bütün kalp düzeyinde 22 kardiyak soy farklılaşma ve bireysel hücre organizasyonu bağlıdır ve bu nedenle, farklı kardiyak hücre tiplerine görüntü tek kalp progenitör hücre farklılaşması için gereklidir ve tek bir hücre çözünürlükte aynı zamanda görüntü hücre morfolojisi için. Bunu başarmak için, Rosa26Cre ERT2 15 R26R-Confetti'nin 16 çaprazlandı, ve hamile bir kadın, düşük konsantrasyonda Tamoksifen zorla ağız yolundan verilmiştir edildi. 48 saat sonra, embriyo E9.5 hasat edildi ve bütün PECAM için lekeli monte, ve sonra bütün kalp görüntülendi. Bu OFT lokalize, hücrelerin sadece bir küme olduğu bulundu ve bu klon 8 hücre göre o vardıOluşturulan görüntü ve bu hücreler, tek bir progenitör hücreden türetilen belirten ardışık bölümler (Şekil 2A, 2B ve Yardımcı Film 3), n. Böyle hücresel çoğalma ve göç gibi hücresel morfoloji ve hücresel davranış hücreleri (Şekil 2A) nihai konumlandırılması anlaşılabilir. Ayrıca veri gösterilmemiştir (E9.5 ve E10.5 embriyonik kalp temizlemek kübik bir yöntem uygulanır ve daha reaktif 1 ile inkübasyon sadece 24 saat sonra, embriyolar ustaca eritildi bulundu ve doku yapısı olumsuz etkilenmiştir ).
temizlenir postnatal ve geç embriyonik kalpleri görüntüleme
Biz doğum sonrası kalpleri temizlemek için Sca l e ve CUBIC hem uygulamalı. αMHC-Cre genotipi ile P2 kalpleri; mTmG (αMHC-Cre özellikle kardiyomiyositlerde ifade edilir <sup> 17) 48 saat boyunca Sca l e temizlendi, ancak Sca l e temizleme sonrası kalpleri için etkili olmadığını belirten, PBS ile tedavi kalpleri yalnızca (veri gösterilmemiştir) daha fazla bir şeffaflık görüntüler yoktu. P2 kalpler 48 saat ve 96 saat süreyle indikatör 2 için KÜBİK indikatör 1 ile silinmesinden, onlar çok daha şeffaf 48 saat indikatör 1 ve 48 saat indikatör 2 ile temizlenir kalpleri daha vardı. Görüntüleme derinliği belirgin KÜP reaktifler ile daha uzun inkubasyon saydamlık sağlar ve görüntüleme derinlemesine bir artış sağladığını gösterir: reaktif, 2 inkübasyondan 96 saat (Ek Film 4 ve 5) ile yükseltilmiştir. Her kardiyomiyosit şekli ve boyutu hipertrofisi tanımlamak için kullanılabilir membran lokalize GFP (Şekil 3A) ile tespit edilebilir.
Nf ile takılı Konfeti (Konfeti kadın; biz de Nfatc1-Cre temizlediatc1Cre male) E17.5 Kalpler (Nfatc1-Cre 48 saat ve 48 saat süre ile reaktif 2 kübik indikatör 1 kardiyak endokardiyal hücreler 19) olarak ifade edilir. kalpleri şeffaf ve GFP, YFP, CFP ve RFP dahil floresan proteinleri endokardiyal hücreleri ve bunların türevi hücreleri etiketlemek için beklenen; Bununla birlikte, sadece GFP ve YFP bütün kalp ile görüntülenebildi (Şekil 3B, 3C ve Katkı Film 6 ve 7) ve CFP ve RFP tespit edilememiştir (veriler gösterilmemiştir). PECAM için boyama (Alexia Fluor 647) de KÜBİK reaktif CFP, RFP ve bu protokolde antikor konjuge fluorofor doyurur düşündüren, (Veriler gösterilmemiştir) tespit edilememiştir.
