Introduction
Polyploidi er observeret ikke kun i specialiserede væv hos pattedyrarter, men også i en række forskellige patologiske tilstande, såsom cancer og degenerative sygdomme. Polyploide (hovedsagelig tetraploide) celler er ofte observeret i præneoplastiske læsioner af humane væv, såsom Barretts øsofagus 1,2 eller skællede intraepithelial læsioner af cervix 3,4, og er blevet anset for at være kilden til maligne aneuploide celler i disse væv 5 6. Selv om det antydes, at omdannelsen af tetraploid til aneuploide celler kunne være en afgørende begivenhed i de tidlige stadier af tumorigenese, er involveret i denne proces mekanismer ikke fuldt forstået. Dette er dels fordi ingen in vitro model har været til rådighed, hvor ikke-transformerede polyploide humane celler kan formere sig.
Nogle forskere har fremkaldt tetraploidy i ikke-transformerede humane epitelceller gennem generering af binucleated celler ved inhibiting cytokinese 7-9. I denne fremgangsmåde er imidlertid unødvendige diploide celler skal elimineres ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) 7,8 eller kloning ved begrænsende fortynding 9. Fordi disse procedurer er arbejdskrævende og ikke let at udføre, til enklere metoder etablere transformerede tetraploide celler ønskes for forskning på dette område.
I nærværende rapport beskriver vi en protokol til at etablere proliferative tetraploide celler fra normale humane fibroblaster eller telomerase-udødeliggjort humane fibroblaster ved relativt enkle procedurer. Procedurerne bruger spindel gift demecolcin (DC) anholdelse diploide celler i mitose og mitotiske celler indsamlet af ryste yderligere behandlet med DC. Diploide mitotiske celler behandlet med DC i længere tid konvertere til tetraploide G1 celler, og disse celler formere så tetraploide celler efter vækst anholdelse i flere dage efter fjernelse narkotika. Denne protokol giveren effektiv fremgangsmåde til at skabe en nyttig model til at studere forholdet mellem kromosom ustabilitet og den onkogene potentiale polyploide humane celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Opnå cellerne for at inducere tetraploidy. Hidtil er det blevet bekræftet, at denne teknik kan anvendes på de humane fibroblast-cellelinjer TIG-1, BJ, IMR-90 og telomerase-immortaliserede TIG-1 (TIG-HT).
- Grow celler i minimalt essentielt medium med α ændring eller enhver anden celle dyrkningsmedium egnet til celletypen, der skal undersøges suppleret med 10% (vol / vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS) ved inkubation i en 5% (v / v) CO2-atmosfære ved 37 ° C. Passage celler hver 3 eller 4 dage ikke at overskride subkonfluerende tæthed.
BEMÆRK: Befolkning fordobling niveau (PDL) skal beregnes hver gang ved passage til at evaluere cellevækst og celle alder. PDL kan beregnes ud fra antallet af celler podet i en skål (N1) og antallet celle høstet ved næste passage (N2) under anvendelse af følgende formel (X er den oprindelige PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. Induktion og Establishment af Tetraploide Celler fra Diploide fibroblaster
- Fremkald tetraploidy uden ryste-off.
BEMÆRK: Visse cellestammer (f.eks TIG-1) kan blive næsten helt tetraploid ved kontinuerlig behandling med demecolcin (DC) som følger.- Passage celler i en eller to 100 mm skåle på dagen før behandling for at fremkalde tetraploidy. Normalt forberede 5 x 10 5 til 1 x 10 6 celler pr skål for induktion af tetraploide celler.
- Behandl eksponentielt voksende celler med medium indeholdende 0,1 ug / ml DC i 4 dage.
- Erstat DC-holdigt medium med lægemiddel-frit medium og inkuberes celler i en 5% (v / v) CO2-atmosfære ved 37 ° C. Celler normalt genoptage spredning inden for 1 uge.
- Fremkald tetraploidy med ryste-off.
BEMÆRK: De fleste celler bliver en blanding af diploide og tetraploide populationer som følge af den simple behandling med DC beskrevet ovenfor (2.1). Derfor er nogle ændringer af pROCEDURE at eliminere en diploid population er nødvendige som følger (figur 1).- Passage celler i flere T75 kolber dagen før behandling for at inducere tetraploidy. Sædvanligvis fremstilles mindst 5 x 10 6 celler (1 x 10 6 celler pr kolbe) til induktion af tetraploide celler.
