Summary
Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.
Introduction
Kanker is een van de meest genetisch heterogene groep van ziekten, waarvan de incidentie en sterfte neemt drastisch toe, vooral onder ouderen wereldwijd. Cancer afkomstig klonaal uit een tumor-initiërende cel die inherent tumor suppressor mechanismen ontsnapt en verdeelt uit de hand. De geleidelijke toename van de genetische laesies die gezamenlijk het stimuleren van groei, proliferatie en de beweeglijkheid, terwijl het remmen van de dood en differentiatie transformeert de eerste goedaardige begroeiing in een zeer kwaadaardige, metastatische en dodelijke tumor. Gebleken is dat naast genetische veranderingen, tumorprogressie veranderingen nodig in de omliggende stroma en overspraak tussen tumortypes en verschillende celtypes (bijvoorbeeld fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) in de micro-omgeving. Het begrijpen van de moleculaire principes die ten grondslag liggen kwaadaardige transformatie, inclusief de tumor-stroma interacties is van groot belang voor de ontwikkeling van Preventie en vroege screeningsstrategieën, alsmede nieuwe en effectieve behandelingen voor kanker en metastase geneesmiddelresistentie bestrijden.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een aantrekkelijk systeem voor kankeronderzoek 1-4 dankzij zijn snelle generatie tijd geworden, opmerkelijke behoud van de signalering knooppunten tussen vliegen en de mens, beperkte genetische redundantie en de rijkdom van geavanceerde genetische tools die manipulatie van bijna elk gen in te vergemakkelijken een tijdelijk en ruimtelijk beperkte wijze. Genetische gedefinieerde tumoren van verschillende maligniteit kan reproduceerbaar worden gemanipuleerd in Drosophila door de invoering gain en verlies-van-functie mutaties in een subset van voorlopercellen in een overigens wildtype weefsel met behulp van de techniek MARCM 5. De MARCM gereedschap combineert FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Erkenning Target) gemedieerde mitotische recombinatie 6 met FLP-out 7 en Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 doelwit genexpressiesystemen 9. Met deze werkwijze expressie van een-UAS gebaseerde transgene, waaronder oncogeen of fluorescerend eiwit cDNA's of geïnverteerde DNA repeats voor dsRNA-geïnduceerde genuitschakeling, wordt beperkt tot een kloon van cellen die een specifieke genetische locus en een Gal4 repressor door recombinatie verloren (Figuur 1A). Klonen plekken gemarkeerd met green fluorescent (GFP) of rood fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, RFP, DsRed, mCherry) kan eenvoudig worden gevolgd tijdens de ontwikkeling, geïsoleerd en geanalyseerd. Belangrijker is dat hun gedrag rechtstreeks vergeleken met de aangrenzende wildtype weefsel. Zo vragen relevant zijn voor de cel autonome als niet-autonome effecten van genetische laesies kunnen gemakkelijk worden bestudeerd. Soortgelijke zoogdieren, alleen klonen waarin meerdere oncogene laesies combined maligne Drosophila worden en herhalen belangrijkste kenmerken van kankercellen van een zoogdier. Ze overproliferate, ontwijken apoptose, induceren ontsteking, onsterfelijk en Invasive uiteindelijk het doden van de gastheer 10-17.
Hier beschrijven we een protocol om genetisch bepaald klonale tumoren in het oog / antennaal en hersenweefsel van Drosophila larven te genereren met behulp van de MARCM techniek. De werkwijze berust op een MARCM tester materieel dat de gist FLP recombinase onder de controle van de enhancer ogenloze (eyFLP) 18,19 uitdrukt. Op deze wijze worden gemerkt GFP klonen gegenereerd in zowel peripodial en cilindrisch epitheel van de EAD en neuro-epitheel van de hersenen tijdens de embryonale en larvale stadia (Figuur 1A, B en referentie 20). Klonen kunnen eenvoudig worden gevolgd tot volwassenheid als EAD zich ontwikkelt tot de volwassen oog, antenne en het hoofd capsule, terwijl de neuroepithelium aanleiding geeft tot neuroblasts dat gedifferentieerde optische kwab neuronen produceren.
Uitgebreide moleculaire, functionele en fenotypische karakterisering van het mozaïek weefsel, we de te vergemakkelijkenschrijver een protocol voor dissectie van de EAD en hersenen van de derde instar larven en een beschrijving te verwerken voor drie verschillende toepassingen: (i) het opsporen van transgene fluorescente reporters en immunokleuring, (ii) kwantificering van tumor invasiviteit en (iii) analyse van genexpressie verandert met een kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) of high-throughput sequentiebepaling mRNA (mRNA-seq) (Figuur 1C).
De immunokleuring protocol kan worden gebruikt om een eiwit van belang te visualiseren met een specifiek antilichaam. Transgene fluorescerende transcriptionele reporters bieden handige en nauwkeurige tijdruimtelijke gegevens over de activiteit van een bepaalde signaleringsroute. Cel-afstammingslijn specifieke reporters, anderzijds, tijdens kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in celpopulaties binnen de mozaïek weefsel en bij tumoren van verschillende genotypes. Kwantificering van invasieve gedrag maakt de vergelijking van tumor maligniteit tussen genotypes. Ten slotte is het protocol beschrijft inzameling en verwerking van mozaïek EAD voor RNA-isolatie is geschikt voor zowel kleine als grote schaal downstream-toepassingen zoals reverse transcriptie gevolgd door qRT-PCR en genoom-brede mRNA-seq, respectievelijk. De kwalitatieve en kwantitatieve gegevens verkregen uit deze testen leveren nieuwe inzichten in het sociale gedrag van klonale tumoren. Bovendien produceren ze een solide basis voor functionele studies over de rol van individuele genen, genetische netwerken en tumor micro-omgeving in verschillende stadia en aspecten van tumorigenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Dit werk maakt gebruik van de eyFLP1; handeling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, bad-GAL80 MARCM 82B Green tester lijn 11. De oversteek van de MARCM 82B Green tester maagden om mannetjes van stammen zoals w; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B mut genotype zal nageslacht waarin mitotische recombinatie zal optreden tussen de rechter armen van de 3 e homologe chromosomen opleveren. Zo zal klonen homozygoot mutant gen c distaal aan de FRT82B plaats binnen de hersenen EAD en neuro-epitheel worden gegenereerd. Deze klonen zullen GFP, transgene en een dsRNA voor gen-b (Figuur 1A) uit te drukken. Diverse eyFLP-MARCM tester lijnen voor recombinatie op de X, 2L, 2R, 3L en 3R zijn vastgesteld en beschikbaar zijn binnen de vlieg gemeenschap.
