Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54424
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, National Taiwan University

Summary

עבודה זו מציגה שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. עם השיטה המוצעת, הניסוי כולו, כולל מניפולציה אגל וזיהוי של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד, יכול להתבצע ליד 23 מעלות צלזיוס ללא סיוע של מכשירים מתקדמים.

Abstract

שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד (MNP) בוצעה על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי על משטח פתוח. גישה זו לגילוי DNA colorimetric התבססה על גידול בתיווך הכלאה של בדיקות ננו-חלקיקים מזהב (בדיקות AuNP). גודל הצמיחה והתצורה של AuNP נשלטים על ידי מספר דגימות DNA כלאה עם הבדיקות. בהתבסס על התכונות האופטיות size- וצורה תלויה הספציפיות של החלקיקים, מספר אי התאמות ב קטע DNA במדגם של הבדיקות הוא מסוגל להיות מופלה. הבדיקות נערכו באמצעות טיפות המכילות חומרים כימי דגימות DNA בהתאמה, והוסעו מעורבים בפלטפורמת פנאומטי עם היניקה פנאומטי המבוקרת של הממברנה הידרופובי המבוססת PDMS הגמישה. טיפות ניתן לשלוח בו-זמנית ודווקא על-פני השטח פתוח על פלטפורמת פנאומטי המוצע, שהינו ביולוגית ללא EFF בצדect של דגימות DNA בתוך טיפות. שילוב שתי השיטות מוצעות, פולימורפיזם נוקלאוטיד רב ניתן לאתר ממבט על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי; שום מכשיר נוסף נדרש. ההליך להתקין הטיפין על הפלטפורמה לתוצאה הסופית לוקח פחות מ -5 דקות, הרבה פחות מאשר עם שיטות קיימות. יתר על כן, גישת זיהוי משולבת MNP זה דורשת נפח דגימה של רק 10 μl בכל פעולה, המהווה להפליא פחות מזו של מערכת מאקרו.

Introduction

פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP), אשר בדל בסיס-זוג אחד ברצף ה- DNA, הוא אחד הווריאציות הגנטיות הנפוצות ביותר. נוכחי מחקרים מדווחים כי SNPs קשור לסיכון למחלות, יעילות תרופה ואת תופעות לוואי של אנשים על ידי המשפיע תפקוד גן. 1,2 מחקרים שנעשה לאחרונה חשפו גם כי הוא בן שתים או ריבוי נקודות מוטציות (פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד) לגרום מחלות אדם מסוימות ההבדלים בהשפעות של המחלה. 3,4 הגילוי של פולימורפיזם נוקלאוטיד לכן חובה ב prescreening המחלה. שיטות פשוטות ויעילות עבור האיתור המהיר של oligonucleotides ספציפי רצף פותחו מאוד בשני העשורים האחרונים. 1,5 גישות נוכחיות לזהות מוטציות DNA בדרך כלל כרוכות הליכים, לרבות חוסר תנועה חללית, תיוג קרינה, ג'ל אלקטרופורזה, וכו ', 6,7 אבל שיטות אלה דורשים בדרך כלל תהליך אנליטי רב, expenציוד sive, טכנאים מאומנים היטב, וצריך משמעותי של דגימות ריאגנטים.

ננו-חלקיק עם יחס גדול של שטח פנים לנפח מאפייני physicochemical ייחודיים הוא חומר אידיאלי כפלטפורמת זיהוי רגישה וזולה מאוד עבור סמנים ספציפיים. חלקיקי זהב (AuNP) נמצאים בשימוש נרחב לגילוי DNA בגלל היכולת הגדולה שלהם כדי להיות שונה עם בדיקות oligonucleotide. 8-10 שיטות לזיהוי SNP פותחו גם באמצעות AuNP. 11-13 בעבודה זו אימצנו גישה colorimetric הרומן לזהות את פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד (MNP) באמצעות צמיחה הכלאה בתיווך DNA של בדיקות AuNP. 14 שיטה זו חיטוט פשוטה ומהירה מבוסס על התיאוריה כי אורכי מגוונת של דנ"א חד-גדילי (ssDNA) או פעמיים תקועים DNA (dsDNA) מצומדות כדי AuNP להשפיע על גודל צמיחה וצורה של AuNP (ראה איור 1). 15 שיטה זו של זיהוי DNAכולל צריכה קטנה של חומרים כימיים, משך assay קטן (כמה דקות), ואת הליך פשוט ללא בקרת תרמית כי ייושם לאבחון קליני סינון רפואי מקומי.