- Behandl eksponentielt voksende celler med medium indeholdende 0,1 ug / ml DC i 16 - 18 timer for at standse celler i mitose. Den nødvendige tid til at standse celler i mitose kan afhænge af målceller og bør bestemmes ved indledende eksperimenter for at få så mange mitotiske celler som muligt. For eksempel bør langsommere voksende celler behandles med DC i længere tid end hurtigere voksende celler.
BEMÆRK: Hvis cellerne behandles for længe i dette trin, kan de gennemgå mitotisk skred og holde sig til fadet overflade, hvilket gør det umuligt at indsamle mitotiske celler ved ryste-off i det næste trin. - Saml DC-arresteret mitotiske celler ved ryste-off metoden, i which løst adhærerede mitotiske celler opsamles ved forsigtig omrystning af kolberne og vask med medium efterfulgt af centrifugering (300 x g, 5 min). Tæl celle nummer ved hjælp af en passende metode i dette trin.
- Reseed opsamlede mitotiske celler i 60 mm dyrkningsskåle og behandle celler med 0,1 ug / ml DC i yderligere 3 dage. Frø mere end 1 x 10 6 mitotiske celler pr skål, fordi mindre end 10% af cellerne kan overleve denne behandling.
- Udskift DC-medium med stoffri medium og vente på celler til at genoptage spredning, hvilket normalt sker inden for 1 uge.
- Passage-celler ligeledes til de oprindelige diploide celler.
3. Undersøgelse af DNA ploidi
BEMÆRK: Dette er en veletableret procedure og en teknisk håndbog bør henvises til for detaljerede procedurer og tekniske tips.
- Harvest celler (5 x 10 5 - 1 x 10 6) ved inkubering af celler med en opløsning conTaining 0,05% trypsin og 0,02% EDTA i 10 minutter ved 37 ° C og neutraliseres trypsin ved medium indeholdende 10% FBS.
- Centrifuger cellerne i medium og vaskes ved resuspendering i 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af centrifugering (300 x g, 5 min).
- Forbered cellerne til DNA-analyse af en af de følgende to metoder
- En fremgangsmåde til at analysere ikke-fikserede celler 10
BEMÆRK: Denne metode kan udføres under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit til cellecyklus-analyse. Prøver fremstillet med denne metode bør analyseres straks, fordi cellerne ikke er fastsat i proceduren og farvede kerner vil blive beskadiget over tid.- Vask cellerne med 40 mM citratpuffer indeholdende 250 mM sucrose. Efterfølgende behandle cellerne med 250 pi 0,1% (v / v) Nonidet P40 og 30 ug / ml trypsin i 200 pi af 40 mM citratpuffer indeholdende 250 mM sucrose i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 200 pi 0,5 pg / ml trypsin inhibitor og 0,1 ug / ml RNase A i 40 mM citrat buffer indeholdende 250 mM saccharose, og der inkuberes cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 200 pi 0,4 mg / ml propidiumiodid (PI) i 40 mM citrat buffer indeholdende 250 mM saccharose og inkuberes celler i 10 minutter ved stuetemperatur for at farve cellekerner.
- En fremgangsmåde til at analysere fikserede celler
- Fix celler med 80% ethanol ved at suspendere celler i 1 ml PBS, tilsætning af 4 ml 100% EtOH dråbevis under blanding cellesuspensionen og forlader den ved stuetemperatur i 30 min. Celler i dette fiksativ kan opbevares ved -20 ° C i flere uger.
- Vask cellerne ved resuspendering dem i 5 ml PBS efterfulgt af centrifugering (300 x g, 5 min). Behandle celler med 0,5 mg / ml RNase A og plette dem med 50 ug / ml propidiumiodid (PI) (475 pi 0,5 mg / ml RNase A og 25 pi 1 mg / ml PI) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- En fremgangsmåde til at analysere ikke-fikserede celler 10
- Analyser DNA-indholdet i than celler under anvendelse et flowcytometer med et 488 nm laser og røde kanal emission filter (langpassage> 610 nm). Analysere en referenceprøve fremstillet fra ægte diploide celler på samme tid at vurdere ploidi af målcellerne.
- Alternativt tilsættes fluorescens faste perler at vurdere fluorescensintensiteten forholdet mellem diploide celler vs. perlerne. Brug 'puls højde vs. pulsbredde' mulighed for flowcytometeret at skelne mellem enkelte tetraploide celler og klumper af diploide celler 11.
4. Undersøgelse af kromosom Tæller og Karyotype Analyse
BEMÆRK: Disse er alle veletablerede procedurer og en teknisk manual eller producentens protokoller bør henvises til for detaljerede procedurer og tekniske tips.