1. Fly Handling, Kruisen en Staging
- Vouw de juiste MARCM tester voorraad bij kamertemperatuur door bevolken meerdere bottles tegelijkertijd. Flip de volwassenen in de frisse flessen om de 2-3 dagen, zodat genoeg maagden kan worden verzameld voor de volgende kruisingen.
LET OP: Bij het verzamelen van maagden, voorkomen dat er een langdurige blootstelling aan CO 2, omdat dit afbreuk doet vrouwelijke vruchtbaarheid. - Afhankelijk van de omvang van het experiment opgezet vlieg kruisen in flesjes gebruikmaking van ten minste 10 MARCM tester maagden en 4 mannen (bijvoorbeeld voor beeldvorming van fluorescente reporters en immunokleuring) of flessen met tenminste 30 maagden en 10 mannen (bijvoorbeeld voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit).
- Raise nakomelingen bij 25 ° C onder een lange dag 16 uur / 8 uur licht-donker cyclus. Flip ouders in nieuwe flesjes / flessen elke 24 uur tot reproduceerbare enscenering van larven te vergemakkelijken en overbevolking te voorkomen.
LET OP: Vanaf dag 6 na de eileg (AEL), de late derde instar controle larven stop voeden, beginnen dwalen en voer verpopping. In contrast, kan het begin van de larvale-popstadium overgang worden degelegd of non-existent in larven EAD richting hyperplastische of kwaadaardige tumoren klonale.
2. Verzamelen Derde Instar Larven
- Voor immunokleuring, laat ongeveer 20 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een tang om voorzichtig plukken larven uit het flesje of blikje en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit, laat tenminste 80 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een spuit fles PBS spuiten in een fles vlieg met larven totdat het oppervlak is bedekt.
- Verzachten de bovenste lagen van voedsel met een spatel en giet het eten mash met larven in een petrischaal. Met behulp van een tang voorzichtig plukken larven en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met PBS.
- Was larven met PBS until alle overgebleven voedsel wordt verwijderd. Inspecteer de larven onder fluorescerende stereomicroscoop met 8 tot 16x vergroting voor alle "luipaard larven" die willekeurige GFP-positieve plekjes in het larvale lichaam (Figuur 2A, 2B en zie discussiedeel) dragen ontdoen.
Opmerking: Voor RNA-isolatie, zoals een na laatste wasstap in 70% EtOH gedurende 1 min. - Plaats het schaaltje met geselecteerde larven in PBS op ijs tot dissectie. Proces larven binnen 30 minuten om de negatieve gevolgen van koude en honger te voorkomen.
3. Dissectie van Larven
- De EAD ontleden onder een stereomicroscoop Gebruik een pincet om voorzichtig op het midden van de larven tegen de glazen schaal bodem. Met de tweede tang, pak de larvale mond haken en trek ze uit de buurt van het lichaam (figuur 2C).
LET OP: De trekkracht is vaak voldoende om de optische stengels aansluiten van de EAD pai brekenr naar de hersenen lobben. Als de hersenen of onderdelen aangesloten blijven EAD en hun aanwezigheid niet gewenst voor verdere toepassingen, stuurde de optiek stengels met behulp van de twee paar pincetten. Voor invasieve tumoren (bv ras V12 Scrib 1) wordt de verbinding tussen EAD en de hersenen lobben steeds verduisterd met de tijd door de begroeiing en het migreren van klonale cellen.- Om de EAD / brein complex met een intacte ventrale zenuw kabel (VNC) (Figuur 2D) voor te bereiden, een tang om een larve te snijden in het midden van het lichaam. Gooi de achterste helft.
- Houd de voorste helft van het larvale lichaam tussen de uiteinden van een tang, draai de larve binnenstebuiten door de knop in de mond haken met de punt van de tweede tang en het rollen van de cuticula over het met de tang eerste paar.
- Met behulp van een tang verwijder zorgvuldig alle vreemde weefsels (bv speekselklieren, vet lichaam, en darm), terwijl de EAD pair ofde EAD / hersenen complex aangesloten op de mond haken. Ontwarren de mond haken van de bovenliggende opperhuid. Bevrijd de VNC door het doorsnijden van de axonale uitsteeksels aan het lichaam spieren en epidermis (figuren 1B, 2C, 2D).
LET OP: De mond haken zorgen voor een veilige manipulatie van het weefsel met een pincet en efficiënter zinken en gemakkelijke herkenning van het weefsel tijdens het wassen te vergemakkelijken. Ontleed EAD verandering morfologie relatief snel bij bewaring niet vastgelegde in PBS. Beperk de dissectie tijd om 20-30 min. - Om het weefsel over te dragen, jas een P20 micropipet tip door pipetteren de resterende lichaam karkassen een paar keer op en neer. Om de grotere EAD / brain complexen over te dragen, snijd de P20 micropipet tip met een schaar.
OPMERKING: De bekledingswerkwijze is kritisch om plakken en verlies van ontleed weefsel tijdens overdracht te voorkomen. Gebruik van een micropipet P20 minimaliseert de overdracht PBS in fixeeroplossing, ongewenste beperkende verdunning.- Voor immunokleuring, overdragende EAD ontleed in een 0,5 ml buis gevuld met 400 ui 4% paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel. Gebruik 1,5 ml buis met 1 ml PFA voor groter EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve.
LET OP: PFA is zeer giftig. Draag beschermende handschoenen en kleding. contact met de huid, ogen of slijmvliezen. - Voor RNA-isolatie overdragen ontleed EAD in een nieuwe glazen schaal gevuld met koude PBS. Gebruik een tang om schoon te maken EAD uit de ring en de lymfeklieren, om te proeven verontreinigingen te minimaliseren.
- Maak de EAD uit de mond haken door het doorsnijden van de verbinding tussen de antenne-schijven en de mond haken behulp van een tang (figuur 2E). RNA degradatie en genexpressie artefacten te voorkomen, beperken de dissectie tijd 30 min. Ga verder met stap 7.
LET OP: Een ervaren onderzoeker kan ongeveer 60 larven ontleden in 30 min met uitzondering van de tijd die nodig is voor larven verzamelen en wassen. Totaal RNA opbrengsten zijn afhankelijk van de EAD grootte die variëren tussen genotypen en developmentÃl fasen. Dissectie van 80-100 controle EAD pairs uit de late derde instar larven moeten 5-8 ug totaal RNA opleveren.
- Voor immunokleuring, overdragende EAD ontleed in een 0,5 ml buis gevuld met 400 ui 4% paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel. Gebruik 1,5 ml buis met 1 ml PFA voor groter EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve.
4. Fixing, Immunokleuring en Montage
- Fix monsters PFA fixatief 25 minuten onder Tuimelschijfmeter bij kamertemperatuur. De fixatietijd kan worden verlengd tot 60 minuten zonder dat weefselmorfologie en de antigeniciteit van eiwitten.
- Verwijder het fixeermiddel en spoelmonsters met PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) drie keer gedurende 10 minuten met een nutator. Gebruik voldoende volume PBST voor elke wasstap (400 ul / 0,5 ml buisje).
OPMERKING: Vaste EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve niet immunokleuring niet nodig. GFP signaal blijft goed zichtbaar na fixatie. Ga verder met stap 4.4 voor de finale dissectie.- Voor immunokleuring, blok weefsel in 200 ui van een blokkeeroplossing (PBST met 0,3% BSA) gedurende 20 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Incubate met primary antilichamen verdund in 100 ul van een blokkerende oplossing overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Raadpleeg primair antilichaam datasheet of gepubliceerde literatuur voor de aanbevolen antilichaam verdunning.
LET OP: De primaire antilichaam verdunning zou moeten worden geoptimaliseerd. - Na vijf 10 minuten wassen in PBST, vlek weefsel met fluorescerende secundaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing onder zacht schudden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in het donker.
- Spoelmonsters driemaal 10 min in PBST.
- Incubate met primary antilichamen verdund in 100 ul van een blokkerende oplossing overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Raadpleeg primair antilichaam datasheet of gepubliceerde literatuur voor de aanbevolen antilichaam verdunning.
- Voor immunokleuring, blok weefsel in 200 ui van een blokkeeroplossing (PBST met 0,3% BSA) gedurende 20 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Vervang PBST met 500 ui DAPI-kleuroplossing. F-actine label, voeg phalloidin geconjugeerd aan een fluorescente kleurstof DAPI-kleuroplossing. Na 15 min nutatie in het donker, weefsel eenmaal wassen gedurende 10 minuten met PBST.
LET OP: F-actine labeling kan onafhankelijk van DAPI kleuring worden uitgevoerd. - Voor de laatste stap dissectie, transfer weefsel terug in een PBS-gevulde glazen schaal met een 1 ml piPette. Met behulp van de twee paar tang clip uit de mond haken.
- Scheid de hersenen die worden gebruikt voor het kwantificeren van invasiviteit van de EAD door het snijden van de optische stengel zo overwoekerd EAD kan de analyse belemmeren.
- Een druppel van de montage medium (15 gl van een 22 mm x 22 mm dekglaasje) op een objectieve dia. Met behulp van forceps tips, verdelen het medium in een dunne laag. Transfer EAD, hersenen of de EAD / brein complexen in de montage medium met een P20 micropipet.
- Gebruik de tang tips of een wolframstaaf om weefsel te verspreiden en strek de VNC op de dia.
- Om de vorming van bellen tijdens het monteren, eerste aanraking een rand van een dekglaasje aan het fixeermiddel en vervolgens langzaam op het fixeermiddel met behulp van forceps voorkomen. Gebruik kleine stukjes filtreerpapier of tissue veeg om overtollige fixeermiddel absorberen rond dekglaasje randen.
LET OP: DABCO / Poly (vinyl alcohol) 4-88 montage medium verhardtbij 4 ° C binnen een uur. Dia's kunnen worden bewaard maanden bij 4 ° C.
5. Confocale Imaging
- Verwerven enkele confocale secties en stapels met behulp van een confocale microscoop met 20X, 40X en 60X olie doelstellingen.
- Voorkom pixel verzadiging. Gebruik hetzelfde beeld acquisitie parameters zoals beeldresolutie, laser input power, gain, offset, kader middeling, een stap grootte in een z-serie en deze instellingen voor alle genotypes te voeren, zodat voor vergelijkingen van pixel intensiteiten tussen verschillende genotypen 21,22.
LET OP: Voor de visualisatie van EAD / hersenen complex, het genereren van maximale projecties en steek respectieve, naburige beelden. Voor de uiteindelijke beeld voorbereiding, gebruiken na de beeldverwerking software voor paneel montage en om de helderheid en het contrast aan te passen.
6. Kwantificering van Tumor Invasiviteit
- Definieer een scoresysteem dat de verschillende tumor invasivenes zal kenmerkendis gezien het ruimtelijk patroon van invasie en het aantal GFP-positieve cellen zich naar de hersenen en VNC. Bereid evaluatie platen voor documentatie (figuur 3A).
- Mount tenminste 80 vaste intacte hersenen voor elk genotype op een dia via 40 gl van het fixeermiddel per 24 mm x 50 mm dekglaasje.
- Om onpartijdige scoring mogelijk te maken, vraag dan een neutrale partij bij de dia's anonimiseren, zodat de scoring procedure is onpartijdige. Evalueer geanonimiseerde dia's door twee lab leden onafhankelijk van elkaar. Openbaren genotypes pas na de telling is voltooid.
- Evalueer de mate van maligniteit door een blinde scoring van gemonteerde hersenen onder een tl-stereomicroscoop uitgerust met een GFP filter set. Gebruik een marker om de hersenen die al zijn bekeken om dubbeltellingen (Figuur 3B) te vermijden labelen.
- Bereken het percentage van de hersenen die in elk van de gedefinieerde invasieve categorieën per genotype. Bepaal de statistische significance met behulp van een chi-kwadraattoets (figuur 3C).
7. RNA isolatie, DNase behandeling en Kwaliteitscontrole
Opmerking: Alle reagentia (oplossingen, plasticware) van de volgende stappen moeten vrij van RNase activiteit. Draag altijd handschoenen en gebruik maken van een chemische kap voor het werken met organische oplosmiddelen.
- Breng de schone EAD met een gecoate P20 micropipet tip in 1,5 ml buis.
- Laat weefsel zinken naar de bodem van de buis, verwijder PBS en vervangen door 100 ul RNA lysisreagens (voldoende voor 140 EAD).
- Lyse weefsel door vortexen. Op dit punt kunnen de monsters bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C of direct verwerkt met het standaard RNA-isolatie-protocol.
LET OP: Monsters van gelijke genotypen uit meerdere dissectie rondes kan één keer worden samengevoegd in RNA-lysis reagens. - Vul het monstervolume tot 0,9 ml met RNA lysis reagens. Voeg 0,2 ml chloroform en meng monsters vigorously gedurende 15-20 sec.
- Na 2-3 minuten incubatie bij kamertemperatuur gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Transfer kleurloze bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis zonder interfase verstoren. Blijf weg van de tussenfase als het proteïnen en genoom DNA bevat.
Opmerking: Het teruggewonnen volume moet ongeveer 60% van het volume van RNA lysis reagens gebruikt voor homogenisatie zijn. - Precipiteren het RNA door toevoeging van 0,5 ml isopropylalcohol. Vortex en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en was de RNA pellet eenmaal met 600 ui 75% ethanol. Na een korte vortex en centrifugatie (10.000 x g gedurende 7 minuten bij 4 ° C) leggen alle ethanol en laat de RNA pellet drogen gedurende 5-10 min plaatsen van de open buis op een schone tissue afvegen.
LET OP: Het RNA pellet kan zichtbaar als een klein ondoorzichtig / wit st zijnrijp op de bodem van de buis of onzichtbaar. De resterende ethanol druppels kunnen voorzichtig worden verwijderd met P10 micropipet tip. - Ontbinden RNA in 50 ul van DEPC-behandeld water door vortexen of het doorgeven oplossing een paar keer door middel van een pipet tip.
- Om contaminatie met genomisch DNA minimaliseren, behandel totaal RNA met DNase door toevoeging van 50 pl van een mengsel dat 1 ul DNase (2 U / pl) en 10 pl 10X DNase buffer in DEPC-behandeld water. Vortex en spin down.
- Incubeer monsters bij 37 ° C in een waterbad of verwarmingsblok gedurende 30 tot 40 minuten. Na incubatie, voeg 100 pl DEPC-behandeld water in elk monster.
- De enzymatische activiteit en schone RNA inactiveren van DNase, voeg 200 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) oplossing, vortex gedurende 1 min en gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Breng voorzichtig de bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis. Voeg gelijk volume (200 pl)chloroform, mix en herhaal het centrifugeren stap van boven.
- Verzamel zorgvuldig de bovenste fase en RNA te precipiteren door toevoeging van 1/10 volume 3 M natriumacetaat, pH 5,2 bereid in DEPC H2O en 2,5 volumina 100% ethanol. Meng goed door vortexen.
Opmerking: Het toevoegen 0,5 ui glycogeen (20 ug / ul) een precipitatie mengsel helpt om de RNA pellet visualiseren. RNA te minimaliseren, gebruiken gesiliconiseerd, low-bindende 1,5 ml microcentrifugebuizen. - Precipiteren RNA bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
LET OP: De incubatie kan worden uitgevoerd 's nachts uitgevoerd. Monsters bij -80 ° C geplaatst ook. - Pellet RNA door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Was en droog pellet volgens de beschrijving in 7.9.
- Ontbinden RNA in 10-15 pi DEPC-behandeld water. RNA opslag bij -80 ° C.
- Bepaal hoeveelheid en zuiverheid van RNA door het meten van OD bij 230 nm, 260 nm en 280 nm met een spectrofotometer. Bereken RNA concentration door toepassing van de conventie die 1 OD bij 260 nm gelijk aan 40 ug / ml RNA.
OPMERKING: De A 260/280-verhouding van "zuivere" RNA gelijk aan 2,0, terwijl A 260/230-verhouding dient in het traject van 2,0-2,2. RNA-monsters met een A 260/280 verhouding tussen 1,7 en 2,0 zijn geschikt voor verdere toepassingen zoals cDNA-synthese. Voor de bereiding van mRNA-bibliotheken seq de kwaliteit en kwantiteit van RNA gecontroleerd worden door middel van een geautomatiseerd elektroforesesysteem. De 28S / 18S verhouding moet hoger zijn dan 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het potentieel van de eyFLP-MARCM techniek om GFP gemerkt stukken gedefinieerde genotypen in Drosophila EAD genereren demonstreren, werden drie klonen geïnduceerd: (1) controle expressie alleen GFP, (2) maligne tumoren tot expressie een oncogene vorm van de kleine G-proteïne Ras (Ras V12) in een achtergrond van homozygote verlies van een tumorsuppressorgen scribble (Scrib 1) en (3) begroeiing maar niet-invasieve ras V12 Scrib 1 JNK DN-klonen, waarbij de Jun-N-terminale kinase (JNK) werd geïnactiveerd door expressie van haar dominante-negatieve vorm (Figuur 4, tabel 1 voor genotypes). Aangetoond is dat de invasiviteit van ras V12 Scrib 1 klonale tumoren vereist afwijkende activering van JNK signalering en stroomafwaarts transcriptiefactoren 10,12,23,24. Bovendien ras V12 Scrib 1 Drosophila larven, waardoor infiltratie van immuuncellen (zogenaamde hemocytes) in de EAD 14,25.
Om de niveaus en de ruimtelijke verdeling van de JNK activiteit in de mozaïek weefsel en onder de tumoren van verschillende genotypen te bewaken, de gevestigde transgene, JNK-responsieve TRE-DsRed reporter werd toegepast 26. Confocale microscopie van de ontleed, vaste en EAD EAD / brain complexen onthulde duidelijke opregulatie van de TRE-DsRed reporter activiteit in de weefsels dragende kwaadaardige ras V12 Scrib 1 tumoren (Figuur 4B). De DsRed signaal gelabelde ras V12 Scrib 1 klonen in EAD (Figuur 4B) alsook tumorcellen verspreid over de hersenen lobben en de invasie van de VNC (figuur 4E, 4F). In tegenstelling, de TRE-reporter DsRed activity bleef beperkt tot een reeks cellen zich vanaf de antennaal het oogdeel van het regelschijven (Figuur 4A). Het blokkeren van JNK signalering resulteerde in een dramatische daling van de TRE-DsRed signaal in klonale ras V12 Scrib 1 JNK DN tumoren (Figuur 4C, 4D). Deze gegevens geven aldus functioneel bewijs voor een vereiste van JNK signalering naar de TRE-afhankelijke transcriptionele respons bij maligne ras V12 Scrib 1 tumoren activeren. Een lijn-specifieke hmlΔ-DsRed reporter, bedacht voor het traceren van Drosophila hemocytes 27,28 toonde een ophoping van immuuncellen in weefsels dragen kwaadaardige ras V12 Scrib 1 tumoren (figuur 5B). In tegenstelling, alleen individuele hemocytes of een paar gelokaliseerde hemocyte pleisters werden gedetecteerd in controle en ras V12 Scrib 1 JNK DN mozaïek EAD en hersenweefsel(Figuur 5A, 5C). Immunokleuring met een pan-hemocyte anti-Hemese antilichaam (H2) 29 bevestigde de immuuncel identiteit van hmlΔ-DsRed positieve cellen (figuur 5D, 5E). In overeenstemming met gepubliceerde rapporten 12,23,24, onpartijdige kwantificering van de tumor invasiviteit bevestigd een centrale rol van JNK signalering bij het bevorderen van de tumor invasie in de aangrenzende hersenkwabben en VNC (figuur 3C). Tenslotte werd totaal RNA geïsoleerd uit de mozaïek EAD. Monsters werden onderworpen ofwel qRT-PCR of geanalyseerd op een geautomatiseerd elektroforese-systeem voor de kwaliteit en kwantiteit. Figuur 6A toont significante JNK-afhankelijke regulatie van matrix metalloproteinase 1 (MMP1) transcript in EAD dragen kwaadaardige ras V12 Scrib 1 klonen tumoren, bevestiging van de eerder gepubliceerde bevindingen 12,24,30,31. Beoordeling van totaal RNA met behulp van een geautomatiseerd systeem electroforese toonde thoed drie onafhankelijke EAD monsters had een 28S / 18S-ratio boven 1.8 (figuur 6B). Echter, EAD 2 RNA was gedeeltelijk afgebroken, blijkt uit een uitstrijkje op de gel (figuur 6C). In tegenstelling, EAD 3 monster had een lage concentratie. Meerdere banden hoger molecuulgewicht beeld gel (figuur 6B) en kleine pieken op elektroferogram (6C) op, suggereerde ook DNA verontreiniging. Derhalve zou slechts EAD 1 monster geschikt voor bereiding van mRNA-seq bibliotheek.
Figuur 1: Schema van het MARCM systeem voor het genereren van genetische mozaïeken in het Drosophila EAD en downstreamtoepassingen (A) Het systeem maakt MARCM generatie klonale pleisters met gedefinieerde genetische laesies in een overigens wildtype (heterozygote).context. De expressie van FLP onder de controle van een weefselspecifieke promoter (bijvoorbeeld blind) katalyseert recombinatie tussen de twee FRT elementen aan weerszijden van de STOP cassette met de gele (y) gen (act> y +> Gal4). Na verwijdering van het STOP-cassette, de alom uitgedrukt Gal4 transcriptie-activator (act-Gal4) kan expressie van een UAS-gebaseerde transgene zoals UAS-GFP (ook UAS-ras V12) te rijden. In een oudercel, maar de Gal4-activiteit wordt geblokkeerd door een repressor GAL80 waarvan de expressie wordt gecontroleerd door een tubuline promotor (bad-GAL80). In de G2 fase van de celcyclus, FLP bemiddelt de uitwisseling van de niet-zusterchromatiden tussen de homologe chromosomen distaal van de FRT-plaatsen. De scheiding van het recombinante chromosomen tijdens de mitose zal leiden tot twee dochtercellen, één homozygoot mutant voor een bepaalde genomische locus (bijv Scrib
Figuur 2: Het sorteren van de derde instar larven en representatieve voorbeelden van EAD en EAD / brain complexen gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen (AB) TL-microfoto van de derde instar larven lager controle-GFP-gelabelde klonen geïnduceerd met de eyFLP-MARCM 82B Green tester.. (A) Representatieve controle larve met klonen beperkt tot de EAD en de hersenen lobben. (B) Een voorbeeld van een "luipaard larve" uitvoering GFP-positieve klonen in verschillende weefsels in het lichaam. (C) Helderveld afbeeldingen ontleed EAD en (D) EAD / hersenen complexen aan de mond haken, en (E) EAD ontdaan van alle vreemde tissue omvattende mondhaken. Schaalbalken = 2 mm (AB) en 500 urn (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Kwantificering tumor invasiviteit (A) Fluorescerende confocale afbeeldingen hersenen ontleed van ras V12 Scrib 1 larven (7 dagen AEL) vertegenwoordigen de werkelijke voorbeelden van de vier verschillende soorten tumor invasieve variërend van niet-invasieve (score 0), een hersenen kwab binnengevallen (Score 1), beide hersenkwabben binnengevallen (Score 2) om een sterke tumor invasie met klonen weefsel dat zowel de hersenen lobben en het invoeren van de VNC (Score 3). Afbeelding zijn projecties van meerdere confocale secties en voorbeelden Score 2 en 3 zijn gestikt van 2 x 2 confocale beelden. Schaal bar = 100 urn. (B) Een voorbeeld van een anoniem microscoopglaasje met vaste hersens gebruikt onpartijdigescoren onder een tl-stereomicroscoop. Scoorde hersenen zijn gemarkeerd met een pen om dubbele registratie te voorkomen. Schaal bar = 500 pm (C) In vergelijking met zeer invasieve ras V12 Scrib 1 tumoren, remming van de JNK signalering (ras V12 Scrib 1 JNK DN) geëlimineerd invasie van klonale cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Activering van de transcriptie TRE-DsRed reporter in 'V12' kwaadaardig ras Scrib '1 klonen tumoren JNK-afhankelijke (A. TRE-reporter DsRed bestempeld als een smalle strook van de cellen die loopt van antennaal in oog deel (pijlpunten). (B) De activiteit van de TRE-reporter DsRed werd opmerkelijk verbeterd in ras V12 Scrib 1 GFP-positieve klonen vergeleken met het omringende niet-klonale EAD epitheel. (C) Remming van JNK activiteit resulteerde in een duidelijke vermindering van DsRed signaalintensiteit in Ras V12 Scrib 1 JNK DN-klonen. (D) Verdere versterking van het signaal DsRed geopenbaarde niet-autonome activering van JNK signalering in cellen rondom het ras V12 Scrib 1 JNK DN-klonen. (E) Op dag 8 AEL, ras V12 Scrib 1-cellen overgrew de volledige EAD en verspreid over de hersenen lobben naar de VNC (pijl). (F) De klonale cellen invasie van de VNC (close-up van de regio marked door de pijl in E) werden verrijkt voor de DsRed signaal. (AC) Laat uitsteeksels meerdere confocale secties (E) wordt gestikt van 3x3 confocale beelden en (D, F) te vertegenwoordigen enkele sectie. Schaalbalken = 50 urn. EAD, oog / antennaal disc; BL, hersenen kwab; VNC, ventrale zenuw koord. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Lineage-specifieke HML Δ -DsRed transgene reporter onthult verrijking van ras V12 Scrib 1 tumor-geassocieerde hemocytes (A) In control EAD, hmlΔ-DsRed-reporter gelabelde hemocyte clu sters gevangen zitten in de inkepingen van het oog en antennal epitheel. (B) EAD en hersenweefsel omvat ras V12 Scrib 1-GFP gemerkt tumoren vertoonden een verhoogd aantal hemocytes verspreid over de klonale weefsel. (C) Het aantal bijbehorende hemocytes sterk afgenomen na remming van de JNK signalering in Ras V12 Scrib 1 JNK DN mozaïek weefsel. (DE) HmlΔ-DsRed positieve hemocytes werden ook gelabeld met een H2-antilichaam dat de pan-hemocyte marker Hemese detecteert. (AC) Laat uitsteeksels meerdere confocale secties (A) is gestikt van 2 x 2 en (BC) zijn gestikt van 3 x 3 confocale beelden. (DE) Represent enkele secties. Schaal bars = 100 micrometer (AC) en 10 micrometer (DE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:.. Evaluatie van de kwantiteit en kwaliteit van de totale RNA geïsoleerd uit ontleed EAD (A) Een representatief voorbeeld van qRT-PCR resultaten met behulp van vier biologische replica voor elk genotype MMP1 transcript niveaus waren genormaliseerd tot rp49. Voudige veranderingen in genexpressie werden berekend met de relatieve standaardcurve methode 32. Gegevens zijn gemiddelde waarden ± SEM; *** P <0,001 behulp ongepaarde tweezijdige t-test van Student met ongelijke variantie. (B, C) Evaluatie totaal RNA kwaliteit en kwantiteit een geautomatiseerd elektroforesesysteem. Het virtuele beeld gel (B) toont de twee duidelijke banden van de 18S en 28S rRNA's die overeenkomen met de goed gedefinieerde pieken op electroferogrammen (C). DNA vervuiling en RNA degradatie worden gereflecteerd door alsmear (pijlpunten) en extranumerary bands en pieken (pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Fly Stammen | Bron / Comments |
| eyFLP1; handeling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, ton-GAL80 | eyFLP-MARCM 82B Green Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | Deze studie, w; hmlΔ-DsRed van Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | deze studie |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | deze studie |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | Deze studie, w; TRE-DsRed van Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | deze studie |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | deze studie |
Tabel 1: Samenvatting van Drosophila lijnen gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De technieken voor het genereren van genetische mozaïeken in Drosophila behoren tot de meest verfijnde hulpmiddelen voor het analyseren en manipuleren genfunctie 33. De eyFLP-MARCM systeem heeft bewezen krachtig en robuust als het laat de inductie van visueel gemarkeerd, genetisch bepaald klonen in een ruimtelijk beperkte wijze, dat wil zeggen, in de weefsels waar de eyeless enhancer actief is 9,18. Dit is vooral belangrijk wanneer meerdere genetische laesies worden gecombineerd in dezelfde cellen. Hoewel deze sterk afwijkende pleisters toe larvale ontwikkeling als beperkt tot de hersenen en EAD neuroepithelia, kunnen ze letaliteit veroorzaken bij verspreid over het larvale lichaam bij hitteschok-gecontroleerde FLP (hsFLP) klonen. Significant, inductie van klonen in de vlieg EAD epitheel waarbij geactiveerde oncogenen combineren met verlies van tumor suppressors recapituleert het ontstaan en de progressie van epitheliale vaste tumoren in sommige menselijke kankers. However, het systeem ook beperkingen die kort worden besproken. Aangezien insecten open bloedsomloop, hoeft ware metastasen zoals waargenomen in humane kankers niet optreden. Dus het complexe proces van metastatische disseminatie niet getrouw worden gemodelleerd in Drosophila. Toch EAD tumoren zoals het ras V12 Scrib 1 klonen te doen te geven kwaadaardige eigenschappen zoals ze breken de basaal membraan rond de EAD en binnenvallen het aangrenzende hersenen 11,12,31. De mate van agressiviteit van tumoren kan worden gekwantificeerd en vergeleken tussen verschillende genotypen beschreven in deze studie. Het is ook belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van specifieke genetische lesies in mozaïek EAD invloed kunnen faseveranderingen en duur van larvale groei. Enscenering van de larven zal bepalen of de analyse van mozaïek weefsel zal worden gedaan met behulp van dieren van dezelfde chronologische of ontwikkelingsfase. Het uitvoeren van een proefproject om de gevolgen van een te beoordelennieuwe EAD klonale genotype op de ontwikkeling timing is wenselijk.
Er zijn technische beperkingen ook. Ten eerste, het aantal verschillende klonale genotypen die kunnen worden gebouwd met de eyFLP-MARCM instrument is goed maar niet oneindig. Zo combineert twee mutante allelen die op verschillende chromosomen bevinden gehinderd door lage efficiëntie van recombinatie op beide chromosomen tegelijk en genen op het chromosoom kleine vierde algemeen ontoegankelijk. Gene knockdown transgene RNAi is een alternatieve oplossing. Het is echter belangrijk te realiseren dat niet transgenen tot expressie direct na mitotische recombinatie - Pas de GAL80 repressor wordt afgebroken. De activiteit van het Gal4 / UAS expressiesysteem kan worden verhoogd door kweken larven bij 29 ° C. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de verhoogde temperatuur van invloed op de verschillende ontwikkeling, fysiologie en moleculaire parameters, waaronder groei, ontwikkelingsstoornissen timing, Metabolism en genexpressie 34-37. Zo zou aanpassingen van de ontvangen protocollen zoals opvoeren van de larven of aantal ontleed EAD voor transcriptoom profilering nodig.
De eyFLP-MARCM testers niet tot de gezondste stammen. De meervoudige transgenen in een genoom compromis vliegen fitness en vruchtbaarheid. Deze voorraden extra aandacht worden gehandhaafd en uitgebreid voor grote collecties van maagdelijke vrouwtjes. Zoals beschreven in deze studie, de MARCM 82B Green tester lijn 11, hoewel levensvatbaar wanneer homozygote, is genetisch instabiel. Dit is duidelijk uit de spontane verschijning van "luipaard larven" dat ectopische, GFP-gelabelde klonen binnen diverse polyploïde weefsels waaronder de darm, luchtpijp, dikke lichaam, en larvale epidermis weer te geven. Dit fenomeen komt voor in alle kruist onafhankelijk van de vaderlijke genotype. We gaan ervan uit dat de buitenbaarmoederlijke GFP plekken het gevolg zijn van ongecontroleerde, stochastische recombinatie tussen de twee FRT sites in de FLP-out cassette, waardoor het verwijderen van de gele + marker en de "STOP cassette". In de polyploïde weefsels, kan de tubuline-promoter gedreven GAL80 repressor onvoldoende om de Gal4 activiteit blokkeren. De aanwezigheid van genetisch gemodificeerde cellen in andere weefsels dan de EAD en hersenen kan systemische signalen die het gedrag van de experimentele klonen invloed kunnen wekken. Deze "leopard larven" dient derhalve te worden uitgesloten van de analyses. Bovendien hebben we regelmatig herstel van de MARCM 82B Green tester uit één man-vrouw kruisen.
Ondanks de hierboven genoemde valkuilen, de toepassingen van de eyFLP-MARCM systeem om gen functies te bestuderen en de interacties tussen klonale tumoren en hun omgeving zijn legio. Introductie van de Gal4 / UAS-onafhankelijke binaire expressie systemen zoals LexA / LexOp 38 of drugs controleerbaar QF / Quas / QS 39,40 zou een nauwkeurige controle over transgene exp biedenression en / of gelijktijdige vermelding en manipuleren van verschillende celpopulaties, waaronder klonale, niet-klonale epitheelcellen en hemocytes. Dergelijke mozaïek weefsels weer kon worden verwerkt volgens de protocollen beschreven.
Werkwijze voor ontleding mozaïek EAD EAD en / brain complexen van het derde instar larven (Protocol punt 3) kan worden toegepast op eerdere ontwikkelingsstadia ook. Belangrijk is dat het protocol voor EAD / brain complexen mogelijk maakt om de vleugel, haltere en been imaginaire schijven. Indien deze worden gebruikt voor RNA-isolatie (Protocol secties 3.3.2 en 7), moet de schijf plaats van vreemde weefsel gereinigd en eveneens verwerkt tot EAD. Gezien hun kleine grootte, moet het aantal haltere en been discs verzameld worden verhoogd om voldoende hoeveelheid RNA te verkrijgen.
Het protocol voor extractie van totaal RNA van EAD (Protocol punt 7) is gebaseerd op RNA lysisreagens verkrijgbaar van verschillende commerciële vendors (zie lijst van materialen / Equipment). De algehele succes van de procedure hangt voornamelijk af van: (i) met voldoende aantal larven, (ii) zich snel en precies, terwijl ontleden, en (iii) het bijhouden van de monsters vrij van RNases. Het houden van de werkplek en instrumenten schoon, het dragen van handschoenen, met behulp van RNase-vrij plastic ware en oplossingen, en het houden van de monsters op ijs alle verminderen RNA degradatie. Om verontreiniging van RNA met elke genomisch DNA dat niet volledig kan worden verwijderd door DNase behandeling (Protocol 7.11) voorkomen, is het essentieel om interfase vermijden bij het verzamelen van de waterige fase voor het eerst (Protocol paragraaf 7.6). Zowel DNA als RNA verontreiniging afbraak kan worden onthuld door het uitvoeren monsters op een geautomatiseerd elektroforesesysteem (figuur 6B, 6C). De RNA-isolatie protocol heeft een bredere toepassing. Het is met succes gebruikt voor RNA-extractie uit vol larven in verschillende ontwikkelingsstadia, van volwassenen, en diverselarvale organen. De verkregen RNA was geschikt voor zowel qRT-PCR en genoom-brede transcriptoom analyse van mRNA-seq 20,24,41,42. Vergeleken met qRT-PCR die tientallen geselecteerde mRNA kwantificeert hooguit onpartijdige mRNA sequencing maakt genoom-brede expressie analyses. Aldus kan men hele transcriptoom handtekeningen van tumoren geïnduceerd door specifieke genetische lesies in verschillende stadia van tumorigenese 24 vergelijken. Het is belangrijk om in gedachten dat RNA afkomstig uit het gehele schijven te houden, zodat de resultaten niet alleen veranderingen in de klonen, maar ook in de omringende, niet-klonale weefsel weerspiegelen. Uitvoeren activate fluorescerende celsortering (FACS) met gesplitste mozaïek EAD door aanpassing van beschikbare protocollen 43,44 kunnen worden toegepast om transcriptionele ondertekening van specifieke celpopulaties, bijvoorbeeld klonale (GFP +) en niet-klonale (GFP -) cellen bepalen.
De fixatie en immunokleuring protocol hier beschreven is geschikt voor Simulmomentane visualisatie van eiwitten van belang met specifieke antilichamen en de activiteit van transgene verslaggevers. Zowel het GFP-signaal markering klonale cellen en DsRed fluorescentie veroorzaakt werd door elk van de twee transgene reporters die in deze studie worden bewaard gedurende fixatie en immunokleuring en kan direct worden gevisualiseerd door confocale microscopie. Echter, antilichamen tegen de fluorescerende eiwitten kunnen de signaalintensiteit versterken. Evenzo gebruik van een anti-β-galactosidase antilichaam detectie van transgene reporters gebaseerd op het bacteriële lacZ-gen vergemakkelijken. Relatieve reporter activiteiten kunnen worden bepaald door het meten van de relatieve pixel intensiteiten van klonen versus niet-klonen weefsel met behulp van beeldanalyse software (bv, Fiji, ImageJ). Bij het vergelijken van reporter activiteit onder verschillende klonale genotypen, moet het beeld overname instellingen constant (Protocol sectie 5 en referenties 21,22) worden gehouden. Hoewel het protocol werkt goed met veel verschillende eenntibodies, kan het noodzakelijk zijn aanbevolen antilichaamconcentraties optimaliseren. Ook veranderingen in fixatie, type en concentratie van detergens (Triton X-100, Tween-20, Saponine) en fixeermiddel (8% PFA, 4% formaldehyde, EtOH) vereist.
In tegenstelling tot de protocollen hierboven besproken kwantificering van tumor invasiviteit is beperkt tot de derde instar larvale stadium en de EAD / hersenen complex. Niettemin kan de gehele ratio gelden voor kwantitatieve studies waarbij denkfout moet worden vermeden. De methode vereist grondigheid. Tumor maligniteit toeneemt in de tijd, is het essentieel om te vergelijken larven van dezelfde leeftijd (bijvoorbeeld 7 of 8 dagen na leg). Na verloop van tijd een klonale tumor kan massaal overwoekeren, maar de tumorcellen kan binnen de EAD blijven. De stap waarin hersenen worden gescheiden van de EAD (Protocol sectie 4.4.1) is daarom cruciaal vals-positieve invasieve tellingen voorkomen. Montage van de hersenen met de bijbehorende EAD zal Flatten de weefsels, waardoor begroeide EAD de hersenstructuren bedekken en dus alle kwantificering voorkomen. Idealiter zou men graag de invasieve proces direct in de woonkamer larve vast te leggen. Transgene reporters te visualiseren de betrokken celpopulaties en weefsels zijn beschikbaar en kunnen worden gecombineerd met de eyFLP-MARCM systeem. Helaas, het invasieve proces duurt enkele uren tot dagen, een tijd die onverenigbaar is met het leven houden terwijl larven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
