Protocol
이 연구는 싱가포르 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 된 프로토콜 없음. R15-0225)의 국립 대학에 따른다.
동물 모델 1. 수술 준비
- 선박 삽관
- 남성 흰쥐 마취 - 무게 (6 7 주)를 (203 ± 20) 복강을 통해 케타민 (37.5 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖) 칵테일 g (IP) 주입 (2 ㎖ / kg) . 바늘을 정리해 또는 주입 후 주사기에서 제거하지 마십시오.
- 동물이 마취되면 (핀칭 발가락으로 확인) 37 ℃에서의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치. 조심스럽게 견갑골, 전방 경부, 복부, 중간 뒷다리 및 음낭 주머니에 머리를 면도. 조심스럽게 접착 종이 테이프를 사용하여 다리를 억제.
- 미세 절제 가위와 직각 집게를 보는 동안을 사용하여 모든 수술 절차를 수행실체 현미경. 수술하는 동안 부상을 방지하기 위해 구멍 방지 트레이에있는 모든 날카로운 수술 도구를 놓습니다.
- 절개를 수행하기 전에 수술 부위를 교대 요오드, 70 % 에탄올로 3 회 문질러. 30 IU / ml의 헤파린 생리 식염수 용액으로 모든 카테터를 플래시합니다.
- 오른쪽 경정맥을 통해 수술 가위를 사용하여 견갑골에 1.5 cm 중간 선에 피부 절개 - 1을 만듭니다. 경정맥을 노출 무딘 절개하여 밴드를 분리하고,이를 폴리에틸렌 관 (PE-50) 5-0 실크 봉합사를 이용하여 헤파린 염수로 가득 cannulate. 추가 마취를 주입 할 때 필요한 (1/3 초기 용량의 1/2, 정맥 주사 (IV)) 수술과 실험의 과정을 통해.
- 기도 명백을 유지하기 위해 기관 절개술을 수행합니다. 전방 경추 지역에 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 대신에 카테터를 고정 2-0 실크 봉합사로 폴리에틸렌 관 (PE-205)를 이용하여 기관을 Cannulate.
- 혈압 모니터대퇴 동맥에 삽관을 통해. 뒷다리의 왼쪽 내측 표면에서 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 무딘 절개에 의한 대퇴 동맥을 분리합니다. 헤파린 염수 5-0 실크 봉합사를 이용하여 충전 된 폴리에틸렌 관 (PE-10)를 대퇴 동맥 Cannulate.
- Cremaster 근육 준비 및 흐름 시각화
- 를 확장하기 위해 음낭 주머니의 정점을 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 음낭 주머니의 복부 표면을 따라 절개를합니다. 노출 된 근육, 정기적으로 따뜻한 등장 성 용액 (pH 7.4의 37 ° C)를 적용합니다.
- 신중하고 철저하게 결합 조직을 둘러싸고있는 면봉을 사용하여 제거합니다.
- cremaster 근육의 꼭대기를 통해 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 같은 길이의 두 조각으로 봉합사를 잘라 양쪽에 매듭을 묶어. 두 매듭 사이의 근육을 잘라 조심스럽게 봉합을 잡아 당겨 사용자 정의 투명한 플렉시 글라스 플랫폼에 그것을 스트레칭. 고치다블루 압정와 플랫폼 상에 봉합사의 끝.
참고 : 결합 조직을 주변의 철저한 제거는 최적의 이미지 대비를 얻는데 매우 중요하다. - 5 ~ 6 고착이 이루어 될 때까지 단계를 반복 1.2.3. 조심스럽게 고온 소작을 사용하여 부고환에서 cremaster 근육을 제거합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해 노출 된 근육에 따뜻한 등장 솔루션을 Superfuse.
- 거즈의 접힌 부분과 cremaster 근육을 둘러싸고 있습니다. 비닐 막을 노광 근육 커버. 영화와 함께 거즈 조각 물 침수 현미경 목표 (그림 1A) 따뜻한 등장 솔루션을 보유 얕은 분지를 형성한다.
- 생체 내에 현미경 (그림 1C)의 동물 무대에 동물을 전송합니다. 지속적인 압력 모니터링 (그림 1E)에 대한 생리 학적 데이터 수집 시스템에 동맥 삽관을 연결합니다.