כמה מערכות microfluidic כדי לזהות את רצף הדנ"א פותחו; 16 אלה מערכות microfluidic, התפתחו פרוטוקולי ניסוי מסורתיים, נדרשו חתיכות פחות של ציוד בקנה מידה גדולה לפשט את פרוטוקולי הניסוי כדי לשפר את הרגישות, גבול גילוי וספציפי של ה- DNA biosensor. שיטות זיהוי DNA במערכות microfluidic עדיין דורשות, לעומת זאת, מכשירים של תהליך עקב כגון (תגובת שרשרת פולימראז) PCR מכונת הגברת אות קוראה קרינה עבור הודעה יחידה לזהות ה- SNP הטרוגנית. 17,18 פיתוח פשוט פלטפורמה ללא עיבוד לאחר להקריא את התוצאות ישירות של פולימורפיזם רב-נוקלאוטידרצוי מאוד. לעומת היטב בשימוש, קונבנציונלי, סגור מערכות microfluidic, מכשירי microfluidic-המשטח הפתוח מציעים מספר יתרונות באופן מבטיח, כגון נתיב אופטי ברור, דרך קלה לגשת המדגם, נגישות סביבתית ישירה ולא cavitation או חסימת interfacial נוצר בקלות הערוץ. 19 העבודה הקודמת שלנו שסללה פנאומטי פשוט מניפולצית אגל פתוח שטח (ראה איור 2). 20 על המשטח הזה, טיפות יכולות להיות מועברות זמנית מניפולציות בלי התערבות אנרגית נהיגה באמצעות כוח יניקה, אשר יש פוטנציאל גדול יישומים ביולוגיים וכימיים. פלטפורמה פנאומטי זה ובכך נוצל כדי לבצע מניפולציה של דגימות DNA לגילוי MNP בשילוב עם הגישה colorimetric באמצעות מושג הצמיחה הכלאה בתיווך DNA של בדיקות AuNP.

הפרוטוקול המובא במאמר זה מתארזיהוי ויזואלי פשוט של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי על משטח פתוח. עבודה זו מאשרת כי פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד ניתן לזהות בעין בלתי מזוינת; פלטפורמת פנאומטי המוצעת מתאימה ליישומים ביולוגיים וכימיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיטת זיהוי MNP

הערה: סעיף זה מתאר את ההליך לזהות את MNP מבוסס על הצמיחה בתיווך ההכלאה של חלקיקי זהב.

