Summary
Detta arbete presenterar en enkel och visuell metod för att upptäcka flera nucleotide polymorphisms på en pneumatisk dropp manipulation plattform. Med den föreslagna metoden, hela experimentet, inklusive dropp hantering och spårning av fler nucleotide polymorphisms, kan utföras i närheten av 23 ° C utan hjälp av avancerade instrument.
Abstract
En enkel och visuell metod för att detektera fler nucleotide polymorphism (MNP) utfördes på en pneumatisk dropp manipulation plattform på en öppen yta. Detta sätt att kolorimetriska DNA detektion baserades på hybridisering-förmedlad tillväxt av guldnanopartiklar sonder (AuNP Probes). Tillväxt storlek och konfiguration av AuNP domineras av antalet DNA-prover hybridiserade med sondema. Baserat på de specifika storlek- och formberoende optiska egenskaperna hos nanopartiklar, är antalet felpassningar i ett prov-DNA-fragment till sonderna kunna diskrimineras. Testerna genomfördes via droppar som innehåller reagens och DNA-prover respektive, och transporterades och blandas på den pneumatiska plattform med kontrollerad pneumatisk sugning av den flexibla PDMS-baserade superhydrofoba membran. Droppar kan levereras samtidigt och just på en öppen yta på den föreslagna pneumatiska plattform som är mycket biokompatibla med ingen sida effect av DNA-prov inuti dropparna. Genom att kombinera de två föreslagna metoderna kan multi nucleotide polymorphism detekteras på sikt på den pneumatiska dropp manipulation plattform; ingen ytterligare instrument krävs. Proceduren från att installera de små dropparna på plattformen för att det slutliga resultatet tar mindre än fem minuter, mycket mindre än med befintliga metoder. Dessutom kräver denna kombinerade MNP detekterings tillvägagångssätt en provvolym av endast 10 ^ il i varje operation, som är anmärkningsvärt mindre än den hos en makro-system.
Introduction
Enbaspolymorfi (SNP), som är en enda baspars skillnad i en DNA-sekvens, är en av de vanligaste genetiska variationer. Aktuella studier rapporterar att SNP är förknippade med risk för sjukdom, drog effekt och biverkningar av individer genom att påverka geners funktion. 1,2 Nyligen genomförda studier visade också att två eller flera punktmutationer (multi-nucleotide polymorphism) orsaka vissa sjukdomar och individuell skillnader i effekterna av sjukdomen. 3,4 Upptäckten av nucleotide polymorphism är därför nödvändigt i prescreening sjukdom. Enkla och effektiva metoder för snabb detektion av sekvensspecifika oligonukleotider högt utvecklade under de senaste två decennierna. 1,5 Nuvarande metoder för att identifiera DNA-mutationer typiskt involverar förfaranden inklusive sond immobilisering, fluorescensmärkning, gelelektrofores, etc., 6,7 men dessa metoder kräver i allmänhet en lång analytiska processen, Expentande utrustning, välutbildade tekniker och betydande konsumtion av prover och reagenser.
En nanopartikel med ett stort förhållande av ytarea till volym och unika fysikalisk-kemiska egenskaper är ett idealiskt material som en mycket känslig och billig detektering plattform för specifika biomarkörer. Guldnanopartiklar (AuNP) används ofta för DNA-detektion på grund av deras stora förmåga att ändras med oligonukleotidsonder. 8-10 SNP detekteringsteknik har också utvecklats med hjälp av AuNP. 11-13 I detta arbete har vi antagit en ny kolorimetrisk metod för att detektera multi-nucleotide polymorphism (MNP) genom DNA-hybridisering-förmedlad tillväxt av AuNP prober. 14 Denna enkla och snabba sondering metod är baserad på teorin att olika längder av enkelsträngat DNA (ssDNA) eller dubbelsträngat DNA (dsDNA) konjugerat till AuNP påverka tillväxten storleken och formen av den AuNP (se Figur 1). 15 Denna metod för DNA-detektionhar en liten förbrukning av reagens, en liten analys varaktighet (några minuter), och en enkel procedur utan värmereglering som är framåtriktat gäller för klinisk diagnos och inhemska hälsoundersökas.