- Forkæl eksponentielt voksende celler med 0,1 mg / ml DC i 4 timer til at anholde celler i metafase.
- Forbered kromosom slides.
- Centrifuger cellerne i medium (300 xg 5 min) og behandles med hypotonisk opløsning (5 ml 0,075 M KCI) ved 37 ° C i 10 min.
- Fix og suspendere cellerne i Carnoys fiksativ (methanol: eddikesyre = 3: 1).
- Spred celler på et objektglas ved at droppe et lille volumen (25 - 35 uL) af cellesuspension. Yderligere skridt såsom udsættelse for varm damp kan være nødvendigt for at forbedre kromosom spredes.
- Kromosom tæller.
- Farv celler med 5% Giemsa-opløsning (eller 5 ug / mL PI indeholdende 0,5 mg / ml RNase A for fluorescensmikroskopi) i 15 - 20 min.
- Digitalt fotografi mindst 50 celler i metafase.
- Tæl kromosom nummer per celle under anvendelse af et billedanalysesystem software efter manuel adskillelse af rørende og overlappende kromosomer ved hjælp af et foto redigeringsprogram. Selvom kromosom nummer kan scoret manuelt, anbefales edb scoring.
- karyotype analyse
BEMÆRK: Denne analyse skal udføres af en uddannet tekniker eller en professionel virksomhed.- Farv celler ifølge en standard G-banding teknik 12.
- Analyser kromosomer at gøre standard karyograms 12.
- MFISH
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og bør udføres om nødvendigt.- Farv celler under anvendelse flerfarvet FISH prober til humane kromosomer ifølge fabrikantens protokol 13.
- Analyser kromosomer under anvendelse af et fluorescensmikroskop med egnede filtre og en software til MFISH analyse 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er vores erfaring, kan TIG-1 celler gøres næsten helt tetraploid ved simpel kontinuerlig behandling med 0,1 mg / ml DC i 4 dage (figur 2A). I modsætning hertil er andre fibroblast stammer, såsom BJ eller IMR-90, og TIG-HT-celler, blev en blanding af diploid og tetraploide populationer efter samme behandling, og isolering af mitotiske celler ved ryste-off-metoden er nødvendig i løbet DC behandling (sædvanligvis 16 - 18 timer efter start af behandling) (figurerne 2B, C). Efter yderligere behandling med DC i 3 dage, celler undergik vækststandsning og udviste stor, fladtrykt morfologi i flere dage. Inden for en uge i almindelighed små prolifererende celler dukkede blandt de store flade celler (figur 3). Celler blev næsten helt tetraploid i 2 - 3 uger efter DC behandling. Det kromosomtal i etablerede tetraploide celler var 92 i de fleste tilfælde, except at en af de tetraploide cellelinjer etableret fra TIG-HT-celler havde 91 kromosomer i de fleste celler (figur 4). Etablerede tetraploide celler voksede på næsten samme hastighed som diploide celler (figur 5). Tetraploide cellelinjer etableret fra ikke-immortaliserede celler viste en nogenlunde ens replikativ levetid som de oprindelige diploide celler, mens dem fra immortaliserede celler syntes at være også udødelig (figur 5). Tetraploide celler etableret fra ikke-immortaliserede TIG-1-celler viste en normal karyotype undtagen for at have en tetraploid kromosom nummer (figur 6 øverste panel), mens dem fra immortaliserede TIG-1 (TIG-HT) celler viste temmelig komplicerede klonale aberrationer (figur 6 midterste og nederste paneler). Hyppigheden af klonale afvigelser i de sidstnævnte celler (TIG-HT-4n) steg fra 2,5 aberrationer pr celle ved 255 population fordobling niveauer (PDL'er) til 5,2 aberrationer pr celle ved 450 PDLmed gentagne subkulturer.