  1. הכן את ה- DNA בדיקה (5'-תיאול-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') פתרון בריכוז 100 מיקרומטר.
  2. הכן את החללית DNA-modified AuNP (בדיקת AuNP) חלקיקים. 21
    הערה: ההיקף משמש כאן תלוי הדרישה של בדיקת DNA-modified AuNP (בדיקת AuNP) חלקיקים. זה ומכאן תלוי במספר הניסויים להתנהל. אנחנו בדרך כלל להכין חלקיקים עודפים חללית AuNP כמו חסה. ההיקף המשמש את הפעולות הבאות הוא מתכוונן וגמיש.
    1. להוסיף DNA בדיקה (100 מיקרומטר, מוכן בשלב 1.1) לפתרון של חלקיקי זהב (13 ננומטר, 17 ננומטר) בריכוז 1 OD / מ"ל.
    2. תביא את הריכוז הסופי של סולפט dodecyl נתרן (12 NAC H 25 SO 4, SDS) חיץ פוספט (PBS) ל -0.01% ו 0.01 M, respectively.
    3. לאחר 20 דקות, ולהביא את הריכוז של נתרן כלורי (NaCl) כדי 0.05 מ 'עם פתרון של NaCl (2 מ') ו- PBS (0.01 מ '), תוך שמירה על SDS 0.01% ו דגירה במשך 20 דקות.
    4. להגדיל את ריכוז NaCl במרווחים של 0.1 M לריכוז סופי של 1 M מעל 20 מרווחי דקות.
    5. דגירה לילה עם רועד על מערבל מערבולת ב 23 ° C. המהירות הרועדת אינה משפיעה על הניסוי עוד דגימות דנ"א בדיקות AuNP להיות הכלאה.
    6. צנטריפוגה חלקיקי זהב ב 7,000 XG במשך 30 שניות ולהסיר supernatant.
  3. הוסף חלקיקים חלליים AuNP לתוך מים ללא יונים (מי DI) בריכוז של 25 ננומטר (פתרון בדיקת AuNP).
  4. הכינו דגימות DNA היעד (משלים מלא: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; שלושה בסיס-זוג תואמים: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'; שישה בסיס-זוג תואמים: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') בריכוזיםשל 0.06, 0.11, 0.17, 0.20, 0.30, 0.50 מיקרומטר, בהתאמה.
  5. הוסף פתרון בדיקה AuNP (6 μl, 25 ננומטר) לתוך דגימות DNA (350 μl) עם NaCl (14 מיקרומטר).
  6. לנער את התערובת של דגימות דנ"א בדיקות AuNP עם מערבל מערבולת ב 23 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור כלת DNA.
  7. לצמיחה AuNP, להוסיף NH 2 OH (6 μl, 400 מ"מ) HAuCl 4 (6 μl, 25.4 מ"מ) לפתרון (תערובת של דגימות דנ"א בדיקות AuNP). הצמיחה של AuNP לוקחת כ 30 שניות לסיום. השינוי הקבוע של צבע שומר יותר מ 1 hr.
    זהירות: עור ממגע עם HAuCl 4 עלול לייצר השפעות רעילות חמורות. יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. יש ללבוש כפפות ולהשתמש ארון קטר בעת שימוש HAuCl 4.

ייצור 2. של פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים

הערה: פלטפורמת מניפולצית אגל מבוסס PDMS מורכב משני מרכיבים: Pקרום DMS (100 מיקרומטר) עם משטח סופר-הידרופובי שכבת הערוץ-אוויר (5 מ"מ). ללא תהליך MEMS, תהליכי עיבוד משותף נוצלו כדי לפברק את המכשיר הזה, הכולל micromachining מחשב בקרה ספרתית (CNC) על ביצוע עובש, הליהוק PDMS ושכפול עבור אבי טיפוס ודגמים של רכיבים מיקרו-נוזליים ו micromachining לייזר עבור ייצור של משטח סופר-הידרופובי (ראה איור 3).

  1. השתמש מכונת CNC מצוידת מקדח (0.5 מ"מ) כדי לייצר תבניות הורים מבוססות PMMA (ראה איור 3) עם microstructures. השתמש מהירות ההזנה של המקדח 7 מ"מ / sec ו שיעור סל"ד סיבוב 26,000. השתמש במפוח אוויר ומי DI להסיר את פיסת PMMA ולנקות את פני השטח של תבניות ההורים.
  2. הכן תערובת של בסיס PDMS ואת סוכן הריפוי ב 10 יחס: 1. דג את התערובת בתוך תא ייבוש למשך 30 דקות, או עד שכל בועות האוויר יוסרו.
  3. יוצקים את PDMS לתוך הדואר עובש אמן ואופים PDMS עבור 3 שעות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור כדי להשיג את microstructures ההופכי של תאי אוויר (קרום PDMS) וערוצי אוויר (שכבת PDMS).
  4. הסר את שכבת PDMS מתבנית האב (ביד). פונץ 'חורים על שכבת PDMS עבור צריכת האוויר-אוויר יניקה.
  5. שים את הממברנה PDMS, שכבת PDMS ואת מצע הזכוכית לתוך התא של מערכת טיפול פלזמת חמצן. לאחר טיפול חמצן פלזמה, אג"ח קרום PDMS, שכבת PDMS ואת מצע הזכוכית יחד על פלטה חמה (90 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות.
  6. שים את השבב המשולב לתוך מכונת לייזר חיתוך (למעלה בצד הממברנה PDMS). ייבא את קובץ .dwg להגדיר ולסופר-הידרופוביות (15 מ"מ × 12 מ"מ). ראה איור 3. ישירות לחרוט את קרום PDMS עם מכונת -laser CO 2 כדי ליצור באזור סופר-הידרופובי על הממברנה PDMS (כוח 12 W, מהירות סריקה 106.68 מ"מ / sec).
  7. נקו את משטח הידרופובי עם מים די לשטוףמשם שאריות מפוחמים על פני השטח.
  8. חבר את הכניסה-יניקת אוויר משאבת ואקום דרך שסתום סולנואיד (ראה איור 4). חבר את שסתום סולנואיד למחשב ושליטה עם מודול USB דיגיטלי I / O.