Flera mikroflödessystem för att upptäcka DNA-sekvensen har utvecklats, 16 de mikroflödessystem, utvecklats från traditionella experimentella protokoll, krävs färre bitar av storskalig utrustning och förenklat experimentella protokoll för att förbättra känsligheten, detektionsgräns och specificitet av DNA biosensor. Metoder DNA upptäckt i mikroflödessystem fortfarande kräver dock instrument en efterföljande process såsom PCR (polymerase chain reaction) maskin för signalförstärkning och en fluorescensläsare för en enda avläsning för att identifiera den heterogena SNP. 17,18 utveckla en enkel plattform utan efterföljande behandling för att direkt läsa ut resultaten av multi-nucleotide polymorphismär mycket önskvärd. Jämfört med väl använt, konventionell, slutna mikroflödessystem, den öppna ytan mikrofluidikanordningar lovande erbjuder flera fördelar, såsom en tydlig optisk väg, ett enkelt sätt att komma åt exemplet, en direkt miljö tillgänglighet och ingen lätt bildas kavitation eller gräns obstruktion kanalen. 19 Vårt tidigare arbete infört en enkel pneumatisk plattform för öppen yta dropp manipulation (se figur 2). 20 på denna plattform, droppar kan samtidigt transporteras och manipuleras utan inblandning från en drivande energi med hjälp av en sugkraft, som har en stor potential i biologiska och kemiska tillämpningar. Denna pneumatisk plattform var således utnyttjas för att exekvera manipulering av DNA-prover för MNP detektering i kombination med den kolorimetriska metod med hjälp av begreppet DNA-hybridisering-förmedlad tillväxt av AuNP prober.
Protokollet presenteras i detta dokument beskriveren enkel visuell detektion av flera nucleotide polymorphisms på den pneumatiska dropp manipulation plattform på en öppen yta. Detta arbete bekräftar att fler nukleotidpolymorfism är detekterbar med blotta ögat; den föreslagna pneumatiska plattform är lämpliga för biologiska och kemiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. metod för att upptäcka MNP
Obs: Detta avsnitt beskriver proceduren för att detektera MNP baserat på hybridisering-medierad tillväxt av guldnanopartiklar.
- Bereda sond-DNA (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') lösning vid en koncentration 100 pM.
- Förbered prob-DNA-modifierad AuNP (AuNP sond) partiklar. 21
Obs: Volymen som används här beror på kravet på prob-DNA-modifierad AuNP (AuNP sond) partiklar. Det är därmed beroende av antalet experiment som skall utföras. Vi förbereder typiskt överskott AuNP sondpartiklar som reservdelar. Den volym som används i dessa steg är justerbar och flexibel.- Lägg prob-DNA (100 ^ M, som framställts i steg 1,1) till en lösning av guldnanopartiklar (13 nm, 17 nM) vid koncentration 1 OD / ml.
- Bringa de slutliga koncentrationerna av natriumdodecylsulfat (NAC 12 H 25 SO 4, SDS) och fosfatbuffert (PBS) för att 0,01% och 0,01 M, respectively.
- Efter 20 min, bringa koncentrationen av natriumklorid (NaCl) till 0,05 M med en lösning av NaCl (2 M) och PBS (0,01 M) under bibehållande av SDS vid 0,01% och inkubera i 20 min.
- Öka NaCl-koncentrationen i steg om 0,1 M till en slutkoncentration av 1 M över 20 minuters intervall.
- Inkubera över natten med skakning på en vortex-blandare vid 23 ° C. Den skakhastighet påverkar inte experimentet så länge som DNA-proven och AuNP sonder blir hybridiserad.
- Centrifugera guldnanopartiklar vid 7000 xg under 30 sek och avlägsna supernatanten.
- Lägga AuNP sondpartiklar i avjoniserat vatten (DI vatten) vid en koncentration av 25 nM (AuNP sondlösning).
