Summary
Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.
Introduction
Cancer representa um dos grupo mais geneticamente heterogêneo de doenças, cuja incidência e mortalidade está aumentando dramaticamente, especialmente entre os idosos em todo o mundo. Cancer origem clonal de uma célula de iniciação tumor que escapa mecanismos supressores tumorais inerente e divide fora de controle. A acumulação gradual de lesões genéticas que cooperativamente promover o crescimento, a proliferação e a motilidade, enquanto inibir a morte e a diferenciação transforma o crescimento excessivo benigno inicial em um tumor altamente maligno metastático e mortal. Tornou-se evidente que, além de alterações genéticas, a progressão do tumor requer alterações no estroma circundante e diafonia entre os tipos de células tumorais e múltiplos (por exemplo, fibroblastos, células endoteliais, imunes e) no seu microambiente. Compreender os princípios moleculares subjacentes transformação maligna incluindo interações tumor-estroma é de grande importância para o desenvolvimento de prevenestratégias de e rastreio precoce, bem como tratamentos novos e eficazes para lutar contra a metástase do câncer e resistência aos medicamentos.
A mosca da fruta Drosophila melanogaster tornou-se um sistema atraente para a investigação do cancro 1-4 devido ao seu tempo de geração rápido, notável conservação da sinalização nós entre moscas e seres humanos, redundância genética limitada e riqueza de ferramentas genéticas avançadas que facilitam a manipulação de quase qualquer gene em de maneira temporária e espacialmente restritos. Tumores geneticamente definidas de diferentes malignidade pode ser reprodutivelmente engenharia em Drosophila através da introdução de gain- e mutações de perda de função em um subconjunto de células progenitoras num tecido de outra forma tipo selvagem utilizando a técnica marcm 5. A ferramenta combina marcm FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Reconhecimento Target) mediada por recombinação mitótica 6 com FLP-out 7 e Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) gene alvo 8sistemas de expressão de 9. Com esta expressão método de qualquer transgene UAS-base, incluindo oncogene ou ADNc de proteína fluorescente ou repetições de ADN invertidos para silenciamento de genes induzido por ARNcd, será restrita a um clone de células que perderam um locus genético específico e um repressor Gal4 devido à recombinação (Figura 1A). Remendos clonais marcados com fluorescente verde (GFP) ou proteínas fluorescentes vermelho (por exemplo, RFP, DsRed, mCherry) pode ser facilmente rastreada ao longo do desenvolvimento, isolados e analisados. Importantemente, o seu comportamento pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. Assim, questões pertinentes à célula efeitos autónomos e não autónomos de lesões genéticas podem ser convenientemente estudado. Semelhante a mamíferos, apenas clones em que múltiplas lesões oncogênicos são combinados se tornem malignas em Drosophila e recapitular características principais de câncer de mamíferos. Eles overproliferate, fugir apoptose, induzir a inflamação, tornar-se imortal e invasiva, em última análise, matando o hospedeiro 10-17.
Aqui, descrevemos um protocolo para gerar tumores clonais geneticamente definidas no tecido ocular / antenas e do cérebro de larvas de Drosophila usando a técnica marcm. O método baseia-se um testador de estoque marcm que expressa a recombinase FLP de levedura sob o controlo do intensificador sem olhos (eyFLP) 18,19. Desta forma, os clones marcado com GFP são geradas em ambos epitélio colunar e peripodial do EAD e o neuroepitélio do cérebro ao longo estágios embrionários e larval (Figura 1a, b e de referência 20). Clones podem ser facilmente seguido até a idade adulta como a EAD desenvolve no olho adulto, antena e cabeça cápsula enquanto o neuroepitélio dá origem a neuroblastos que produzem neurônios do lóbulo óptica diferenciadas.
Para facilitar a extensa caracterização molecular, funcional e fenotípica do tecido mosaico, que deescriba um protocolo para dissecção da EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e delinear a forma de processá-los por três aplicações diferentes: (i) a detecção de repórteres fluorescentes transgênicas e imunocoloração, (ii) quantificação de invasão tumoral e (iii) a análise dos altera a expressão do gene utilizando uma quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), ou um ARNm de alto rendimento de sequenciação (ARNm-SEQ) (Figura 1C).
O protocolo de imunocoloração pode ser usado para visualizar qualquer proteína de interesse com um anticorpo específico. Transgenic repórteres fluorescentes transcricionais fornecer informações espaço-temporal conveniente e precisa sobre a actividade de uma via de sinalização particular. repórteres celular específicos de linhagem, por outro lado, reflectem alterações qualitativas e quantitativas em populações de células no interior do tecido do mosaico e entre os tumores de diferentes genótipos. A quantificação do comportamento invasivo facilita a comparação de malignidade do tumor entre o genótipos. Finalmente, o protocolo descrevendo recolha e tratamento de EAD mosaico para o isolamento de RNA é adequado tanto para aplicações a jusante-pequena e grande escala, tais como a transcrição reversa seguida de qRT-PCR e mRNA-seq genome-wide, respectivamente. Os dados qualitativos e quantitativos obtidos a partir destes ensaios de fornecer novos insights sobre o comportamento social dos tumores clonais. Além disso, eles produzem uma base sólida para estudos funcionais sobre o papel dos genes individuais, redes genéticas e microambiente do tumor em diferentes fases e aspectos da tumorigénese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Este trabalho utiliza o eyFLP1; act> y +> Gal4, UAS-GFP; Linha tester FRT82B, banheira-Gal80 marcm 82B Verde 11. Cruzando as virgens testador marcm 82B Verdes para machos de estirpes tais como w; UAS-um; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genótipo irá produzir descendência em que a recombinação mitótico irá ocorrer entre os braços direitos dos cromossomos homólogos 3º. Desta forma, os clones mutante homozigótica para o gene c localizada distalmente ao local FRT82B irá ser gerado dentro do neuroepitélio EAD e cérebro. Estes clones irá expressar GFP, e um transgene de ARNcd para o gene b (Figura 1A). Várias linhas de tester eyFLP-marcm para recombinação no X, 2L, 2R, 3L e 3R foram estabelecidas e estão disponíveis dentro da comunidade mosca.
1. O manuseamento Fly, cruzes, e estadiamento
- Expandir o estoque marcm testador adequado à temperatura ambiente, preenchendo múltipla bottles ao mesmo tempo. Virar os adultos em garrafas frescos a cada 2-3 dias para que as virgens suficientes podem ser recolhidos para cruzamentos subsequentes.
NOTA: Quando recolher virgens, evitar uma exposição prolongada ao CO 2, pois isso compromete a fecundidade das fêmeas. - Dependendo da escala do experimento, configurar cruzes mosca em frascos utilizando pelo menos 10 marcm virgens testador e 4 machos (por exemplo, para geração de imagens de repórteres fluorescentes e imunocoloração) ou em frascos com pelo menos 30 virgens e 10 homens (por exemplo, para isolamento de ARN e quantificação de invasividade).
- Elevar progénie a 25 ° C sob um dia longo de 16 h / 8 h ciclo de luz-escuridão. Virar pais em novos frascos / garrafas a cada 24 horas para facilitar o preparo reprodutível de larvas e para evitar a superlotação.
NOTA: Começando no dia 6 após a postura dos ovos (AEL), o terceiro controle instar alimentação das larvas parada final, começar vagando e entrar pupariation. Em contraste, o início da transição larva-pupa pode ser deDefiniu ou inexistente em larvas com EAD portadores de tumores clonais hiperplásicas ou malignos.
2. Coleta de terceiro instar larvas
- Para imunocoloração, recolher cerca de 20 final de larvas terceiro (vagando na parede e os de um tamanho corporal comparável a partir do alimento). Use uma pinça para escolher cuidadosamente as larvas do frasco ou garrafa e transferi-los para um prato de embrião de vidro cheio com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Para o isolamento de ARN e a quantificação da capacidade de invasão, recolher, pelo menos, 80 final de larvas terceiro (vaguear sobre a parede e as de um tamanho comparável a partir do corpo de alimentos). Use uma garrafa de esguicho para esguichar PBS em uma garrafa mosca contendo larvas até que a superfície é coberta.
- Suavizar as camadas superiores de alimento com uma espátula e despeje o purê alimentos que contenham larvas em uma placa de Petri. Utilizando uma pinça, gentilmente pegar larvas e transferi-los para um prato de embrião de vidro cheio de PBS.
- Lavar com PBS larvas until todos os alimentos residual é removido. Inspecionar as larvas sob o estereomicroscópio fluorescente com 8 a ampliação de 16x para descartar todos "leopardo larvas" que carregam manchas GFP positivas aleatórias em todo o corpo larval (Figura 2A, 2B e ver seção de discussão).
NOTA: Para o isolamento de ARN incluem um passo de lavagem no penúltimo EtOH a 70% durante 1 min. - Coloque o prato contendo larvas selecionado na PBS em gelo até dissecção. larvas processo no prazo de 30 min para evitar efeitos adversos de frio e fome.
3. Dissecção da Larvas
- Para dissecar o EAD sob um microscópio estereoscópico, use um par de pinças para pressionar levemente a parte do meio da larva contra o fundo prato de vidro. Com a segunda pinça, pegue os ganchos boca larval e puxá-los para fora do corpo (Figura 2C).
NOTA: A força de tracção é muitas vezes suficiente para quebrar os caules óptica que ligam o EAD pair para os lobos cerebrais. Se o cérebro ou suas partes ficar ligado a EAD e a sua presença não é desejada para outras aplicações, cortar os caules óptica com a ajuda dos dois pares de pinças. Para tumores invasivos (por exemplo, ras V12 Scrib 1) a conexão entre EAD e os lóbulos cerebrais torna-se cada vez mais obscurecido com o tempo por overgrowing e migração de células clonais.- Para preparar o complexo de EAD / cérebro com um cordão nervoso intacto ventral (VNC) (Figura 2D), utilizar uma pinça para cortar uma larva no meio do corpo. Descarte a metade posterior.
- Segurar a metade anterior do corpo de larvas entre as pontas de um fórceps, inverter a larva de dentro para fora, empurrando os ganchos boca com a ponta do fórceps e as segundas por laminagem a cutícula por cima com o primeiro par de fórceps.
- Utilizando uma pinça remova cuidadosamente todos os tecidos estranhos (por exemplo, glândulas salivares, gordura corporal e intestinal), deixando o par EAD ouo complexo EAD / cérebro ligado aos ganchos boca. Separar os ganchos na boca da cutícula sobrejacente. Livre o VNC, cortando as projeções axonal estendendo-se até os músculos do corpo e epiderme (Figuras 1B, 2C, 2D).
NOTA: Os ganchos boca para permitir a manipulação segura do tecido com uma pinça e facilitar o afundamento mais eficiente e fácil reconhecimento de tecido durante a lavagem. Dissecados morfologia mudança EAD relativamente rápido quando mantidos unfixed em PBS. Limitar o tempo de dissecção para 20-30 min. - Para transferir o tecido, revestimento a ponta da micropipeta P20 pipetando o corpo restante carcaças várias vezes para cima e para baixo. Para transferir os complexos maiores EAD / cerebrais, corte a ponta da micropipeta P20 com uma tesoura.
NOTA: O procedimento de revestimento é crítico para evitar a aderência e a perda de tecido dissecados durante a transferência. Uso de uma micropipeta P20 minimiza a transferência de fosfato em solução fixadora, limitando a diluição indesejada.- Para imunocoloração, transferirEAD dissecado em um tubo de 0,5 ml cheio com 400 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) fixador. Use 1,5 ml tubo com 1 ml PFA para ampliar EAD complexos cerebrais / significou para marcação de invasão.
CUIDADO: PFA é altamente tóxico. Usar luvas e vestuário de protecção. Evitar o contacto com a pele, olhos ou membranas mucosas. - Para o isolamento do RNA transferir o EAD dissecado em um novo prato de vidro cheio de PBS frio. Use uma pinça para limpar EAD a partir das glândulas linfáticas e do anel, para minimizar a contaminação da amostra.
- Retire a EAD dos ganchos na boca, cortando a ligação entre os discos de antena e boca ganchos usando uma pinça (Figura 2E). Para evitar RNA degradação e artefatos de expressão gênica, limitar o tempo de dissecção e 30 min. Siga para a etapa 7.
Nota: Um investigador experiente pode dissecar cerca de 60 larvas em 30 min Tempo de exclusão necessários para a coleta de larvas e de lavar roupa. Total de rendimentos de ARN depender do tamanho EAD que variam entre os genótipos e DevelopmentAl etapas. Dissecação de 80-100 pares de controle de EAD de larvas terceira final deve render 5-8 ug de RNA total.
- Para imunocoloração, transferirEAD dissecado em um tubo de 0,5 ml cheio com 400 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) fixador. Use 1,5 ml tubo com 1 ml PFA para ampliar EAD complexos cerebrais / significou para marcação de invasão.
4. Fixação, imunocoloração e montagem
- Fix amostras em PFA fixador durante 25 min, enquanto se nutação à temperatura ambiente. O tempo de fixação pode ser prolongado até 60 minutos sem alterar a morfologia do tecido e a antigenicidade de proteínas.
- Retirar as amostras de agente de fixao e lavagem com PBST (PBS com 0,1% de Triton X-100), três vezes durante 10 min, utilizando um nutator. Utilizar um volume suficiente de PBST durante cada passo de lavagem (400 uL / tubo de 0,5 ml).
NOTA: Fixo complexos / cérebro EAD significou para marcação de invasão não necessitam de imunocoloração. sinal de GFP continua bem visível após a fixação. Avance para o passo 4.4 para a dissecção final.- Para a imunocoloração, tecido bloco em 200 ul de uma solução de bloqueio (PBST com 0,3% de BSA) durante 20 min com agitação suave à temperatura ambiente.
- Incube com primary anticorpos diluídos em 100 ul de uma solução de bloqueamento durante a noite a 4 ° C enquanto agitando suavemente. Referem-se a folha de dados anticorpo primário ou a literatura publicada para a diluição de anticorpo recomendada.
NOTA: A diluição de anticorpo primário pode precisar ser otimizado. - Após cinco lavagens de 10 min em PBST, tecido mancha com os anticorpos secundários fluorescentes diluído em solução de bloqueio, enquanto agitando durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C no escuro.
- Lavar as amostras três vezes 10 minutos em PBST.
- Incube com primary anticorpos diluídos em 100 ul de uma solução de bloqueamento durante a noite a 4 ° C enquanto agitando suavemente. Referem-se a folha de dados anticorpo primário ou a literatura publicada para a diluição de anticorpo recomendada.
- Para a imunocoloração, tecido bloco em 200 ul de uma solução de bloqueio (PBST com 0,3% de BSA) durante 20 min com agitação suave à temperatura ambiente.
- Substituir PBST com 500 ul de solução DAPI-coloração. Para marcar F-actina, adicionar faloidina conjugada com um corante fluorescente para solução DAPI-coloração. Depois de 15 min no escuro nutação, lavar o tecido uma vez durante 10 min com PBST.
NOTA: rotulagem F-actina pode ser realizada de forma independente da coloração com DAPI. - Para a etapa de dissecção final, transferir o tecido de volta em um prato de vidro PBS-cheia usando um pi 1 mlpette. Utilizando os dois pares de pinças de clipe para fora dos ganchos boca.
- Separa-se os cérebros que serão usados para a quantificação da invasividade do EAD cortando a haste óptica como EAD coberto pode dificultar a análise.
- Colocar uma gota de meio de montagem (15 ul de uma lamela x 22 mm 22 mm) sobre uma corrediça objectivo. Com a ajuda de fórceps dicas, distribuir o meio numa camada fina. Transferir EAD, cérebros ou os complexos EAD / cerebrais para o meio de montagem com uma micropipeta P20.
- Use as dicas fórceps ou uma haste de tungstênio para distribuir tecidos e endireitar o VNC no slide.
- Para evitar a formação de bolhas durante a montagem, o primeiro toque de uma borda de uma lamela para o meio de montagem e, em seguida, lentamente inferior para o meio de montagem com a ajuda de fórceps. Use pequenos pedaços de papel de filtro ou lenço de papel para absorver o excesso de meio de montagem em torno das bordas lamela.
NOTA: DABCO / poli (álcool vinílico) de montagem 4-88 endurece médiasa 4 ° C no decurso de uma hora. As lâminas podem ser armazenadas durante meses a 4 ° C.
5. Imagem Confocal
- Adquirir seções confocal individuais e pilhas usando um microscópio confocal equipado com 20X, objetivos petróleo 40X e 60X.
- Evitar a saturação pixel. Use mesmos parâmetros de aquisição de imagem, incluindo a resolução da imagem, potência de entrada laser, ganho, offset, quadro de média, um tamanho de passo em uma série z e manter essas configurações para todos os genótipos para permitir comparações de intensidades de pixel entre os diferentes genótipos 21,22.
NOTA: Para a visualização do complexo / cérebro EAD, gerar projeções máximas e costurar respectivas imagens, vizinhos. Para a preparação da imagem final, use pós software de processamento de imagem para a montagem do painel e para ajustar o brilho e contraste.
6. A quantificação de invasividade tumoral
- Definir um sistema de pontuação que vai caracterizar os diferentes níveis de invasivenes tumoraiss considerando o padrão espacial de invasão e a quantidade de células positivas para GFP espalhar para o cérebro e VNC. Prepare fichas de avaliação para documentação (Figura 3A).
- Mount pelo menos 80 fixa cérebros intactos para cada genótipo em um slide utilizando 40 ul do meio de montagem por 24 milímetros x 50 mm lamela.
- Para permitir pontuação imparcial, pergunte a um partido neutro anonimizar os slides, para que o procedimento de pontuação é imparcial. Avaliar lâminas anónimos por dois membros do laboratório de forma independente. Divulgar genótipos somente após a contagem estiver concluída.
- Avaliar o grau de malignidade por um placar cega de cérebros montados sob um microscópio estereoscópico fluorescente equipado com um conjunto de filtros GFP. Use um marcador para rotular cérebros que já foram vistos a fim de evitar a dupla contagem (Figura 3B).
- Calcula-se a percentagem de cérebros de queda em cada uma das categorias definidas por genótipo invasivos. Determinar os s estatísticosignificance usando um teste qui-quadrado (Figura 3C).
7. Isolamento RNA, DNase Tratamento e Verificação da Qualidade
NOTA: Todos os reagentes (soluções, utensílios de plástico) utilizado nos passos seguintes deve ser isento de actividade de RNase. Use sempre luvas e usar um capuz química para o trabalho com solventes orgânicos.
- Transfira a EAD limpo com uma ponta de micropipeta P20 revestido em 1,5 ml tubo.
- Deixe dissipador de tecido para o fundo do tubo, cuidadosamente remover PBS e substituí-la com 100 ul de reagente de lise de ARN (suficiente para até 140 DAE).
- Lyse tecido em vórtex. Neste ponto, as amostras podem ser congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C ou directamente processada com um protocolo de isolamento de ARN padrão.
NOTA: As amostras de genótipos similares de várias rodadas de dissecação pode ser agrupada vez em reagente de lise RNA. - Encher o volume da amostra de 0,9 ml, com reagente de lise de ARN. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e misturar amostras Vigorously durante 15-20 seg.
- Após 2 a 3 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- ARN de transferência superior incolor fase aquosa contendo em um novo tubo, sem perturbar a interfase. Fique longe da interfase, pois contém proteínas e DNA genômico.
NOTA: O volume recuperado deve ser de cerca de 60% do volume de reagente de lise de ARN usado para a homogeneização. - Precipitar o ARN por adição de 0,5 ml de álcool isopropílico. Vortex e incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min.
- Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN, uma vez com 600 ul de etanol a 75%. Depois de um curto vórtice e centrifugação (10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C) descartar todo o etanol e deixar o sedimento de ARN de ar seco durante 5-10 minutos colocando o tubo aberto em um tecido limpo limpar.
NOTA: O sedimento de ARN pode ser visível como uma pequena branco opaco r /maduro na parte inferior do tubo ou invisível. As gotas de etanol restantes podem ser removidos cuidadosamente com ponta P10 micropipeta. - Dissolve-se o ARN em 50 jil de água tratada com DEPC em vortex ou solução que passa algumas vezes através de uma ponta de pipeta.
- Para minimizar a contaminação com ADN genómico, tratar de ARN total com ADNase pela adição de 50 ul de uma mistura contendo 1 ul de ADNase (2 U / ul) e 10 ul de tampão de ADNase 10x em água tratada com DEPC. Vortex e girar para baixo.
- Incubar as amostras a 37 ° C num banho de água ou de um bloco de aquecimento durante 30 a 40 min. Após a incubação, adicionar 100 ul de água tratada com DEPC para cada amostra.
- Para inactivar a actividade enzimática e RNA limpo de ADNase, adicionar 200 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) soluções, vortex durante 1 min e centrifuga-se as amostras a 10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
- Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior contendo ARN para um tubo fresco. Adicionar um volume igual (200 ul)de clorofórmio, misturar e repetir o passo de centrifugação a partir de cima.
- Recolher cuidadosamente a fase superior e precipitar o ARN por adição de 1/10 do volume de 3 M de acetato de sódio, pH 5,2, preparada em DEPC H2O e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misture bem em vórtice.
NOTA: A adição de 0,5 ul de glicogénio (20 mg / mL) a uma mistura de precipitação ajuda a visualizar o sedimento de ARN. Para minimizar a perda de ARN, usar siliconada, tubos de ligação de baixa microcentrífuga de 1,5 ml. - Precipitar o RNA a -20 ° C durante pelo menos 1 h.
NOTA: A incubação pode ser realizada durante a noite. As amostras podem ser colocadas a -80 ° C, bem. - Sedimento de ARN por centrifugação a 10000 xg durante 30 min a 4 ° C. Lave e pellet seco seguindo a descrição em 7,9.
- Dissolve-se o ARN em 10-15 ul de água tratada com DEPC. ARN armazenar a -80 ° C.
- Determinar a quantidade e a pureza do RNA através da medição OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizando um espectrofotómetro. Calcule RNA concentration, aplicando a convenção de que 1 DO a 260 nm é igual a 40 ug / ml de ARN.
NOTA: O rácio A 260/280 de ARN "pura" é igual a 2,0, enquanto uma razão A 260/230 deve estar na gama de 2,0-2,2. As amostras de ARN com um A 260/280 razão entre 1,7 e 2,0 são adequados para aplicações a jusante, tais como a síntese de cDNA. Para a preparação de bibliotecas de ARNm-seq a qualidade e quantidade de ARN deve ser verificada utilizando um sistema de electroforese automatizada. A proporção 28S / 18S deve estar acima de 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para demonstrar o potencial da técnica eyFLP-marcm para gerar manchas marcadas com GFP de genótipos definidos em Drosophila EAD, foram induzidos três tipos de clones: (1) controle somente expressando GFP, (2) tumores malignos expressar uma forma oncogénica do pequeno Ras (Ras V12) da proteína G em um fundo de perda homozigótica de um scribble gene supressor de tumor (Scrib 1), e (3) sobrecrescimento mas não invasivo ras V12 Scrib 1 JNK clones Dn, onde cinase da Jun-N- terminal (JNK) foi inactivado por expressão da sua forma dominante negativa (Figura 4, Tabela 1 para os genótipos). Tem sido demonstrado que a capacidade de invasão de tumores clonais Scrib 1 ras V12 requer a activação aberrante de sinalização JNK e a sua transcrição a jusante factores 10,12,23,24. Além disso, o RAS V12 Scrib 1 de Drosophila, que resulta em infiltração de células imunitárias (chamados hemócitos) na EAD 14,25.
Para monitorar os níveis e a distribuição espacial da actividade JNK dentro do tecido mosaico e entre os tumores de genótipos distintos, o transgênico estabelecida, repórter TRE-DsRed JNK-responsive foi empregado 26. A microscopia confocal da DAE dissecados, fixados e EAD / complexos cerebrais revelou regulação positiva acentuada da actividade repórter TRE-DsRed nos tecidos malignos rolamento ras V12 Scrib 1 tumores (Figura 4B). O sinal DsRed marcado ras V12 Scrib 1 clones em EAD (Figura 4B), bem como células de tumor que espalham ao longo dos lobos cerebrais e que invadem o VNC (Figura 4E, 4F). Em contraste, a activi repórter TRE-DsRedty permaneceu restrito a uma série de células que se estendem do antenas para a parte do olho dos discos de controlo (Figura 4A). Bloqueio de sinalização JNK, resultou numa diminuição dramática de sinal TRE-DsRed em Ras V12 clonal Scrib 1 tumores JNK DN (Figura 4C, 4D). Estes dados fornecem, assim, provas funcionais para uma exigência de JNK sinalização para ativar a resposta transcricional TRE-dependente em Ras maligna V12 Scrib 1 tumores. Um repórter hmlΔ-DsRed de linhagem específica, concebida para rastrear Drosophila Hemócitos 27,28 mostrou uma acumulação de células imunes em tecidos que ostentam maligna ras V12 Scrib 1 tumores (Figura 5B). Em contraste, apenas hemócitos individuais ou poucas manchas localizadas de hemócitos foram detectados no controle e V12 ras Scrib 1 JNK DN mosaico EAD e tecidos cerebrais(Figura 5A, 5C). A imunocoloração com um anticorpo pan-hemócitos anti-Hemese (H2) 29 confirmou a identidade da célula imunitária de células positivas hmlΔ-DsRed (Figura 5D, 5E). Consistente com relatórios publicados 12,23,24, quantificação imparcial de invasividade tumoral corroborada um papel central de sinalização JNK, em promover a invasão do tumor para dentro dos lobos cerebrais adjacentes e VNC (Figura 3C). Finalmente, o ARN total foi isolado a partir do mosaico EAD. As amostras foram sujeitas tanto a qRT-PCR ou analisados em um sistema de electroforese automatizada para a qualidade e quantidade. A Figura 6A mostra a regulação positiva dependente da JNK significativa de metaloproteinase de matriz 1 (MMP1) transcrito em EAD rolamento ras V12 Scrib 1 tumores clonais malignos, confirmando o anteriormente resultados publicados 12,24,30,31. Avaliação de ARN total utilizando um sistema de electroforese automatizada mostrou tchapéu três amostras EAD independentes tinha um rácio 28S / 18S acima de 1,8 (Figura 6B). No entanto, a EAD 2 de ARN foi parcialmente degradado, reflectida por uma mancha no gel (Figura 6C). Em contraste, a amostra de EAD 3 tinha uma concentração baixa. Várias bandas de peso molecular mais elevado de imagem em gel (Figura 6B) e pequenos picos no electroferograma (Figura 6C) em, sugeriu também a contaminação de ADN. Assim, apenas uma amostra de EAD seria adequado para uma preparação da biblioteca de ARNm-SEQ.
Figura 1: Esquema do sistema marcm para a geração de mosaicos genéticos na Drosophila EAD e aplicações a jusante (A) O sistema marcm permite a geração de remendos clonais com lesões genéticas definidos em um tipo de outra forma selvagem (heterozigotos).contexto. A expressão de FLP sob o controlo de um promotor específico de tecidos (por exemplo, sem olhos) catalisa a recombinação entre os dois elementos FRT flanqueiam a cassete de PARAGEM marcado com um gene de cor amarela (Y) (ato> y +> Gal4). Após a remoção da cassete de STOP, o ubiquamente expressa Gal4 activador transcricional (ACT-Gal4) pode conduzir a expressão de qualquer transgene UAS-base, tal como UAS-GFP (V12 também UAS-ras). Numa célula parental, no entanto, a actividade de GAL4 é bloqueado por um repressor Gal80 cuja expressão é controlada por um promotor da tubulina (banheira-Gal80). Na fase G2 do ciclo celular, FLP medeia a troca dos cromatídeos irmãos não entre os cromossomas homólogos distais para os locais DRF. A segregação dos cromossomas durante a mitose recombinantes darão origem a duas células filhas, sendo um mutante homozigótico para um locus de genoma em particular (por exemplo, Scrib
Figura 2: Triagem de larvas de terceiro estádio e exemplos representativos de EAD e EAD / complexos do cérebro usadas para diferentes aplicações a jusante (AB) micrografias fluorescentes de terceiro instar de controlo do rolamento larvas clones marcado com GFP induzidas com o testador eyFLP-marcm 82B Green.. (A) larva controle Representante com clones restritos ao DAE e cerebrais lobos. (B) um exemplo de um "larva leopardo" transportando os clones GFP-positiva em diversos tecidos em todo o corpo. Imagens (C) de campo claro de EAD dissecados e complexos (D) EAD / cérebro associadas aos ganchos da boca, e (E) EAD limpos de todos os tecidos estranhos, incluindo ganchos boca. Barras de escala = 2 mm (AB) e 500 uM (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Quantificação da invasividade do tumor (A) imagens confocais fluorescentes de cérebros dissecados de Ras V12 Scrib 1 larvas (7 dias ul) representam os exemplos reais dos quatro graus diferentes de invasividade tumoral variando de não-invasiva (Pontuação 0), um lobo cerebral invadido (escore 1), ambos os lóbulos cerebrais invadidas (escore 2) para uma invasão tumoral forte com o tecido clonal cobrindo ambos os lóbulos cerebrais e entrar no VNC (escore 3). As imagens são projeções de várias seções confocal e exemplos para Score 2 e 3 são costuradas a partir de 2 x 2 imagens confocal. Barras de escala = 100 mm. (B) Um exemplo de uma lâmina de microscópio anónimos com cérebros fixos utilizados para imparcialmarcando sob estereomicroscópio fluorescente. cérebros marcados são marcados com uma caneta para evitar o registo duplicado. Barra de escala = 500 mm (C) Comparado com alto poder invasivo ras V12 Scrib 1 tumores, a inibição da JNK sinalização (ras V12 Scrib 1 jnk DN) de invasão eliminado de células clonais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A activação da transcrição do repórter TRE-DsRed em 'V12' ras 1 malignas tumores clonais 'Scrib é dependente da JNK (A. TRE-DsRed sensível ao JNK marcado uma faixa estreita de células que funcionam a partir da antena a uma parte do olho (setas). (B) A actividade do repórter TRE-DsRed foi marcadamente melhorado em Ras V12 Scrib 1 clones GFP-positiva em comparação com o epitélio circundante EAD não clonal. (C) Inibição de actividade de JNK resultou numa redução clara da intensidade do sinal DsRed em Ras V12 Scrib 1 JNK clones DN. (D) o reforço do sinal DsRed revelou ativação não-autónoma de JNK sinalização em células que cercam as ras V12 Scrib 1 JNK clones DN. (E) No dia 8 AEL, ras V12 Scrib 1 células overgrew todo o EAD e espalhar sobre os lóbulos cerebrais para o VNC (seta). (F) As células clonais invadindo o VNC (close-up da região marked pela seta em E), foram enriquecidas para o sinal de DsRed. (AC) Mostrar projeções de várias seções confocal, (E) é costurada a partir de imagens confocal 3x3 e (D, F) representam única seção. Barras de escala = 50 uM. EAD, olho / disco da antena; BL, lóbulo cerebral; VNC, cordão nervoso ventral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. De linhagem específica HML Δ -DsRed repórter transgénico revela o enriquecimento de Ras V12 Scrib 1 hemócitos associado a um tumor (A) Em EAD controlo, hmlΔ-DsRed Clu hemócitos repórter marcado sters estão presas nas cavidades do olho e do epitélio das antenas. Tecido EAD e do cérebro composto de Scrib ras V12 (B) 1 tumores marcadas com GFP mostrou um aumento do número de hemócitos espalhados por todo o tecido clonal. (C) O número de hemócitos associado diminuiu drasticamente após a inibição da sinalização JNK em Ras V12 Scrib 1 jnk DN tecido mosaico. Hemócitos positivos (DE) HmlΔ-DsRed também foram marcados com um anticorpo que detecta o H2 Hemese marcador pan-hemócitos. (AC) Mostrar projeções de seções múltiplas confocal, (A) é costurada a partir de 2 x 2 e (BC) são costuradas a partir de 3 x 3 imagens confocal. (DE) Representar seções individuais. Barras de escala = 100 mm (AC) e 10 mm (DE). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:.. A avaliação da qualidade e quantidade de ARN total isolado a partir de EAD dissecados (A) Um exemplo representativo dos resultados de qRT-PCR utilizando quatro réplicas biológicas para cada genótipo níveis de transcritos foram normalizados para MMP1 rp49. Dobram mudanças na expressão gênica foram calculados utilizando o padrão relativo método da curva 32. Os dados são valores médios ± SEM; *** P <0,001 pelo teste t bicaudal não pareado de Student com variância desigual. (B, C) Avaliação da qualidade do RNA total e quantidade usando um sistema de eletroforese automatizada. A imagem do gel virtual (B) mostra as duas bandas proeminentes das 18S e 28S ARNr que correspondem aos picos bem definidos no electroferogramas (C). contaminação de ADN e da degradação de ARN são reflectidas pelas quantoMear (setas) e bandas supranumerários e picos (setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| linhagens de moscas | Fonte / Comentários |
| eyFLP1; act> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, banheira-Gal80 | eyFLP-marcm 82B Verde Tester 11 |
| W; UAS-Ras V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| W; UAS-Ras V12; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| W; hmlΔ-DsRed; FRT82B | Neste estudo, W; hmlΔ-DsRed de Katja Brückner 28 |
| W; UAS-Ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | este estudo |
| W; UAS-Ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | este estudo |
| W; TRE-DsRed; FRT82B | Neste estudo, W; TRE-DsRed de Dirk Bohmann 26 |
| W; UAS-Ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | este estudo |
| W; UAS-Ras V12 TRE-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | este estudo |
Tabela 1: Resumo das linhas de Drosophila utilizadas neste estudo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As técnicas para gerar mosaicos genéticos em Drosophila estão entre as ferramentas mais sofisticadas para analisar e manipular a função do gene 33. O sistema eyFLP-marcm provou poderoso e robusto, uma vez que permite a indução do visualmente marcados, clones geneticamente definidas de uma maneira espacialmente restrita, isto é, em tecidos em que o potenciador é activa sem olhos 9,18. Isto é particularmente importante quando múltiplas lesões genéticas são combinados nas mesmas células. Enquanto estes remendos altamente aberrantes permitir o desenvolvimento das larvas quando restrito a EAD e cérebro neuroepithelia, eles podem causar letalidade quando espalhados por todo o corpo larval como no caso dos clones de choque de calor controlados FLP (hsFLP). Significativamente, a indução de clones no epitélio mosca EAD em que activado oncogenes combinam com perda de supressores de tumor recapitula o surgimento e progressão de tumores epiteliais sólidos em alguns cancros humanos. HoWever, o sistema também tem as suas limitações que serão discutidas brevemente. Dado que os insectos têm um sistema circulatório aberto, como verdadeiros metástases observadas em cancros humanos não ocorrem. Por conseguinte, o complexo processo de disseminação metastática não pode ser modelado fielmente em Drosophila. No entanto, os tumores EAD, como os clones ras V12 Scrib 1 exibem propriedades malignas como eles quebram a membrana basal em torno do EAD e invadir o cérebro adjacente 11,12,31. O grau de agressividade do tumor pode ser quantificada e comparada entre os genótipos diferentes, tal como descrito neste estudo. É também importante notar que a presença de lesões genéticas específicas em EAD mosaico pode afectar a temporização e a duração do desenvolvimento do crescimento das larvas. Encenação de larvas irá determinar se a análise do tecido mosaico será feita utilizando animais da mesma fase cronológica ou de desenvolvimento. A realização de uma experiência piloto para avaliar o impacto de umnovo genótipo clonal EAD no tempo de desenvolvimento é desejável.
Há limitações técnicas. Primeiro, o número de diferentes genótipos clonais que pode ser construído com a ferramenta eyFLP-marcm é grande, mas não é infinito. Por exemplo, a combinação de dois alelos mutantes que residem em diferentes cromossomos é prejudicada pela baixa eficiência de recombinação em ambos os cromossomos simultaneamente, e genes localizados no cromossomo pequeno quarta são geralmente inacessíveis. Gene knockdown usando RNAi transgênico é uma solução alternativa. No entanto, é importante perceber que os transgenes não são expressos imediatamente após a recombinação mitótica - não até que o repressor Gal80 é degradada. A actividade do sistema de expressão / Gal4 UAS pode ser reforçada por larvas de crescer a 29 ° C. É, no entanto, importante ter em mente que a temperatura elevada afeta vários parâmetros de desenvolvimento, fisiológicos e moleculares, incluindo a taxa de crescimento, o tempo de desenvolvimento, Metabolism ea expressão gênica 34-37. Assim, adaptações dos protocolos fornecidos, tais como preparo das larvas ou o número de EAD dissecados para profiling transcriptoma seria necessário.
Os testadores eyFLP-marcm não estão entre as cepas mais saudáveis. Os múltiplos transgenes em um compromisso genoma voar de fitness e fecundidade. Estes estoques requerem atenção extra para ser mantido e ampliado para grandes coleções de fêmeas virgens. Conforme documentado no presente estudo, a linha tester marcm 82B Verde 11, embora viável quando homozigoto, é geneticamente instável. Isto é óbvio a partir do aparecimento espontâneo de "larvas leopardo" que são apresentados clones ectópica, marcado com GFP dentro de vários tecidos poliplóides incluindo o intestino, traqueia, gordura corporal, e da epiderme de larvas. Este fenómeno ocorre em todos os cruzamentos independente do genótipo paterno. Presumimos que os patches GFP ectópicas resultar de descontrolado recombinação, estocástica entre os dois FRSites de T na cassete FLP-out, causando a remoção do marcador + amarela e da "cassete STOP". Nos tecidos poliplóides, a tubulina conduzido pelo promotor Gal80 repressor pode ser insuficiente para bloquear a actividade de GAL4. A presença de células geneticamente modificadas em outros tecidos do que a EAD e o cérebro pode provocar sinais sistémicos que possam afectar o comportamento dos clones experimentais. Estes "larvas leopardo" deve, portanto, ser excluídos da análise. Além disso, nós rotineiramente restabelecer o testador marcm 82B Verde de cruzamentos único macho-fêmea.
Apesar das armadilhas mencionadas acima, as aplicações do sistema eyFLP-marcm para estudar as funções dos genes e as interacções entre tumores clonais e seu ambiente são múltiplas. Introdução dos sistemas de Gal4 / UAS independente de expressão binária, como LexA / LexOp 38 ou drogas QF controlável / quas / QS 39,40 proporcionaria uma multa controle sobre exp transgeneression e / ou rotulagem simultânea e manipulação de diferentes populações de células, incluindo células clonais, não-clonais epiteliais e hemócitos. Tais tecidos de mosaico pode ser novamente processado de acordo com os protocolos aqui descritos.
O método para a dissecção de complexos / cerebrais mosaico EAD e EAD da larvas de terceiro estádio (Protocolo secção 3) pode ser aplicada a fases precoces do desenvolvimento, bem. É importante ressaltar que o protocolo para complexos EAD / cerebrais permita a cobrança da asa, haltere e perna discos imaginais. Caso estes ser utilizados para o isolamento de ARN (secções 3.3.2 Protocolo e 7), o disco de interesse devem ser limpos de tecido estranho e processados de forma semelhante ao EAD. Dada a sua dimensão menor, o número de discos de haltere e perna recolhidos deve ser aumentado de adquirir uma quantidade suficiente de ARN.
O protocolo para a extracção de ARN total de DAE (secção Protocolo 7) baseia-se em reagente de lise de ARN disponíveis a partir de diferentes v comercialendors (ver lista de materiais / equipamentos). O sucesso global do procedimento depende principalmente: (i) ter número suficiente de larvas, (ii) ser rápido e preciso, enquanto dissecando, e (iii) manter amostras livres de RNases. Manter o espaço de trabalho e instrumentos limpo, usando luvas, usando utensílios de plástico livre de RNase e soluções, e manter as amostras em gelo reduzem a degradação do RNA. Para evitar a contaminação de ARN com qualquer ADN genómico que não pode ser completamente removida pelo tratamento com DNase (Protocolo secção 7.11), é crítico para evitar a interfase ao recolher a fase aquosa, pela primeira vez (Protocolo secção 7.6). Tanto a contaminação de ADN e da degradação de ARN pode ser revelada por execução de amostras num sistema de electroforese automatizada (Figura 6B, 6C). O protocolo de isolamento do RNA tem uma aplicação mais ampla. Ele tem sido usado com sucesso para a extracção de ARN a partir de larvas de todo em diferentes fases de desenvolvimento, a partir de adultos, e váriosórgãos larval. O RNA obtido foi adequado para a análise de transcriptoma do genoma por ARNm-20,24,41,42 SEQ qRT-PCR e. Comparado a qRT-PCR que quantifica dezenas de mRNAs selecionados, no máximo, imparcial sequenciamento mRNA permite análises de expressão de todo o genoma. Assim, pode-se comparar inteiras assinaturas transcriptoma de tumores induzidos por lesões genéticas específicas em fases distintas de tumorigênese 24. É importante ter em mente que o RNA vem dos discos inteiros, de modo que os resultados não só irá reflectir as alterações nos clones mas também no tecido circundante, não clonal. Executando célula fluorescente activate (FACS) em EAD mosaico dissociado mediante a adaptação de protocolos disponíveis 43,44 podia ser aplicado para determinar a assinatura de transcrição específicos de populações celulares, por exemplo, clonal (GFP +) e não clonal (GFP -) células.
O protocolo de fixação e imunocoloração aqui descrito é adequado para simulvisualização simultânea de proteínas de interesse com anticorpos e atividade dos repórteres transgênicos específicos. Tanto o sinal de GFP marcação células clonais e DsRed fluorescência produzida por qualquer um dos dois repórteres transgénicos utilizados neste estudo são conservados em toda a fixação e imunocoloração e pode ser directamente visualizadas por microscopia confocal. No entanto, os anticorpos contra as proteínas fluorescentes pode amplificar a intensidade do sinal. Similarmente, o uso de um anticorpo anti-β-galactosidase irá facilitar a detecção de repórteres transgénicos com base no gene lacZ bacteriana. Repórter actividades relativas podem ser avaliadas medindo as intensidades de pixel relativas dos clones contra o tecido usando software de análise de imagem não clonal (por exemplo, ilhas Fiji, ImageJ). Ao comparar a actividade repórter entre os diferentes genótipos clonais, as configurações de aquisição de imagem deve ser mantida constante (secção Protocolo 5 e referências 21,22). Embora o protocolo funciona bem com muitos um diferententibodies, pode ser necessário optimizar as concentrações de anticorpos recomendadas. Alterações pode também ser necessária em vez de fixação, tipo e concentração de detergente (Triton X-100, Tween-20, saponina) e o fixador (8% PFA, 4% de formaldeído, EtOH).
Ao contrário dos protocolos acima discutidas, a quantificação de invasividade tumoral é limitada à fase de larva de terceiro instar e o complexo EAD / cérebro. No entanto, a sua fundamentação global pode ser aplicado a todos os estudos quantitativos, onde viés cognitivo precisa ser evitado. O método requer rigor. Com o aumento da malignidade do tumor em tempo, é essencial para comparar as larvas da mesma idade (por exemplo, 7 ou 8 dias após a postura de ovos). Com o tempo um tumor clonal podem crescer demais maciçamente, mas as células tumorais podem permanecer dentro do EAD. O passo no qual cérebros são separados da DAE (Protocolo secção 4.4.1) é, por conseguinte, crítica para evitar contagens invasividade falso-positivos. Montagem de cérebros com o EAD anexado vai Flattpt os tecidos, fazendo com que a EAD coberto para cobrir as estruturas cerebrais e, assim, evitar qualquer quantificação. Idealmente, gostaria de capturar o processo invasivo diretamente na larva viva. repórteres transgénicos para visualizar as populações de células e tecidos envolvidos estão disponíveis e podem ser combinadas com o sistema de eyFLP-marcm. Infelizmente, o processo invasivo leva várias horas a dias, um período de tempo que é incompatível com a manutenção das larvas vivas enquanto ainda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