3. מבצע איתור של MNP על פלטפורמת פניאומטיים

הערה: סעיף זה מתאר את הפעולה לזהות colorimetrically ומהר MNP על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי (ראה איור 5). כל הצעדים יתקיימו ב 23 ° C (טמפרטורת סביבה) ולחות יחסית 85%.

  1. מניחים את אגל דגימת DNA היעד (10 μl, 0.5 מיקרומטר) על אזור הידרופובי של פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי.
  2. מניחים את אגל החללית AuNP (10 μl, 25 ננומטר) על האזור הידרופובי של פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי.
  3. שליטת יניקת האוויר לגרום הסטייה של קרום PDMS עם שסתום סולנואיד ו סיתוכנית mple (למשל, Labview). ספק יניקה אוויר בתא אחד האוויר לאורך נתיב הגירה של טיפות (המכילים DNA היעד בדיקות AuNP בהתאמה) על הממברנה PDMS כך טיפות מתנגשים אחד עם השני להתגבש. השתמש בלחץ עבודה של משאבת ואקום של -80 kPa (מד לחץ).
    1. לחלופין, לשלוט יניקת האוויר ידני כל עוד רביב הוא מעורב באופן מלא. ביד, לחבר או לנתק את משאבת ואקום צריכת אוויר של אוויר עם צינורות בשלבים המוקדמים של בדיקה.
  4. שליטת יניקת האוויר לגלגל האגל המגובש קדימה ואחורה כדי לשפר את יעילות הערבוב במשך 3 דקות באמצעות מערכת השליטה של ​​שסתום סולנואיד. ה- DNA היעד בדיקות AuNP להיות מעורב היטב הכלאה בתוך 3 דקות. השתמש תדירות נהיגה, לחץ עבודה של 5 הרץ ו -80 kPa (מד לחץ), בהתאמה.
  5. מניחים אגל המכיל NH 2 OH (2 μl, 400 מ"מ) HAuCl4 (2 μl, 25.4 מ"מ) על אזור הידרופובי של פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי.
  6. שליטת יניקת האוויר (לוחץ מד -80 kPa) לתת הטיפין מתנגשות אחד עם השני מתמזג. לאחר מכן, שלט יניקת האוויר (5 הרץ ו -80 kPa מד לחץ) לתת גליל האגל המגובש קדימה ואחורה כדי לשפר את יעילות ערבוב דקות 1.
  7. מדוד ורשום את הצבע של רביב המגובש בעין בלתי מזוינת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעבודה זו, שלוש דגימות DNA נבדקו באמצעות שיטה פשוטה רומן של זיהוי באמצעות צמיחת ההכלאה בתיווך DNA של חלליות AuNP. הרצפים של DNA בדיקת דגימות DNA של שלושה סוגים, במיוחד, cDNA (מלא משלים בדיקת DNA), TMDNA (שלושה בסיס-הזוג DNA התואם), ו SixMDNA (שישה בסיס-הזוג DNA התואם) מופיעים בפרוטוקול צעד 1. חוסר ההתאמה אל החללית של דגימות DNA נבדקו כאן הן במגזרים באמצע דגימות DNA. איור 6 מראים את הצבעים של פתרונות AuNP הצמיחה של דגימות DNA בריכוז מגוון. עבור DNA להתאמה מושלמת (cDNA), הגוונים של פתרונות להשתנות מוורוד אינדיגו ואז לשקוף ככל שעלה ריכוז ה- DNA. לקבלת TMDNA, הצבע של פתרונות הולך מוורוד לסגול כהה ולאחר מכן אינדיגו, ועבור SixMDNA, צבע הולך מוורוד ורוד כהה עם הגדלת ריכוז ה- DNA. ההדים הנפרדים NA דגימות בעלי זיקות הכלאה מגוונות ל- DNA הבדיקה שגרם גודל גידול מגוון של AuNP וצבע ומגוון של פתרונות. מדגם TMDNA, עם שלוש מוטצית בסיס-זוג מן החללית, יש זיקת הכלאה פחות מדגם cDNA, אשר גרם גודל גידול קטן של AuNP. מאחר שהתוצאות במופע איור 6, יש הבדלים של צבע בין cDNA ודוגמאות TMDNA, במיוחד בריכוז ה- DNA גדול. באמצעות אי התאמות רבות עם החללית, מדגם SixMDNA יש זיקת הכלאה חלשה אל החללית, אשר הביאה כמה dsDNA מצומדות כדי AuNP, אפילו עם ריכוז ה- DNA יותר מ -0.2 מיקרומטר. גודל הצמיחה של AuNP הוא וכתוצאה מכך קטן במדגם SixMDNA זה, גרימת פתרון AuNP לשנות מוורוד Amaranth, אשר אינו נמדד מטבע דברים עם בעין בלתי מזוינת. בהתבסס על תמונות צבע, cDNA, TMDNA ו SixMDNA הם בערך הבדיל ריכוז דנ"א 0.11 כדי 0.50 מיקרומטר.