- 근육 temperat 유지동물 플랫폼 (그림 1B) 아래에 부착 된 발열체와 35 ° C에서 URE. 발열체 (도 1D)의 전력 제어기에 네거티브 피드백을 제공하도록 근육 옆에 온도 센서를 배치했다.
- 15 분은 환경과 평형을 무대에 동물을 둡니다.
- 40 배의 물 액침 대물 긴 작동 응축기와 생체 내에 현미경 혈류 시각화.
- 분지 세동맥 적혈구 코어 사이에 명확한 이미지 초점 및 콘트라스트에 기초하여 (<60 μm의)을 선택 CFL 및 용기 벽이 순서 혈관의 직경 평면 현미경을 집중한다. 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 현미경에 장착 카메라를 돌립니다.
- 1 초 동안 3000 / 초의 프레임 레이트로 고속 비디오 카메라를 사용하여 혈액의 흐름을 기록한다. 이미지 품질을 보존하기 위해 비 압축 8 비트 그레이 스케일 AVI 형식으로 녹화 된 영상을 저장한다.
노트: / 초 3000 프레임의 최소 기록 프레임 레이트는 CFL 측정 생리 동맥 흐름 조건 하에서 적어도 한번 RBC 당 수행 될 수 있도록 권장한다. - 적혈구와 플라즈마 사이의 대비를 향상시키기 위해 510 나노 미터 - 310에서 394 nm의 스펙트럼 대역의 파장에서 최대 전송과 푸른 필터를 사용합니다.
참고 : 현미경 광원 (100 W 할로겐 램프)에서 파란색 필터를 통과하는 빛의 스펙트럼이 잠재적 인 조직 손상을 방지하기 위해 낮은 조명 강도의 확인하십시오. - 실험의 끝에, 펜토 바르 비탈 나트륨의 과량으로 동물을 안락사.
2. 이미지 분석
- CFL 폭 측정 전처리
- MATLAB을 열고 'CFL_pre.m'파일을 실행합니다. (이 다른 MATLAB 파일은 찾을 수 있습니다IP "> 기업 MATLAB 보관.)
- 분석 할 비디오 파일을 선택하려면 '파일 열기'를 클릭하십시오.
- 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 '회전'슬라이더를 조정합니다.
주 : 사용자는 '격자에'버튼을 선택하여 용기 정렬 어시스트 그리드 라인을 표시하고, '축소'슬라이더를 밀어 화상의 줌 레벨을 조정할 수있다. - 용기 정렬을 확인하는 '확인 편집'버튼을 클릭합니다.
- 관심 (ROI)의 영역을 정의하려면 '설정 ROI 작물에 대한'버튼을 클릭합니다. 정렬 된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지에 직사각형 목표를 조정하고 두 번 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 이미지 자르기가 필요하지 않은 경우이 단계를 건너 뜁니다.
참고 : 전용 용기로부터의 CFL 폭을 분석 할 수있는 ROI에서 하나의 용기를 포함한다. 필요한 경우, 원래의 형태로 이미지를 복원 할 '재설정 이미지'버튼을 클릭합니다. - 클릭9 ''(BMP '형식 연속 비트 맵 이미지를 8 비트 그레이 스케일)에 모든 편집 된 비디오 프레임을 추출 버튼'이미지의 압축을 풉니 다. 추출 된 이미지는 선택된 비디오 파일과 동일한 이름을 가진 폴더에 있습니다.
- CFL 폭 측정
- MATLAB을 열고 'CFL_measure.m'파일을 실행합니다.
- 추출 된 이미지가 들어있는 폴더를 선택 '폴더 선택'을 클릭합니다.
- 이미지가 들어있는 폴더를 클릭하고 '폴더 선택'을 클릭합니다. 폴더의 첫 번째 이미지 프레임을로드하고 '이미지 히스토그램'패널에서의 회색 강도 히스토그램과 함께 '그레이 스케일 이미지'패널에 표시됩니다.
- 분석, 그렇지 않으면 제 1 이미지 프레임이 선택 될을 수행하는리스트 박스에서 원하는 영상 프레임을 선택한다.