- Förbereda mål-DNA-prover (fullständigt komplementära: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; tre baspar inkompatibla: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'; sex baspar inkompatibla: 5'-CTTGCCT tttttt CCAGCTC-3 ') vid koncentrationerav 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 | iM, respektive.
- Lägg AuNP sondlösning (6 pl, 25 nM) i DNA-prover (350 mikroliter) med NaCl (14 ^ M).
- Skaka blandningen av DNA-prov och AuNP prober med en vortex-blandare vid 23 ° C under 5 min för DNA-hybridisering.
- För AuNP tillväxt, addera NH2OH (6 | il, 400 mM) och HAuCl 4 (6 | il, 25,4 mM) till lösningen (blandningen av DNA-prov och AuNP sonder). Tillväxten av AuNP tar ungefär 30 sek för slutförande. Den stadiga förändringen av färg bibehåller mer än en timme.
VARNING: Hudkontakt med HAuCl 4 kan ge allvarliga toxiska effekter. Kontakta materialsäkerhetsdatabladen (SDB) före användning. Vänligen bära handskar och använda ett dragskåp när HAuCl 4.
2. Tillverkning av en pneumatisk Dropp Manipulation Platform
Obs! PDMS-baserade dropp manipulation plattform består av två komponenter: en PDMS-membran (100 | im) med en super-hydrofob yta och en luftkanalskiktet (5 mm). Utan en MEMS process var de vanliga bearbetningsprocesser som används för att tillverka denna anordning, som innefattar dator numerisk styrning (CNC) mikrobearbetning för framställning av en form, PDMS gjutning och replikering för snabba prototyper av de mikrofluidiska komponenter, och lasermikrobearbetning för tillverkning av en super-hydrofoba ytan (se figur 3).
- Använd CNC-maskin utrustad med en borrkrona (0,5 mm) för att producera PMMA-baserade mästare formar (se figur 3) med mikrostrukturer. Använda en matningshastighet av borrkronan 7 mm / sek och en rotationshastighet 26000 rpm. Använd en luftfläkt och DI vatten för att avlägsna PMMA skrot och att rengöra ytan av master formar.
- Framställa en blandning av PDMS basen och härdaren i förhållandet 10: 1. Avlufta blandningen i en torkapparat under 30 minuter, eller tills alla luftbubblor avlägsnas.
- Häll PDMS i the mästare mögel och grädda PDMS för 3 h vid 60 ° C i ugnen för att erhålla de inversa mikrostrukturerna hos luftkamrarna (PDMS-membran) och luftkanaler (PDMS Layer).
- Avlägsna PDMS skiktet från masterform (för hand). Slå hål på PDMS lagret för luft-sug inlopp.
- Sätta PDMS membranet, PDMS skiktet och glassubstratet in i kammaren av det syre-plasmabehandlingssystemet. Efter syreplasmabehandling, binda PDMS membranet, PDMS skiktet och glassubstratet tillsammans på en värmeplatta (90 ° C) under 10 min.
- Sätt den sammansatta chip i laserskärmaskin (PDMS membran uppåt). Importera DWG-filen för att definiera superhydrofoba området (15 mm x 12 mm). Se figur 3. Direkt gravera PDMS-membran med en CO-2 Laser maskin för att skapa superhydrofoba området på PDMS-membran (effekt 12 W, avsökningshastigheten 106,68 mm / sek).
- Rengör superhydrofoba ytan med avjoniserat vatten för att tvättabort de förkolnade resterna på ytan.
- Anslut luft-insuget och vakuumpump genom en magnetventil (se figur 4). Ansluter magnetventilen till datorn och styrning med en digital I / O USB-modul.
3. Användning för detektion av MNP på Pneumatic Platform
Obs: Detta avsnitt beskriver operationen att identifiera kolorimetriskt och snabbt MNP på den pneumatiska dropp manipulation plattform (se figur 5). Alla steg äga rum vid 23 ° C (omgivningstemperatur) och den relativa fuktigheten 85%.