_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> עם פרוטוקולי שיטות שהוצגו כאן, פלטפורמת מניפולציה מבוססת אגל פשוט חדשנית מיקרופלואידיקה פתוח משטח הודגמה שימוש יניקת פנאומטי ככוח כדי ליצור את. עיוות פני שטח של קרום PDMS, תחבורת המניפולציה הקלילה של טיפות יכולה להיות מושגת ללא הפרעה אל ביו-המדגם, הדנ"א במקרה זה, בתוך הטיפין (ראה איור 7 א). הגילוי החדש והחזותי של MNP מודגם על זה פלטפורמה פנאומטי מניפולציה אגל פתוח השטח. כתוצאה מכך, כפי שמוצג באיור 7B, זיהוי של חוסר התאמה DNA הוא לצפות בקלות בעין בלתי מזוינת. במצב המקורי, אגל החללית AuNP הציג באדום. קליטת אופטי לכל היותר AuNP בדיקות מתרחשות ב 520 ננומטר, אשר מיוחס תהודת המשטח-plasmon (SPR). לאחר הכלאה עם טיפות דגימת DNA השונות, הדופלקס DNA היעד-הבדיקה של AuNP עם מלא ג DNA omplementary (cDNA) מדגם אגל הפך שקוף כמאפיין SPR של AuNP גדל נעלם. לעומת זאת, AuNP כלאה עם השלושה DNA התואמים-זוג בסיס (TMDNA) והשישה DNA תואמים בסיס-הזוג (SixMDNA) היו כחולים וסגולים בהתאמה. עם גישה זו, הפלטפורמה המוצעת השיטה לגילוי DNA משולבות והשיגו בצורה פשוטה.

איור 1
באיור 1. עקרון זיהוי colorimetric של MNP. ה- DNA חד גדילי-modified תיאול (ssDNA) או-גדילי כפול DNA (dsDNA) מן הכלאה של ssDNA-modified תיאול על AuNP השפיעו על גודל צמיחה וצורה של AuNP, וגרמו תכונות אופטיות מגוונות של AuNP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2. סכמטי בתרשים של פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. עם יניקת פנאומטי ככוח לגרום סטייה של הממברנה הידרופובי PDMS המבוססת הגמיש, האגל על הממברנה הופך מופעל ובכך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
ייצור איור 3. של פלטפורמה מניפולציה אגל פנאומטי. ייצור כלולים מחשב נומרית שליטה (CNC) micromachining, PDMS טכניקות הליהוק או שעתוק וביטול micromachining לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג largגרסה אה של נתון זה.