- 위치에 결정되는 이미지의 내부 용기 벽을 식별하는 '선박 벽 찾기'를 클릭 곳어두운 빛 강도 프로파일 피크 천이 두 픽셀 위에 점등한다.
- '소금과 후추'소음을 줄이기 위해 이미지에 중간 필터를 적용하는 '중간 필터'를 선택합니다.
- 이미지 대비를 강화하기 위해 디지털 이미지의 강도를 조절하는 '자동 명암 조정'을 선택합니다.
- τ 위의 그레이 레벨 (CFL), 그리고 τ 아래의 그레이 레벨 (RBC 코어) 블랙 픽셀 화이트 픽셀 - 두 개의 클래스로 계조를 분할하는 자동 임계 값 (τ)을 결정 목록 상자에서 임계 알고리즘을 선택합니다.
참고 : 자동 - 임계 알고리즘 중 어느 것도 적절한 이미지 임계 값을 제공하지 않는 경우 다른 방법으로, 수동 임계 값을 사용합니다. '수동'라디오 버튼을 클릭하고 수동 임계 값을 정의하는 슬라이더를 조정합니다. - (해상도는 CFL 폭의 공간 변화를 측정하고 '픽셀 해상도'상자에 픽셀 해상도를 입력하려면이 실험 장치와 0.42 μm의 / 픽셀)이었다.
- CFL 폭의 공간 변화를 얻기 위해 '계산'버튼을 클릭합니다. 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보내려면 '내보내기 .CSV'을 클릭합니다.
- 프레임 속도 정보, 선박 따라 특정 분석 라인의 CFL 폭의 시간적 변화를 측정하고 '시간 변화'라디오 버튼을 클릭하고 입력하려면 (이 실험 장치에서 사용되는 프레임 속도를 3000 프레임 / 초였다).
- 각각 '프레임 시작'과 '마지막 프레임'상자의 첫 번째 프레임과 분석을위한 이미지의 마지막 프레임을 입력합니다.
- '분석 선'슬라이드 막대를 밀어 혈관을 따라 분석 라인의 위치를 선택합니다. '그레이 스케일 이미지'와 '바이너리 이미지'에 모두 설명되어 분석 라인의 위치를 확인합니다.
- CFL 폭의 시간적 변화를 얻기 위해 '계산'을 클릭합니다. CLICK '내보내기 .CSV'는 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
생체 내에서 CFL의 시각화 동물의 수술 준비에 크게 의존한다. 과도한 혈액 손실 또는 확장 수술 시간은 충격과 혈류 수차 동물 대상이된다. 가열 패드뿐만 아니라 수술 실험 기간 동안 맞춤형 플랫폼을 사용하는 조직의 유지 온도는 래트의 생리적 조건을 유지하기위한 중요하다. 현미경 시스템에서, 100 W 할로겐 램프를 사용하여 식별 할 수있는 조직 손상도 실험의 끝에서 관찰되지 않았다.
도 2a는 CFL의 RBC 코어와 내부 용기 벽 (도 2c) 사이에 관찰 될 수 래트 cremaster 근육에서 분지 세동맥을 통한 전형적인 RBC 흐름을 나타낸다. 실험 기간 동안 이들 구성 요소 사이의 적절한 콘트라스트 CFL 폭 측정의 정확성을 보장하기위한 중요하다. 이미지 분석의 초기 단계가 포함내부 용기 벽의 검출. 용기에 수직 분석 라인을 따라 광 강도 프로파일을 취득하여, 위치는 다크 행 천이 개의 화소 (도 2b) 위에 불 해당 피크에 근사한다.
적혈구 및 CFL 다른 광선 투과율을 가지고 같이 그레이 레벨의 차이는 두 개의 클래스 (이진 화상)으로 세분 될 수있다. 그러나, 화상 히스토그램의 2 개의 피크 사이의 정확한 문턱 값의 식별은 불량한 화질 및 콘트라스트 (도 3a)에 의해 제한 될 수있다. 블루 필터를 사용할 수있는 적혈구 및 CFL (그림 3B) 사이의 대비를 향상시킬 수 있습니다. 이렇게하는 RBC 코어의 경계가보다 정확하게 블루 필터를 사용하여 식별 될 수 있으며,도 4에서 또한 알 수있다. 또한, 임계 값 알고리즘 20-23의 선택도 CFL 폭의 측정에 영향을 미칠 수있다 (도4). 그것은 서로 다른 임계 값 알고리즘, 확인 된 다른 RBC 코어 경계에 이어진도 4a에 알 수있는 수 잘못된 CFL 측정에 차례 리드한다. 더도 4b에서 CFL 폭 측정의 임계 값 알고리즘의 영향을 설명하기 위해 서로 다른 임계 알고리즘을 이용하여 얻어진 CFL 폭에 대한 공간 정보는도 5에 도시되고 표 1에 요약되어있다.
. 그림 1 :. 생체 내에 현미경 시스템 및 Cremaster 근육 준비 A :. 수술로 표면화 쥐 cremaster 근육 B하십시오 cremaster 근육을 배치하고 35 ° C의 온도에서 온도를 유지하기위한 가열 요소와 사용자 정의 플랫폼 : 기분이야와 현미경 시스템연속적인 압력 모니터링 생리 데이터 수집 시스템 :. 네거티브 피드백 온도 조절기 및 전원 공급 E :. 상기 cremaster 근육 D에서 미세 순환 흐름의 가시화 동물 단계 고속 카메라 tomized. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :.. 세동맥의 RBC 흐름의 전형적인 그레이 스케일 이미지 (혈관 직경 = 52 μm의) B : 분석 선을 따라 빛의 강도 프로파일 (패널 A의 실선) 선박 벽 위치 및 CFL 폭 (A)의 결정에 대한 이미지 처리 . C : 혈관을 따라 CFL 측정의 대표적인 결과입니다. 그만큼고체 점선 화살표는 각각 RBC 코어의 내부 용기 벽과 외주를 나타낸다. (LWB & RWB는 : 왼쪽과 오른쪽 혈관 벽 경계, LCB 및 RCB는 : 왼쪽과 오른쪽 RBC 코어 경계) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :.. 광학 블루 필터와 이미지 콘트라스트 향상 (A)없이 청색 필터 (B)로 얻은 그레이 스케일 이미지의 이미지 히스토그램 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figur전자 4 :.. (: 블루 필터를 사용하지 않고, 아래 줄 (B) : 블루 필터 상위 행 (A))를 사용을 RBC 코어 폭은 다섯 가지 형 임계 값 알고리즘 RBC 코어와 그림 3에서 그레이 스케일 이미지에 중첩 혈관 벽의 경계를 사용하여 결정 오쓰의 방법, 최소 방법, 인터 모드 방법, 반복 선택 방법 (ISODATA) 및 퍼지 엔트로피 임계 값 (Shanbhag) (왼쪽에서 오른쪽으로). 고체 및 점선은 내부 용기 벽과 RBC 코어의 바깥 쪽 가장자리를 표시, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : CFL 폭의 공간 변화 왼쪽을 따라 4B 그림에 해당하는 CFL 폭 (A).우측 (B) 혈관벽 각각. (D : 혈관 직경의 거리) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 그림 5. *의 P <0.001에서 임계 값 및 CFL 폭 데이터 : 오오 츠의 방법과 유의 한 차이. † P <0.001 : 왼쪽에서 유의 한 차이. 통계 분석은 양측 짝 t-테스트를 사용하여 수행 하였다.
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Discussion
CFL 폭의 측정은 미세 순환의 혈류 역학의 이해에 필수적이다. 특히, CFL 폭의 측정은 장간막 6에서 수행되어, 24, 25 microcirculations 대뇌를 spinotrapezius. 생체 CFL 폭의 측정은 종래의 녹화 된 비디오 프레임의 수동 검사 추정치로 제한 하였다. 수동 측정은 시각 RBC 코어 및 용기의 벽 (15, 16)의 경계를 식별하기 전에 몇 개의 연속적인 비디오 프레임의 평균화가 필요했다. 또 다른 연구에서, 형광 염료 (FITC)가 적혈구 -labelled 및 로다 B의 isothiocynate은 (RITC) 표지 된 플라즈마는 고양이 대뇌 미세 혈관 (25)의 평균 CFL 폭을 결정하는 데 사용 하였다. 이러한 이전의 측정 방법은 매우 시간 소모적이며, CFL 위스콘신의 공간 및 시간 해상도를 제한하는 형광 표식에 대한 추가 단계가 필요DTH 측정. 대조적으로, 효과적인 이미지 분할 및 분석 고속 카메라 레코딩을 결합하여, 여기에서 입증 된 기술은 작은 RBC 및 크기보다 주문의 공간 해상도 (0.42 μm의)와 CFL의 시공간 변동의 정량을 허용 1 / 3,000 초의 시간 해상도.
cremaster 근육의 적절한 수술 준비가 CFL 폭 측정의 정확성을 결정하는데 중요하다. 특히, 인접한 결합 조직의 완전한 제거는 cremaster 근육의 소동맥의 좋은 초점을 보장하기 위해 필수적이다. 또한, 측정의 공간적 해상도는 현미경과 카메라 사양에 의존한다. 높은 배율 목적은 공간 해상도를 향상시킬 수 있지만, 그것은 차례로 CFL 폭의 공간적 변화를 정량화하기 위해 수득 용기의 길이를 제한하는 시야를 감소시킨다. 따라서, microscopiC 구성은 기술의 특정 어플리케이션에 따라 변경 될 수있다.
이미지 분할은 CFL 폭 측정의 정확도에 대한 또 다른 중요한 인자이다. 개발 된 다양한 기술 중에서도, 그레이 레벨 히스토그램에 기초하여 화상 임계 값은 영상 분할 및 분석을위한 간단하고 효과적인 방법을 제공한다. 따라서, 전경 오브젝트는 자신의 계조 차이에 기초하여 상기 배경으로부터 추출된다. 이상적인 경우, 화상 히스토그램이 바이 모달되며 계곡의 바닥에서 임계 값은 간단하다. 그러나 생체 내에서 실험 이미지는 항상 같은 그레이 스케일 수준의 프로파일을 나타내지 않는다. 우리의 결과는 이미지 품질 및 콘트라스트의 이미지 분할 처리에 영향을 미칠 수있는 방법을 보여준다. 광 청색 필터의 사용은 현저하게 (도 3) 적혈구 및 세동맥의 플라즈마 사이의 콘트라스트를 개선하고, 그 때 applyin 필수적인 것으로 보인다g없이 알고리즘 (도 4)의 폭 CFL 측정 히스토그램 기반 임계. 이것은 하나의 유효 문턱 값을 식별 할 수있는 고유 한 쌍봉 화상 히스토그램을 초래한다. 그러나, 심지어 생체 이미지에서 얻어진 바이 모달 히스토그램 두 피크 (로컬 최대 값)의 매우 불균등 분산 히스토그램 다양한 밸리 (극소)가 여전히 임계 선택 (표 1에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다 ). 따라서, 적절한 임계 값 알고리즘의 선택 검사 화상 품질에 기초해야하고 사용자 CFL 폭 정량화에 가장 적합 각 임계 값 알고리즘의 제한 사항을 고려한다.
CFL 폭이 유동 상태에 크게 의존하는 바와 같이, 실험 과정에 걸쳐 연속 동맥압 측정이 필수적이다. 로컬 유동 조건을 결정하기 위해,혈류의 pseudoshear 레이트 혈관 (5) 내의 평균 유속을 측정함으로써 계산 될 수있다.
요약하면, 래트 cremaster 근육 및 여기서 설명 정량적 화상 분석 수술 준비를위한 프로토콜은 생체 내에서 CFL 폭의 동적 변동에 대한 정량적 정보를 얻기 위해 사용되어왔다. CFL 폭 측정의 정확성을 보장하는 주요 과제는 상기 언급 한 둘의 근육 및 이미지 세분화, 적절한 수술 준비를 포함한다. 이러한 기술은 용이 hemorheological 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상황에서 혈역학 수차를 조사하기 위해 다른 미세 연구에 적용 할 수있다. 따라서,이 연구 결과는 미세 혈관 치료 방법 및 임상 개입의 미래 발전에 기여한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
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