Şekil 1:. Sac / e embriyonik kalbi temizlenir Görüntüleme (A) Tek opBir E8.75 kalp (cTnT-Cre; mTmG) ve kortikal dilim gösterilir. V: ventrikül; OFT: çıkış yolu. (B) 110.4 mikron toplam derinliği ile 93 ardışık optik dilim yeniden kalp yapısını gösterir. A. Ölçek çubuğu = 20 mikron Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Sca / e tek klon Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (A) ROSA26-Cre ERT2 genotip ile bir E9.5 kalpten bir klon bir optik bölümü;. ROSA26-Konfeti. Bir kardiyomiyosit bir hücresel çıkıntı ok işaret eder. (B) 10 optik dilimleri ve 36 mikron toplam derinliği ile E9.5 kalbin OFT bölgede yeniden klon gösterir. A. Ölçek çubuğu = 20 mikron Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 3: CUBIC temizlenir postnatal ve geç embriyonik kalpleri Görüntüleme (A) αMHC-Cre genotip ile P2 kalbin bir optik bölümü gösterir; mTmG; ROSA26-Confetti, optik tüm bölümleri Ek Film 5. (B) 'de gösterilmiştir Nfatc1-Cre genotipine sahip bir E17.5 kalbin bir kesitini göstermektedir. (C) 630 mikron toplam derinliği 106 optik kesitlerden yeniden kalp yapısını gösterir. Ölçek çubuğu = A 20 mikron ve B'de 100 mikron olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Ek Film 1: Sca le Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın) ; kalp lümene kalp yüzeyinden Film 1 Sca le optik bölümleri E8.75 kalbi (mTmG cTnT-Cre) tedavi gösterir. Derinlik 110.4 mm ve toplam 93 dilim vardır.
Ek Movie 2:. Sca le Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın) Film 2 Film 1 yeniden kalbin 3D yüzey resmini gösterir, reconstruc3D rekonstrüksiyon yazılımı ile ted. Sarı işaretleri PECAM ifade ve yeşil etiketler tüm kardiyomiyositlerde.
Ek Film 3: Sca le tek bir klon Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın). Film 3 ROSA26-Cre ERT2 genotip ile bir E9.5 kalpten bir klon kesitlerini göstermektedir.
Ek Film 4:. CUBIC temizlenir doğum sonrası kalpleri Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın) Film 4 CUBIC tedavi P2 kalbin bölümlerini gösterir (& #945, kalp lümen kalp yüzeyinden mTmG) MHC-Cre. Bu P2 kalp 48 saat KÜBİK indikatör 1 ve 96 saat süreyle KÜBİK indikatör 2 ile temizlendi.
Ek Film 5:. CUBIC temizlenir doğum sonrası kalpleri Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın) Film 5 48 saat ve 48 saat süreyle 2 KÜBİK reaktifin 1 CUBIC reaktif ile temizlendiği bir kalp gösterir. derinlik film 4 Bölüm başına 6 mikron ile 136 mikron ve kalınlığı film 5 Bölüm başına 6 mikron ile 76 mikron.
Ek Film 6: CUBIC temizlenir geç Embry Görüntüleme. Kalp lümen kalp yüzeyinden; onic kalp Film 6 CUBIC tedavi E17.5 kalp (ROSA26-Konfeti Nfatc1-Cre) kesitlerini göstermektedir (Sağ indirmek için tıklayın). derinlik Bölüm başına 6 mikron ile 630 mikron.
Ek Film 7: CUBIC temizlenir geç embriyonik kalbi Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın). Film 7 3D rekonstrüksiyon yazılım aracılığıyla yeniden Movie 6 kalbin 3D yüzey resmini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
embriyo izolasyonu çok kritik bir adımdır. E9.5 embriyolar bu yüzden ekstra bakım izolasyonu sırasında embriyo / kalp yapıları zarar vermemek için alınmalıdır, boyutu çok kırılgan ve küçük. Bütün embriyo görüntüleme sırasında embriyo / kalbi saran olmayan embriyonik ekstra katmanları dikkatlice özellikle çıkarılmalıdır. Bu embriyonik dokularda derinliklerine antikor ve takas karışımı penetrasyon sağlar ve aynı zamanda görüntüleme arka plan sinyali giderilmesinde yardımcı olur. PECAM karşı antikorlar, asetile α-tübülin ve integrin ß1 dahil olmak üzere birden antikorlar incelenmiş ve başarılı bir şekilde 33 (veriler gösterilmemiştir) tespit edilmiştir. Bu moleküler bütünlüğü, hücresel bütünlüğü ve antijen uyumluluğu bu temizleme işlemi sırasında kesintiye olmadığını göstermektedir.
Geniş ağız transfer pipet (ucu kesilmiş) kullanılarak embriyo / kalbi aktarın. Bu işleme sırasında zarar görmesini engeller. GFP / YFP / RFP / CFP ifade desen ve nklonların umber dikkatlice tek yürek başına klon ya da herhangi bir diğer organlara etiket uygun dozajı belirlemek için kalbinde kaydedilmelidir. Nedeniyle Tamoksifen (10 ug / g), düşük doz, bazen kalp tüm klonlar ihtiva ya da klonları tespit etmek zor değildir. Nedenle, embriyo herhangi GFP / YFP / RFP / OBP klonlar olup olmadığını belirlemek için yolk sac kullanılması tavsiye edilir.
Embriyo veya kalp tespit aşırı tespitin altında tespitin zayıf boyanma neden olurken, yüksek arka planda neden olacağı için, kritik bir adımdır. Bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 2 st için E8.5-E10.5 bütün embriyo düzeltmek için tavsiye edilir. E11.5-E15.5 embriyolar için de, öneri dikkatle kalbi izole ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle% 4 PFA ile bunu düzeltmek için olduğunu. Bütün embriyo işleme eğer kalbi çevreleyen katmanları kaldırmak için olduktan sonra, E11.5- E13.5 embriyolar da oda sıcaklığında 3-4 saat sabit olabilir ama bu artan doku temizleme zaman gerektirir. E16.5-P1 (postnatalGün 1) Kalpler, bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca sabittir. Bütün embriyo sabitleme onlar kalp görüntüleme engel olarak, ön ve arka bacaklarda çıkarılmalıdır.
Örnekler Örnek Kurutma en aza indirmek için sintilasyon şişelerine le kübik ve Sca ile muamele edilmelidir. Sca le temizleme optimal 4 ° C'de yapılır ederken, 37 ° C'de kübik doku temizleme yöntemi ile örneklerin daha iyi temizleme gözlemledik. Görüntüleme sonra, numuneler 2-CUBIC veya Sca le 70 kısa vadeli saklanabilir. Numuneler her zaman floresan beyazlatma önlemek için alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır.
Embriyonik doku ve organlara daha az takas sürede sonuçlanır az lipid ve hücre dışı matriks birikimi var. Öte yandan, onlar takas reaktifleri daha yatkındır. temizleme reaktifler CFP RFP ve antikor konjugat söndürülmesi sonucu, doku yapısının ve antijen bütünlüğünü etkileyebilirkapı fluorofor. Bu nedenle, uzun fiksasyon kez söndürmeyi önlemeye olabilir. Daha önce rapor edildiği gibi 34 floresan proteinleri söndürme aynı zamanda kimyasal duyarlılık ve pH bağlı olabilir. Diğer kimyasal tarifleri, pH, fiksatif ve inkübasyon uzunluğu floresan proteinleri söndürme en aza indirmek için araştırılmalıdır.
Tüm organ veya doku transparentizing temizleme yöntemi hacimsel 3D görüntü devrim yarattı. Seri bölümlerin manuel 2D veya 3D rekonstrüksiyon dahil kardiyak morfolojilerinden önceki bir görüntüleme yöntemi, zaman alıcı ve enstrüman 5,6 zorlu olduğunu. 3D modeli oluşturmayla birlikte yüksek çözünürlüklü episcopic mikroskobu (HREM) fare kalp morfonogenezi nasıl uygulanabilir ve gelişmekte olan fare embriyo 35 trabeküler mimarisinin mükemmel anatomik bilgi sağlar edilebilir. Bununla birlikte, HREM fluoresc tanımlanmasına izin vermezent proteini, etiketlenmiş hücreler veya hücre 35 geri kalanından antikoru ile boyanmış hücrelerin. En az çaba ve yüksek maliyet etkinliği ile mevcut protokol, kullanarak, başarılı Sca le veya KÜBİK doku temizleme yöntemleri (- 3 Şekil 1) ile embriyonik kalbinde floresan sinyalleri korumuşlardır. Cre rekombinasyon olayları neden ve tüm embriyo içinde ve kalbinde bir kaç klonlar oluşturmak için Tamoksifen düşük dozda kombine (10 ug / g), bu sistem iz ve tek kalp progenitör hücre farklılaşması ve hücresel davranışları incelemek için kullanılabilir in vivo (Şekil 2A) 33. Buna ek olarak, Cre aracılı gen silme veya aşırı ifadesi ve Cre aracılı tek hücre etiketi ile birlikte, bu görüntüleme sistemi, kalp morfogenez boyunca fonksiyon veya projenitör hücre farklılaşması ve hücresel davranışı üzerindeki fonksiyon kazanma genetik kaybı çalışma uygulanabilir, ve böylece sağlam bir sağlar edilebilir st aracıkonjenital kalp etyolojilerini UDY.
Bu çalışmada kullanılan iki doku temizleme sistemleri Sca / e ve kübik daha embriyonik yaşta, doku kalınlığı ve doku temizleme zaman süresine dayalı sistemler ayırt olan farklı temizleme verimliliği gösterdi. Erken evre embriyolar E9.5-E10.5 için, Sca / e sistemi açık doku kılmakla kalmıyor ama KÜBİK tedavi embriyo çözülme sonuçlandı ederken de, floresan sinyalleri embriyo morfolojisi korumalı ve muhafaza. Bu ek aminoalkollerin sonucu ve kübik çözeltiler 8 Triton X-100 daha yüksek bir konsantrasyonu olabilir. Eski kalpleri için, Sca / e sistemi bile daha uzun bir kuluçka süresi ile tamamen dokuyu temizlemek için başarısız oldu. KÜBİK takas çözümü eski doku berrak (Şekil 3) render. Ancak, artan inkübasyon süresi, zayıf sinyaller ve sadece korunan endojen GFP sonuçlandı ederken RFP, OBP ve antikor konjuge sinyallerkaybolduk. Bu nedenle, kesim reaktifler ve daha inkübasyon süresi bir daha optimum tarifi floresan etiketler daha büyük bir yelpazede görüntü Kupa veya organları volümetrik için gerekli olacaktır.
Bu çalışma bir gelişmekte olan kalbin endotel / endokardiyal hücre işaretleyici PECAM bir bütün montaj boyama ile birlikte, iz etiket ve görüntü tek kalp klonlar olduğunu gösterdi. Bu sistemde PECAM ve DAPI tüm montaj boyama değil sadece bir kalbin içinde işaretli hücrelerin hücre tipleri ve hücre morfolojisi belirlemeye yardımcı olur, ama aynı zamanda kalp morfolojilerinden sırasında klonal desen, göç ve davranış çalışma sağlar. Şekil 2A biz OFT 8 hücreler içeren bir klon gözlenmiştir. Etiketleme zaman referansla bu klonun hücre mevcut sayısını kullanarak, hücre çoğalması hızı kolayca hesaplanabilir. Bu aynı sistemi kullanan başka bir çalışmada odaklı hücre bölünmesi desen ve MIGR tespittrabekülasyon işlemi 33 sırasında tek kardiyomiyosit bir tirme deseni. spatiotemporally etiketli kalp progenitör hücre farklılaşması üzerine fonksiyon veya fonksiyon kazanç genetik kaybının etkilerini incelemek amacıyla bu protokolün uygulanması, klonal desen ve hücresel davranış uygulanabilir ve genetik olarak doğuştan kalp kusurları etyolojisi çalışmalarda yardımcı olacak ve 3B bağlamda moleküler seviyede. Buna ek olarak, bu protokol, organ sistemlerinde morfojenezinin çalışma uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