איור 4
איור 4. התקנה ניסיונית של פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי. משאבת ואקום שנוצר יניקה אוויר כדי לספק לחץ פחתה בתא אוויר לגרום סטיה של קרום PDMS עבור מניפולציה רביב. משאבת הוואקום ואת המפרצון של ערוץ אוויר מחוברים דרך שסתום סולנואיד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור סכמטי באיור 5. המבצע של הטכניקה זיהוי זה MNP. הטיפות המכילים DNA היעד ואת בדיקות AuNP נטענים על הרציף, מעורבות היבridized. האגל המכיל את שני NH 2 OH ו HAuCl 4 נטען על הרציף מעורבב לצמיחת AuNP. לבסוף, דופלקס DNA היעד-הבדיקה של AuNP העביר את המקסימום הקליט ושינה את הצבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. וריאציה של צבע של דגימות דנ"א שונים עם ריכוז. עבור ה- DNA משלימים מלא (cDNA), הגוונים של פתרונות להשתנות מוורוד לכחול כהה עם הגדלת ריכוז ה- DNA. לקבלת TMDNA, הצבע של פתרונות הולך מוורוד לסגול כהה, ועבור SixMDNA, צבע הולך מוורוד ורוד כהה עם הגדלת ריכוז ה- DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג את העדפתהגרסת ger של נתון זה.

איור 7
איור 7. תמונות של אגל על פניאומטית פלטפורמה.) תמונות סידור תחבורת אגל בפלטפורמת פנאומטי עם שליטה על ידי אוויר יניקה. B) תמונות של הדופלקס DNA היעד-הבדיקה המקבילה של AuNP על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי המוצעת. תנאי ההפעלה של תדירות הנהיגה ואת לחץ העבודה היו 5 הרץ ו -80 kPa (מד לחץ), בהתאמה. במצב המקורי, אגל חללית AuNP מפגין צבע אדום. הדופלקס DNA היעד-בדיקה של AuNP בנוכחות של cDNA היה שקוף. בדיקות AuNP כלאה עם TMDNA ו SixMDNA היו כחולות וסגולות בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, שיטה colorimetric פשוט לזהות MNP ניתן ליישם בריכוזים הנעים בין 0.11-0.50 מיקרומטר צינורות microcentrifuge. יתר על כן, שיטת הזיהוי המוצע MNP מתנהל על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי בעל פוטנציאל גבוה להקרנה DNA ויישומים ביו-רפואיים אחרים. בפועל, הטווח לזיהוי של ריכוז ה- DNA מדגם תלוי יעילות הערבוב של פלטפורמות ההפעלה. כדי להבטיח כי האגל המגובש הוא מעורב באופן מלא, השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא השליטה של ​​יניקת האוויר (לחץ ותדירות) כי תלוי בגודל של רביב המגובש. הפער של זיקת הכלאה בין הדגימה DNA משלימה לחלוטין ואת דגימת DNA התואם קשה להבחין בעין בלתי המזוינת עבור שבר רצף דנ"א ארוך. המגבלה של טכניקת זיהוי זה ומכאן אורך הקטע של DNA במדגם. לקבלת דוגמיות עם ארוך DNרצפים, הגדלים או קונפורמציה של AuNP הצמיחה דומים לאלה של דגימות DNA מגוונות המכילות חוסר התאמה שונה. חוסר ההתאמה של דגימות DNA כדי החללית להופיע במגזר באמצע בפרוטוקול זה. עם אורכים זהים חוסר התאמת homomeric של דגימת DNA, את המיקום של חוסר ההתאמה יכול להשפיע גם על זיקת ההכלאה וצמיחת גודל AuNP. מחלות רבות נמצאות לייחס כיום גנים פגומים בפרט. מאגרי המידע הגנום למחלות בפרט עדיין מרחיבים ושיפור. לאחר וריאצית רצף ה- DNA של קטע DNA הספציפי הוא אשר להיות אחראי למחלה ספציפית, החללית תוכננה במיוחד (עם אורך מתאים ומצבת חוסר התאמה של DNA) ניתן להשתמש כדי לרכוש את מספר ההתאמות של DNA מדגם בדיקה בטווח הריכוז לזיהוי על הבסיס נבדקה כבר בעבודה זו.

פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי המוצעת היא לבצעאד בסביבה פתוחה. התאדות טיפות מגביר את הריכוז של דגימות דנ"א ומשפיעה על דיוק את ההודעה colorimetric. כדי לשפר את הדיוק של ניתוח MNP, טמפרטורה ולחות סביבה מבוקרת נדרשות. micromachining הליזר יושם לפברק משטח סופר-הידרופובי במצע שהוצג. -הידרופוביות של קרום PDMS לא מתעקש תחת חזרות רבות של מניפולציה אגל (> 20 פעמים). ההפסד של הידרופוביות מקטין את הניידות ויכולת תמרון של פלטפורמת מניפולציה אגל זה. לאחר פלטפורמת מניפולציה אגל מאבד את הידרופוביות על פני השטח, remodifying-הידרופוביות של קרום PDMS (חזור על שלבים 2.6-2.8) נדרשת. הייצור הפשוט של משטח סופר-הידרופובי עמיד יותר נמצא תחת בצריך עיון. בפרוטוקול זה, השתמשנו שסתום סולנואיד תכנית שליטה פשוטה (עם ציוד רכישת נתונים) לשלוט היניקת אוויר דואר. השליטה של ​​יניקת אוויר יכולה להיות מנוצלת בדרכים אחרות או עם הציוד כולל אך לא רק, שימוש של שסתום סולנואיד.

בכתב היד הזה, הצגנו את השילוב של שיטת colorimetric פשוטה של ​​זיהוי DNA ופלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. טכניקות שניהם ייחודיות מאוד פוטנציאליים; לא מצאנו שיטה לגילוי DNA חלופית (כי הן מהירות וחזותי) כדי להשיג את אותן התוצאות. טכניקות מניפולציה אגל מספר על משטח פתוח כולל optowetting, 22 dielectrophoresis, 23 החשמלית, 24 actuation רטט 25 ו תרמוס-נימי 26 דווחו. החסרונות של כל טכניקות מניפולציה אגל אלה נדונו העבודה הקודמת שלנו. 20 הפלטפורמה פנאומטי המוצע הוא יותר ביולוגית מאשר בשיטות הנ"ל.

בטכניקה זו כדי לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד oפלטפורמה פנאומטי אגל מניפולציה נה היא פשוטה עבור חוקרים בתחום ביוכימיים, כלומר דגימות ריאגנטים ניתן לטעון ישירות ואסף עם טפטפות. השילוב של הפלטפורמה הציגה מתבצע עם מערכת בקרה אוטומטית עיצוב של ממשק המשתמש לשימוש משופר רחב בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning SYLGARD 184
benchtop engravers Roland DG EGX-400
laser cutting machine Universal Laser Systems, Inc. VLS 3.50
Oxygen plasma treatment system Femto Science Inc. Korea CUTE-MPR
solenoid valve home built
vacuum pump ULVAC KIKO, Inc. DA-30D
13-nm AuNP solution TAN Bead Inc., Taiwan NG-13
DNA (with 5'-end labeled thiol) MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS) UniRegion Bio-Tech,. Taiwan PBS001-1L
sodium dodecyl sulfate (SDS) J. T. baker 4095-04
Hydroxylamine solution (NH2OH) Sigma-Aldrich 467804
Chloroauric acid (HAuCl4) Sigma-Aldrich G4022
sodium chloride (NaCl)
vortex mixer Digisystem Laboratory Instruments Inc. VM-2000
centrifuge Hermle Labortechnik GmbH. Z 216 MK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
  2. Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
  3. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
  4. Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
  5. Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
  6. Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
  7. Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
  8. Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
  9. Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
  10. Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
  11. Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
  12. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
  13. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  14. Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
  15. Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
  16. Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
  17. Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
  18. Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
  19. Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
  20. Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
  21. Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
  22. Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
  23. Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
  24. Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
  25. Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
  26. Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).

Tags

גנטיקה גיליון 115 פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד (MNP) ננו-חלקיקים מזהב (AuNP) זיהוי colorimetric מניפולציה אגל פלטפורמה הידראוליות מערכות microfluidic פתוח השטח Bioengineering
החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C.… More

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C. J., Wang, T. M., Yang, J. T. The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform. J. Vis. Exp. (115), e54424, doi:10.3791/54424 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter