Protocol
这项研究是按照新加坡的机构动物护理和使用委员会（批准的协议没有。R15-0225）的国立大学。
1.手术动物模型的制备
- 血管插管
- 麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠（6 - 7周龄）称重（203±20）G用氯胺酮（37.5毫克/毫升）和甲苯噻嗪（5毫克/毫升）的鸡尾酒通过腹膜内（IP）注射（2毫升/千克） 。不要回顾一下针头或注射后注射器将其删除。
- 一旦动物被麻醉（趾捏证实），把它放在一个加热垫，以保持其体温在37℃。轻轻地刮在肩胛骨，前宫颈，小腹，内侧后腿和阴囊的头发。轻轻地克制使用胶粘纸带的腿。
- 采用显微剪刀，一边欣赏角度的，通过执行镊子所有外科手术立体显微镜。放置在一个抗穿刺托盘中的所有锋利的外科手术工具，以防止手术过程中受伤。
- 在进行切开前擦洗手术部位交替碘和70％乙醇3次。同花顺30 IU / ml肝素盐水解决方案的所有导管。
- 做一个1 - 使用一双手术剪过右颈静脉肩胛骨1.5厘米中线皮肤切口。钝性分离分离筋膜，露出颈静脉，用聚乙烯管（PE-50）充满利用5-0丝线缝合肝素盐水导管插入它。注入补充麻醉必要时（1/3到初始剂量的1/2，静脉内（IV））在整个手术和实验过程。
- 执行气管切开，以保持呼吸道通畅。做一个1 - 在颈前区有1.5厘米的切口。使用的聚乙烯管（PE-205）用2-0丝线缝合以固定导管代替导管插入气管。
- 监测血压通过在股动脉插管。使1 - 在后腿的左内侧表面1.5厘米切口。分离钝性分离股动脉。导管插入填充用5-0丝线缝合肝素盐水的聚乙烯管（PE-10）的股动脉。
- 提睾肌准备和流量可视化
- 将5-0丝线穿过阴囊的顶点来扩展它。使沿阴囊腹面切口。定期应用暖等渗溶液（37℃; pH 7.4）中到暴露的肌肉。
- 删除认真彻底周围结缔组织使用棉签。
- 通过提睾肌的顶点将5-0丝线缝合。切缝合线成相等长度的两件，并在每一侧打结。切两个节点之间的肌肉，并轻轻拉动缝线拉伸它到一个定制的透明有机玻璃平台。固定缝合年底到具有粘性的蓝色平台。
注：彻底清除周围结缔组织的是获得最佳图像对比度的关键。 - 重复步骤1.2.3至5〜6注视制成。小心取出使用高温烧灼附睾提睾肌。 Superfuse温暖等渗溶液到暴露肌肉，以防止组织的脱水。
- 围绕提睾肌，用纱布折叠块。盖上聚乙烯薄膜的露出肌肉。纱布片与薄膜形成浅盆保持为浸水显微镜物镜（ 图1A）温暖等渗溶液。
- 转移动物到一个活体显微镜（ 图1C）的动物阶段。动脉插管连接至连续压力监测（ 图1E）的一种生理数据采集系统。
- 保持肌肉TEMPERATURE在35℃下与附着在动物的平台（ 图1B）下方的加热元件。放置一个温度探头肌肉旁，以提供给加热元件（ 图1D）的功率控制器负反馈。
- 离开舞台上的动物15分钟以与环境平衡。
- 可视化的活体显微镜下血流40倍水浸泡的目的和长时间工作冷凝器。
- 选择无支链的小动脉（<60微米）的基础上的RBC芯之间的清晰图像的焦点和对比度，CFL和血管壁，以便聚焦显微镜上的血管的直径平面。旋转安装到显微镜垂直对齐血管壁的相机。
- 用的高速视频摄像机以3000 /秒的帧速率1秒记录血流量。保存所记录的视频作为未压缩的8位灰度AVI格式保存的图像质量。
注意：推荐3000帧/秒的最小记录帧速率，以确保所述CFL测量可生理动脉流动条件下每红细胞至少执行一次。 - 使用具有峰值发送一个蓝色滤色器在310 394纳米和光谱带通波长 - 510毫微米，以提高红细胞和血浆之间的对比度。
注：确保光谱通过从微观光源（100瓦卤素灯）蓝色的过滤器是低光照强度，以防止任何潜在的组织损伤。 - 在实验结束时，安乐死动物用戊巴比妥钠的过量。
2.图像分析
- 预处理的CFL宽度测量
- 打开MATLAB并运行“CFL_pre.m'文件。 （这和其他MATLAB文件可以在找到IP“>补充MATLAB归档）。
- 点击“打开文件”，选择视频文件进行分析。
- 调整“旋转”滑块垂直对齐血管壁。
注：用户可以通过选择“网格”单选按钮，显示该容器对准辅助网格线，并通过滑动“缩放”滑块来调整图像的缩放级别。 - 点击“确认编辑”按钮，确认船舶对齐。
- 点击“设置ROI作物”按钮来定义感兴趣区域（ROI）的区域。对准的图像将显示在一个弹出窗口。调整图像上的矩形目标，并双击以确认投资回报率。跳过此步骤如果不需要图像的裁切。
注意：仅包括在以分析从容器中的CFL宽度将ROI的单一容器中。点击“重置图片”按钮将图像恢复到其原来的形式，如果有必要。 - 点击9，提取图像“按钮，提取所有编辑的视频帧到连续的位图图像（8位灰度”BMP“格式）。所提取的图像可以具有相同的名称作为所选择的视频文件的文件夹中找到。
- CFL宽度的测量
- 打开MATLAB并运行“CFL_measure.m'文件。
- 点击“选择文件夹”，选择包含提取图像的文件夹。
- 单击包含图片的文件夹，然后单击“选择文件夹”。该文件夹中的第一个图像帧将会被加载，并在“灰度图像”面板中显示，随着“图像直方图”面板的灰色强度直方图一起。
- 从列表框中选择所需的图像帧进行分析，否则第一图像帧将被选中。
- 点击“查找容器壁”，以识别图像，其在该位置确定在内部容器壁，其中从暗光强度分布的峰过渡到点亮了两个像素。
- 检查'中值滤波器“以中值滤波应用到图像，以减少”椒盐“噪音。
- 检查'自动对比度'以数字方式调整图像强度，以提高图像对比度。
- 选择在列表框中自动确定阈值（τ）一个阈值化的算法，将所述灰度级分为两类 - 白像素与上述τ灰度级（CFL），并用下面τ灰度级（RBC芯）黑色像素。
注：另一种方法是，使用手动阈值，如果没有自动阈值处理算法提供了一个合适的图像阈值。点击“手动”单选按钮，调节滑块定义手动阈值。 - 为了测量宽度CFL的空间变化，在“像素分辨率”框中输入像素分辨率（分辨率这个实验装置为0.42微米/像素）。
- 点击“计算”按钮来获得CFL宽度的空间变化。点击“导出的.csv'的CFL宽度导出数据以表格的格式。
- 为了测量宽度CFL在沿着容器具体分析线的时空变化，点击“时空变化”单选按钮，然后输入帧速率信息（在本实验装置使用的帧速率为3000帧/秒）。
- 在'开始帧'和'末帧'盒，输入分别在第一帧和用于分析图像的最后一帧。
- 选择沿滑动“分析线”滑杆容器内的分析线的位置。确认分析线，这是双方“灰度图像”和“二值图像”上所示的位置。
- 点击“计算”，以获得CFL宽度的时间变化。 CLICK“导出的.csv'的CFL宽度导出数据以表格的格式。
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Representative Results
所述CFL 在体内的可视化很大程度上取决于动物的手术准备。因失血过多或延长手术时间可能使动物震惊和血流像差。使用加热垫以及手术和实验期间定制平台组织温度的维护也用于保持大鼠的生理条件的关键。通过在显微镜系统中使用一个100瓦的卤素灯，即使在实验结束时没有观察到明显的组织损伤。
图2A示出了通过在大鼠提睾肌无支链动脉，在那里可以红细胞芯和内部容器壁（ 图2C）之间可以观察到所述CFL一个典型的RBC流。在实验过程中这些部件之间的良好的对比度为确保CFL宽度测量的精度是至关重要的。图像分析的初始阶段涉及检测的内血管壁。通过获取在垂直于容器沿着分析线的光强度分布，该位置是在高峰，从暗过渡到超过两个像素（ 图2B）点亮近似。
作为RBC和紧凑型荧光灯具有不同的光透射率，在灰度级的差异可被细分为两类（二值图像）。然而，在图像的直方图的两个峰之间的精确阈值的识别可以通过图像质量差和对比度（ 图3A）的限制。为了提高红细胞和CFL，蓝色过滤器可用于（ 图3B）之间的对比。这也很明显在图4中，其中，所述红细胞芯的边界可以与使用蓝色滤光片的被更精确地确定。此外，阈值算法20-23的选择也可以影响所述CFL宽度的测量（ 图4）。它在图4A中是显而易见的，不同的阈值的算法的结果中识别不同的RBC芯边界，这可能又导致错误的CFL测量。为了更好地说明在图4B所述CFL宽度测量的阈值算法的影响，使用不同的阈值的算法获得所述CFL宽度的空间配置示于图5和表1中总结。
图 1： 活体显微系统和提睾肌准备 答：通过手术外置大鼠提睾肌乙：定制平台加热元件放置提睾肌，并在35℃ 下保持它的温度：用显微CUS系统tomized动物阶段和高速摄像机微循环血流量的提睾肌D中的可视化：负反馈温度控制器和电源E：生理数据采集系统持续压力监测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：图像处理的血管壁的位置和CFL宽度 A 的测定：。在动脉RBC流的典型灰度图像（血管直径= 52微米）B：沿着分析线光强分布（面板实线） C：沿容器CFL测量结果代表。该固体和虚线箭头表示RBC芯的内部容器壁和外边缘，分别（LWB＆RWB：左，右血管壁边界，LCB和RCB：左，右RBC核心边界） 点击此处查看该图的放大版本。
图3：。图像对比度增强与光学滤镜蓝色无（A）和蓝色滤镜（B）得到的灰度图像的图像直方图，请点击此处查看该图的放大版本。
FIGURE 4：。（：无蓝滤光片，底排（B）：用蓝色滤镜上排（A））使用RBC核心位宽使用五个不同的阈值分割算法RBC核心和血管壁图3叠加在灰度图像的边界决心（从左至右）大津的方法，最小值法，模间法，迭代选择方法（ISODATA）和模糊熵的阈值（Shanbhag）。在实线和虚线表示内血管壁和RBC核心的外边缘，分别为。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：CFL宽度的空间变化对应于图4b沿左CFL宽度（A）。和右（B）血管壁，分别。 （D：在血管直径的距离） 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：阈值和CFL宽度数据在图5 * P <0.001：从大津的方法显著差异。 †P <0.001：左差异显著。统计分析采用双尾配对t检验进行。
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Discussion
CFL宽度的测量是为了更好地理解微循环血流动力学是必不可少的。特别是，CFL宽度的测量已经在肠系膜6进行spinotrapezius 24和脑25微循环。 体内 CFL宽度的常规测量通过所记录的视频帧的人工检查仅限于估计。手动测量所需几个连续视频帧的平均肉眼识别红细胞核心和血管壁15,16的边界之前。在另一项研究中，异硫氰酸荧光素（FITC） -标记的RBC和罗丹明-B异硫氰酸（RITC）标记的血浆被用来确定在猫脑微血管25的平均CFL宽度。这些以前的测量方法是非常耗时的，需要为荧光标记，这限制了紧凑型荧光灯的Wi的空间和时间分辨率的附加步骤嗞嗞的测量。与此相反，由高速摄像机的记录耦合到有效图像分割和分析，这里展示的技术中允许与一个命令的空间分辨率（0.42微米）的紧凑型荧光灯的时空变化的定量小于一个红细胞的大小1/3000秒的时间分辨率。
提睾肌的正确的手术的准备是在确定的CFL宽度测量的精度是至关重要的。特别是，彻底去除相邻结缔组织是必不可少的，以确保在提睾肌微动脉的一个良好的聚焦。此外，测量的时间和空间分辨率取决于显微镜和照相机的规格。而较高放大倍数的物镜可提高空间分辨率，其降低的视场，而这又限制了获得的容器长度为量化CFL宽度的空间变化。因此，microscopiÇ配置可以根据本技术的具体应用进行修改。
图像分割为紧凑型荧光灯宽度测量的精确度的另一个重要因素。之间开发了各种技术，基于灰度直方图图像阈值提供了用于图像分割和分析了一个简单而有效的方法。因此，前景对象是从根据其灰度级的差的背景萃取。在理想的情况下，图像的直方图将双峰和在山谷底部的阈值是微不足道的。然而， 在体内实验图像并不总是表现出这种灰度级的配置文件。我们的结果表明图像质量和对比度如何可以影响图像的分割处理。使用的光学蓝色滤光片的显著增强了RBC和在动脉的血浆之间的对比度（ 图3），以及似乎applyin时是必不可少的克的CFL宽度测量不管算法（ 图4）基于直方图的阈值处理。这导致了明显的双峰图象直方图，它允许一个有效识别的阈值。然而，应该指出的是，即使是与来自体内图像获得双峰直方图的两个峰（局部极大值）非常不等方差和直方图的宽的山谷（局部最小值）仍可影响阈值选择（ 表1 ）。因此，适当的阈值算法的选择需要研究的基础上的图像质量和用户必须考虑每个阈值算法的局限性对在量化CFL宽度最好适用性。
作为所述CFL宽度很大程度上取决于流动条件，在整个实验过程中持续动脉压测量是至关重要的。为了确定局部流动条件下，血流的伪剪速率可以通过测量血液中的容器5的平均流速进行计算。
总之，对于外科手术制备大鼠提睾肌和这里所描述的定量图像分析的协议已被用来获取关于在体内 CFL宽度的动态变化的定量信息。在确保CFL宽度测量的精确度的主要挑战包括肌肉和图像分割，这两者已在上面讨论的正常手术准备。这种技术可容易地适用于其它微循环研究，以调查血液流变学和在各种生理和病理条件血流动力学像差。因此，这些研究结果有助于微血管的治疗方法和临床干预的未来发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
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