Figur 1: Skematisk illustration af protokollen for Induktion af Tetraploidy. For at opnå tetraploide celler med minimum forurening af diploide celler, er nødvendigt for de fleste celle stammer (lavere illustration) en kombination af mitotisk ryste-off og DC behandling, mens nogle cellestammer (f.eks TIG-1) kan blive næsten helt tetraploid ved kontinuerlig behandling med demecolcin (øverste billede). 1) Behandl celler i T75 kolber (mindst 5 x 10 6) med 0,1 mg / ml DC i 16 - 18 timer (tid bør bestemmes af indledende forsøg) anholdelse celler i mitose. 2) Saml mitotiske celler ved ryste-off metoden og reseed i 60 mm petriskåle. 3) Behandl celler med 0,1 ug / ml DC i yderligere 3 dage. 4) Der inkuberes celler i stoffri medium (normalt celler genoptage proliferation inden for 1 uge). Scale søjler repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNA Histogrammer af fibroblaster Før og Efter behandlinger for Induktion af Tetraploidy. (A) TIG-1-celler. Denne celle stamme bliver tetraploid ved simpel kontinuerlig behandling med 0,1 ug / ml DC i 4 dage. (B) BJ-celler. Fordi denne celle stamme bliver en blanding af diploide og tetraploide populationer følgende simple behandling med DC (venstre paneler), isolering af mitotiske celler afrystning er nødvendig under DC behandling for at etablere tetraploide celler (højre paneler). (C) TIG-HT (telomerase-immortaliserede TIG-1) celler. Disse celler skal også udarbejdes af en kam gennemgang af DC behandling og ryste-off for etablering af tetraploide celler. Tal i histogrammerne repræsenterer tid (dage) efter fjernelse lægemiddel. Abscissen repræsenterer DNA-indhold (C, komplement). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative mikrofotografier af BJ-celler behandlet med DC. (A) BJ-celler behandlet med 0,1 ug / ml DC i 16 timer. Mange celler standset i mitose kan ses. (B) I slutningen af DC behandling. Næsten alle celler er vækst-anholdt. (C) 7 dage efter DC behandling. Små prolifererende celler blandt store flade celler kan ses. (D) 14 dage efter DC behandling. Celler aktivt voksende. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative Mikrofotografier af kromosomer og histogrammer af kromosom nummer for Tetraploide Celler Etablerede fra hver celle Strain. Top, midterste og nederste paneler repræsenterer tetraploide celler etablerede fra TIG-1 (2 uger efter DC behandling), BJ (2 uger efter DC behandling) og TIG-HT (7 uger efter DC behandling) celler hhv. Kromosomer blev scoret i mindst 50 metafaser. Tal i histogrammer er kromosomtal numre. Klik her for at se en større version af dette tal.
ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg "/>
Figur 5: Repræsentative Vækst Profiler af humane fibroblaster (diploide celler) og Tetraploide Celler Etablerede fra Hver celle Strain. Venstre, center og højre paneler viser vækst profiler af originale TIG-1, BJ og TIG-HT-celler (åbne markører) og de tetraploide celler etableret fra hver celle stamme (lukkede markører). Celler blev passeret to gange om ugen og PDL'er blev beregnet ud fra celletal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentant Karyograms af G-banding og MFISH. Top panel viser et karyogram af G-banding af tetraploide celler etablerede fra TIG-1 (2 uger efter DC behandling). Midterste og nederste paneler viserkaryograms af MFISH for tetraploide celler etablerede fra TIG-HT-celler (15 og 41 uger efter DC behandling). Karyotyper var baseret på 10 celler (TIG-1) eller 20 celler (TIG-HT). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et stort problem i induktion af tetraploidy fra diploide celler ved kemiske midler, enten ved cytokinese inhibitorer eller ved tentraadsinhibitor, er, at cellerne bliver ofte en blanding af diploide og tetraploide populationer, og tetraploide celler skal være adskilt fra diploide celler. Mest almindelige tilgange til isolering af en tetraploid befolkning fri for diploide celler bruger FACS eller kloning ved at begrænse fortynding. Men disse procedurer er arbejdskrævende og ikke let at udføre. I denne rapport præsenterer vi en ny protokol til at etablere proliferative tetraploide celler fri for en diploid population fra normale humane fibroblaster. Protokollen anvender spindel gift DC for standsning diploide celler i mitose, og standset mitotiske celler er adskilt af omrystning-off fra diploide interfaseceller, der klæbede til skålen overflade. Opsamlede celler behandles med DC i yderligere 3 dage, og diploide mitotiske celler konvertere til tetraploide G1 celler ved denne forlængede DC behandling formodentlig by checkpoint tilpasning (også kaldet mitotisk skred). Disse celler genstart cellevækst som tetraploide celler efter vækst anholdt for flere dages fjernelse narkotika.
En fordel ved denne fremgangsmåde er, at procedurerne er forholdsvis enkel og gennemførlig i forhold til de, der anvender FACS eller kloning til isolering tetraploide celler. Metodens begrænsninger er følgende. Anvendelse på andre end fibroblaster celletyper, såsom epitelceller, er ukendt. Dette bør bekræftes i fremtidige studier. En lille diploid population kan blive i nogle tilfælde. Men disse celler tendens til at aftage med seriel passage. Hvis en betydelig diploid population fortsætter efter DC behandling, en højere koncentration af DC (1,2 - 1.5 ug / ml) eller længere behandling med DC efter shake-off (4 dage i stedet for 3 dage) kan forbedre resultatet.
De mest kritiske trin i denne protokol er følgende. For det første er behandlingstiden med DC for enrresting celler i mitose før ryste-off er kritisk. Selv om denne behandling tid bør være lang nok til at samle så mange mitotiske celler som muligt, behandling for længe kan forårsage mitotisk skridning og adhæsion til skålen overflade, hvilket gør det umuligt at indsamle de mitotiske celler afrystning. Fordi et passende tidspunkt for maksimal udvinding af mitotiske celler kan afhænge af målcellerne, bør det bestemmes ved indledende forsøg. Dels den ryste trin adskille mitotiske celler fra interfaseceller er også kritisk. I dette trin diploide mitotiske celler, som er løst klæbet til skålen overflade, opsamles ved forsigtig omrystning af kolberne, efterfulgt af centrifugering. Denne mitotiske ryste-off adskiller mitotiske celler arresteret af DC fra overholdes interfaseceller der kan være oprindelsen af forurening med det diploide befolkning senere. Shaking voldsomt kan forårsage bobledannelse i mediet, som kan skade cellerne, og også frigørelse af interfase-celler, resulting i forurening af diploide celler. En anden faktor, der kan påvirke succes ved denne fremgangsmåde er dyrkningsmediet. Fordi robust vækst stimulation synes at være nødvendig for inddrivelse af proliferation efter DC behandling, bør næringsrige medium såsom MEM-α anvendes til at støtte udbredelsen af tetraploide celler. Forøgelse FBS koncentration til 20% i det endelige trin af induktion af tetraploide celler (2.2.5) kan også øge succesen af denne fremgangsmåde.
Ved hjælp af denne protokol, har vi til dato produceret tetraploide celler fra human fibroblast stammerne TIG-1, BJ, IMR-90 og telomerase-udødeliggjort TIG-1 indtil nu 14-16. Blandt disse cellestammer, TIG-1 er temmelig usædvanligt, fordi denne celle stamme bliver næsten fuldstændigt tetraploid når de behandles kontinuerligt med DC, uden shake-off, i 4 dage. Grunden kun TIG-1-celler bliver helt tetraploid som følge af simpel behandling med DC er ukendt. mulig af forklaringennationer kan være, at en betydelig del af celler af andre typer anholdelser på diploid G1 fasen, når de behandles med DC og genoptager spredning efter behandling, mens (1) TIG-1 celler ikke arrestere på G1 med samme behandling, eller (2) en population af TIG-1 celler irreversibelt arresterer på G1 under samme behandling og ikke genoptager spredning derefter. Under alle omstændigheder, kan forskellige følsomheder af G1 checkpoint til DC være ansvarlig for de forskellige adfærd af cellerne efter kontinuerlig behandling med DC.
Under behandlingen af ætiologiske betydning af tetraploidy i tumorigenese, mange forskere har store bekymringer om status for p53-genet i tetraploide celler, fordi det er blevet foreslået, at tetraploidy inducerer p53-afhængig vækststandsning af celler, som benævnes "tetraploidy kontrolpunkt" 17-20. Hvis denne hypotese er korrekt, bør p53 signalering i prolifererende tetraploide celler inaktiveres. Imidlertid,tetraploide celler oprettet af vores protokol synes at have funktionel p53 trods vokser med næsten samme hastighed som diploide celler 15,16. Årsagen til denne uoverensstemmelse er ikke kendt på nuværende tidspunkt, og betydningen af p53 inaktivering i udbredelsen af tetraploide celler bør undersøges netop i fremtidige studier. Faktisk er tilstedeværelsen af en tetraploidy checkpoint der fungerer via p53 forbliver kontroversiel 21-23.
Selv ikke-transformerede polyploide celler, der kan udbrede in vitro er uundværlige for detaljeret analyse af kromosomal ustabilitet og den onkogene potentiale polyploide celler, disse celler har hidtil kun sjældent været tilgængelige. Vores protokol giver en enkel og gennemførlig metode til at etablere proliferative tetraploide celler fra normale humane fibroblaster, som kunne være en nyttig model til at studere de mekanismer, der fører til transformation af polyploide humane celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M.
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D.
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