- Placera mål DNA-provet droppe (10 pl, 0,5 pm) på superhydrofoba område av pneumatiska dropp manipulation plattform.
- Placera AuNP sond droppen (10 pl, 25 nM) på superhydrofoba område av pneumatiska dropp manipulation plattform.
- Styra luft sugning för att orsaka att avböjning av PDMS-membran med en magnetventil och en simple program (t.ex. Labview). Tillhandahålla luft sug i varje luftkammare längs migreringsväg av dropparna (innehållande mål-DNA och AuNP sonder respektive) på PDMS membran så att dropparna kolliderar med varandra och förenas. Använda ett arbetstryck på vakuumpumpen av -80 kPa (övertryck).
- Alternativt styra luftinsug manuellt så länge som droppen är fullständigt blandat. Hand, ansluta eller koppla bort vakuumpumpen och vikar av luftkammare med rör i de tidiga stadierna av testning.
- Styra luft sugning för att rulla den koalescerade droppen framåt och bakåt för att öka blandningseffektiviteten i 3 min med användning av den kontrollerande system av magnetventilen. Mål-DNA och AuNP sonder blir väl blandad och hybridiserad inom tre minuter. Använda en drivfrekvens och ett arbetstryck på 5 Hz och -80 kPa (övertryck), respektive.
- Placera en droppe innehållande NH2OH (2 pl, 400 mM) och HAuCl4 (2 | il, 25,4 mM) på superhydrofoba område i den pneumatiska dropp manipulation plattform.
- Styra luftinsug (-80 kPa övertryck) för att låta dropparna kolliderar med varandra och smälter samman. styra sedan luftsuget (5 Hz och -80 kPa manometertryck) för att låta koalescerade droppvalsen framåt och bakåt för att öka blandningseffektiviteten i 1 min.
- Mäta och registrera färgen på den koalescerade droppen med blotta ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete har tre DNA-prover testades med användning av en enkel och ny metod för detektering genom DNA-hybridisering-förmedlad tillväxt av AuNP prober. Sekvenserna för prob-DNA och DNA-prover av tre slag, specifikt cDNA (helt komplementär för att sondera DNA), TMDNA (tre baspar felparad DNA), och SixMDNA (sex baspar felparad DNA) anges i protokoll steg 1. de felpassningar till sonden av DNA-proven som testades här är båda i mitten segment av DNA-proven. Figur 6 visar färgerna på tillväxt AuNP lösningar för DNA-prover vid varierande koncentration. För perfekt matchade DNA (cDNA), nyanser av lösningarna varierar från rosa till indigo och sedan till transparent med ökande DNA-koncentration. För TMDNA, färgen på lösningar går från rosa till mörkt lila och sedan till indigo, och för SixMDNA, färgen går från rosa till mörkrosa med ökande DNA-koncentration. Den separata D NA prover har varierande hybridiseringsbetingelser tillhörighet till prob-DNA som orsakade varierande tillväxt storlek AuNP och varierande färg lösningar. Den TMDNA provet med tre baspar mutation från sonden, har mindre hybridisering affinitet än cDNA provet, vilket orsakade en mindre tillväxt storlek AuNP. Som resultaten i figur 6 visar, finns det skillnader i färg mellan cDNA och TMDNA prover, speciellt vid ett stort DNA-koncentration. Genom många felparningar med sonden, har SixMDNA prov en svag hybridisering affinitet till sonden, vilket resulterade i ett fåtal dsDNA konjugerad till AuNP, även med den DNA-koncentration som är större än 0,2 ^ M. Tillväxt storlek AuNP ligger följaktligen liten i detta SixMDNA prov, vilket gör att AuNP lösning för att ändra från rosa till amarant, vilket inte är självklart mäts med en blotta ögat. Baserat på de färgbilder, cDNA, TMDNA och SixMDNA är ungefär differentierat för en DNA-koncentration från 0,11 till 0,50 ^ M.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Med protokoll och metoder som presenteras här, var en enkel och ny droppbaserade manipulation plattform för öppen yta mikrofluidik visat Använda pneumatiska sug som en kraft att generera. yta deformation av PDMS membranet, den enkla transport och hantering av små droppar kan uppnås utan avbrott i bio-provet, DNA i detta fall, i dropparna (se figur 7A). är nya och visuell detektering av MNP visat på detta pneumatiska öppen yta dropp manipulation plattform. som ett resultat som visas i figur 7B, är upptäckten av en DNA mismatch lätt observeras med blotta ögat. i det ursprungliga tillståndet, den AuNP sonden droppen uppvisade en röd färg. den högsta optiska absorptionen av AuNP prober inträffar vid 520 nm, vilket hänförs till en yta-plasmon resonance (SPR). Efter hybridisering med de olika DNA-provdroppar, målet-sond-DNA-duplex enligt AuNP med en fullt c omplementary DNA (cDNA) prov droppen blev transparent som SPR inslag i den ökade AuNP försvann. Däremot AuNP hybridiserade med tre baspar inkompatibla DNA (TMDNA) och sex baspar inkompatibla DNA (SixMDNA) var blå och lila respektive. Med denna metod, är den föreslagna plattform och metod för DNA-detektion kombineras och uppnås på ett enkelt sätt.
Figur 1. Princip för kolorimetrisk detektion av MNP. Den tiol-modifierade enkelsträngat DNA (ssDNA) eller dubbelsträngat DNA (dsDNA) från hybridisering av tiol-modifierad ssDNA på AuNP påverkade tillväxten storleken och formen av den AuNP, och orsakade olika optiska egenskaperna hos AuNP. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk beskrivning av pneumatiska dropp manipulation plattform. Med en pneumatisk sugning som en kraft för att orsaka en böjning av flexibla PDMS-baserade superhydrofoba membran, droppen på membranet blir därmed aktiveras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tillverkning av en pneumatisk dropp manipulation plattform. Tillverkningen ingår dator numerisk kontroll (CNC) mikro, PDMS gjutning eller replikeringstekniker, och lasermikrobearbetning. Klicka här för att se en larger version av denna siffra.
Figur 4. Experimentuppställning för den pneumatiska dropp manipulation plattform. Vakuumpumpen genereras en luft sug för att tillhandahålla en minskad trycket i luftkammaren och för att orsaka att avböjning av PDMS-membran för dropp manipulation. Vakuumpumpen och inloppet till luftkanalen är anslutna via magnetventilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Schematisk illustration av driften av denna MNP detekteringsteknik. Dropparna som innehåller mål-DNA och AuNP sonder lastas på plattformen, blandade och hybridized. Droppen innehållande både NH2OH och HAuCl 4 är laddad på plattformen och blandades under AuNP tillväxt. Slutligen, mål-prob-DNA duplex av AuNP skiftade absorptionsmaximum och ändrade färg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Variation av färg på olika DNA-prover med koncentrationen. För fullständigt komplementärt DNA (cDNA), nyanser av lösningarna varierar från rosa till indigo med ökande DNA-koncentration. För TMDNA, färgen på lösningar går från rosa till mörkt lila, och för SixMDNA, färgen går från rosa till mörkrosa med ökande DNA-koncentrationen. Klicka här för att se en larGER version av denna siffra.
Figur 7. Bilder av droppe på pneumatiska plattformen. A) Serie bilder av dropptransport på pneumatiska plattform med kontroll av luftsug. B) Bilder på motsvarande mål-prob-DNA duplex av AuNP om den föreslagna pneumatiska dropp manipulation plattform. Driftsförhållandena för drivfrekvensen och arbetstrycket var 5 Hz och -80 kPa (övertryck), respektive. I det ursprungliga tillståndet, uppvisar AuNP sonden droppen en röd färg. Målet-sond-DNA-duplex enligt AuNP i närvaro av cDNA var transparent. De AuNP sonder hybridiserade med TMDNA och SixMDNA var blå och lila respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, till en enkel kolorimetrisk metod upptäcker MNP kan genomföras vid koncentrationer som sträcker sig från 0.11-0.50 iM i mikrocentrifugrör. Dessutom är den föreslagna MNP detekteringsmetod genomförs på ett pneumatiskt dropp manipulation plattform som har en hög potential för DNA screening och andra biomedicinska tillämpningar. I praktiken den detekterbara intervallet för prov-DNA koncentrationen beror på blandningseffektiviteten av de operativplattformar. För att säkerställa att sammansmälta droppen är helt blandad, är det kritiska steget i detta protokoll kontroll av luftinsug (tryck och frekvens) som beror på storleken av den koalescerade droppen. Avvikelsen av hybridisering affinitet mellan det helt komplementära prov-DNA och den felparade prov-DNA är svårt att skilja med blotta ögat för en lång DNA-sekvensfragment. Begränsningen av denna detektionsteknik är därmed fragmentlängd av prov-DNA. För prover med lång DNA-sekvenser, de storlekar eller konformationen av tillväxt AuNP liknar dem av varierande DNA-prover innehållande olika felpamingar. De felpassningar av DNA-prov till proben visas i mellansegmentet i detta protokoll. Med identiska längder och homomeric felparningar av prov-DNA, kunde positionen av felparningar också påverka hybridisering affinitet och tillväxt storlek AuNP. Många sjukdomar är för närvarande på att spåras till speciella defekta gener. De genomdatabaser för särskilda sjukdomar fortfarande att utöka och förbättra. När DNA-sekvensvariation av det specifika DNA-fragment bekräftas att vara ansvarig för en specifik sjukdom kan den specifikt utformade sond (med en lämplig längd och obalans position DNA) användas för att förvärva det antal felpassningar av prov-DNA till sond inom den detekterbara koncentrationsområdet på grundval redan testats i detta arbete.
Den föreslagna pneumatiska dropp manipulation plattform är utföred i en öppen miljö. Avdunstning av droppar ökar koncentrationen av DNA-prover och påverkar riktigheten i den kolorimetriska avläsning. För att förbättra noggrannheten av MNP-analys, är en kontrollerad omgivningstemperatur och fuktighet krävs. Lasermikrobearbetning applicerades för att tillverka en superhydrofoba yta i den presenterade plattformen. Den superhydrophobicity av PDMS membranet inte kvarstår i många iterationer av dropp manipulation (> 20 gånger). Förlusten av superhydrophobicity minskar rörligheten och manövrerbarhet av denna dropp manipulation plattform. När dropp manipulation plattformen förlorar superhydrophobicity på ytan, remodifying den superhydrophobicity av PDMS membran (upprepa steg från 2,6 till 2,8) krävs. Den enkla tillverkningen av en mer hållbar superhydrofoba yta är under framtida övervägande. I detta protokoll använde vi en magnetventil och en enkel kontrollerande program (med datainsamlingsutrustning) för att styra the luft sug. Styrningen av luftsuget kan utnyttjas på andra sätt eller med utrustning, inklusive men inte begränsat till användning av en magnetventil.
I detta manuskript, introducerade vi en kombination av en enkel kolorimetrisk metod för DNA-detektering och en pneumatisk dropp manipulation plattform. Båda teknikerna är unika och mycket intressanta; vi hittade inga alternativ DNA detekteringsmetod (som är både snabb och visuell) för att uppnå samma resultat. Flera droppmanipuleringstekniker på en öppen yta, inklusive optowetting, 22 dielektrofores, 23 electrowetting, 24 vibration 25 och termos-kapillära manövrerings 26 har rapporterats. Nackdelarna med alla dessa droppmanipuleringstekniker diskuterades i vårt tidigare arbete. 20 Den föreslagna pneumatiska plattformen är mer biokompatibla än de förutnämnda metoderna.
Denna teknik för att upptäcka flera nucleotide polymorphisms ona pneumatiska dropp manipulation plattform är enkelt för forskare inom det biokemiska området, vilket innebär att prover och reagenser kan direkt lastas och samlas med pipetter. Integrationen av det presenterade plattformen nu genomförs med ett automatiskt styrsystem och en design av ett användargränssnitt för förbättrad och bred användning i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X.
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
