Introduction
Het doel van deze studie was een positron emissie tomografie / computertomografie (PET / CT) gebaseerde methodologie voor de in vivo, real-time opname van glucose kwantificering van de bloedstroom in specifieke weefsels in muizen ontwikkelen. Dit werd bereikt met 18F gemerkte fluordeoxyglucose (FDG) tot glucoseopname en kinetische modellering meten om de snelheden van 18F-FDG opname schatten uit het plasma naar de intracellulaire ruimte, de transportsnelheid van intracellulaire ruimte plasma en het percentage 18F-FDG fosforylering.
In knaagdieren is 18F-FDG gebruikt in de pre-klinische evaluatie van talrijke kankerbehandelingen 1, studies van tumorprogressie 2 en tumormetabolisme 3 en afbeelden van bruin vet depots 4, neuroinflamation 5 en 6 hersenenmetabolisme
Traditionele methoden voor het weefsel specifieke opname van glucose in muizen (en ratten) onderzoeken omvatten in het algemeen een behandeling met 2-deoxyglucose radioactief gemerkt met hetzij 3H of 14C gevolgd door euthanasie, inzameling weefsels en meting van de radioactiviteit in elk weefsel 7. Het gebruik van PET / CT maakt een niet-invasieve bepaling van glucoseopname en metabolisme in meerdere organen en gebieden gelijktijdig in levende dieren. Bovendien euthanasie is geen vereiste, deze techniek is geschikt voor toepassing in longitudinale studies.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) wordt gekenmerkt door verstoord glucosemetabolisme en hyperglykemie door een verminderde weefsel gevoeligheid voor insuline (insulineresistentie) en het onvermogen van pancreas-cellen om voldoende hoeveelheden insuline produceren 8. Kinetische analyse van de opname van glucose en metabolisme kunnen belangrijke inzichten in te verstrekkenhet werkingsmechanisme en de werkzaamheid van therapeutische interventies en zorgen voor geavanceerde monitoring van ziekteprogressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in deze studie beschreven procedures werden goedgekeurd door de Sydney Local District van de Gezondheid en de Universiteit van Sydney Animal ethische commissies en volgde de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, achtste editie (2011).
1. Bereiding van dieren
Opmerking: In dit protocol mannelijke db / db-muizen (BKS.Cg- Dock7 m + / + db LepR / J) werden groepshuisvesting met ad libitum toegang tot Chow en water gehandhaafd tot 6 weken. Op het moment van de beeldvorming, muizen wogen ~ 30 g. Alle muizen die in dit protocol had nuchtere bloedglucosegehalte tussen 10 en 14 mmol / l.
- Indien nodig, snel de muizen. In het onderhavige voorbeeld, de muizen vasten gedurende 5 uur voorafgaand aan de experimentele procedure.
- Behandel muizen met het gewenste middel (bijvoorbeeld geneesmiddel, eiwit, peptide) vóór het begin van de beeldvorming. In dit voorbeeld dienen een subcutane injectie met insuline (3U / kg humaan insuline) of een equivalent volume PBS 30 min voor het begin van de beeldvorming.
2. Stel Workflow
Opmerking: Dit protocol werd toegepast op een PET / CT scanner. Verwerven PET data, gevolgd door verwerving van de CT-gegevens.
- PET-instellingen:
- Selecteer isotoop 18F, ingesteld scantijd tot 3600 s, en bovenste en onderste niveau energie discriminatie 350 keV - 650 keV (standaard) met toeval tijdvenster van 3,432 ns (standaard). Histogram list-modus gegevens in 16 frames (6 x 10 s, 4 x 60 sec, 1 x 300 en 5 x 600 s) de periode 0-60 minuten na injectie tracer. Reconstrueren emissie sinogrammen behulp 2D-FBP met een zoom 1.5.
LET OP: De gereconstrueerde beelden bestond uit 16 dynamische frames, elk met 128 × 128 × 159 voxels en een voxel afmeting van 0,52 x 0,52 x 0.796 mm 3.
- Selecteer isotoop 18F, ingesteld scantijd tot 3600 s, en bovenste en onderste niveau energie discriminatie 350 keV - 650 keV (standaard) met toeval tijdvenster van 3,432 ns (standaard). Histogram list-modus gegevens in 16 frames (6 x 10 s, 4 x 60 sec, 1 x 300 en 5 x 600 s) de periode 0-60 minuten na injectie tracer. Reconstrueren emissie sinogrammen behulp 2D-FBP met een zoom 1.5.
- CT-instellingen:
- Vooreen hele lichaam CT-scan, zet de stroom 500 A, voltage 50 kV, belichtingstijd 500 ms en 200 prognoses over een 360 rotatie. Stel de velddetector (FOV) tot 30.722.048, aantal bedposities 3 (volledige PET FoV meetbereik van) overlap tussen bedposities = 30,234713% en detector binning 4.
OPMERKING: CT reconstructie werd uitgevoerd met behulp van cone beam tomografie beeldreconstructie software met HU kalibratie, bilineaire interpolatie en Shepp-Logan filter.
- Vooreen hele lichaam CT-scan, zet de stroom 500 A, voltage 50 kV, belichtingstijd 500 ms en 200 prognoses over een 360 rotatie. Stel de velddetector (FOV) tot 30.722.048, aantal bedposities 3 (volledige PET FoV meetbereik van) overlap tussen bedposities = 30,234713% en detector binning 4.
- 18F-FDG:
- Bestellen voldoende 18F-FDG (bijvoorbeeld 450 MBq in 0,5 ml) van een lokale provider ~ 30 min vóór de eerste injectie. Aliquot en verdun het 18F-FDG zodat dieren ontvangen ~ 10 MBq 18F-FDG in een eindvolume van 0,1 ml.
3. Imaging Protocol
- Vegen inductie kamer en beeldopnamebed met 80% (v / v) ethanol aseptische omstandigheden te handhaven. Place de muis in een inductie kamer en verdoven met 5% isofluraan in zuurstof.
- Plaats de muis op een beeldopnamebed voorzien van een elektrisch verwarmingselement om lichaamstemperatuur en nauwkeurige vaporizer neuskegel aan isofluraan leveren (onderhoud, 1,5-2%) met een stroomsnelheid van 1 l / min. Breng oogzalf op de ogen tot droog te voorkomen, terwijl deze onder narcose.
- Positioneer de muis in een liggende positie op een sensorkussentje ademhaling controleren en zorgen voor een adequaat niveau van anesthesie gehandhaafd.
- Verwarm de staart met behulp van een warmtepakket gedurende 1-2 min aan de laterale staartader verwijden. Katheteriseren de laterale staartader door het met een 30-gauge naald in de laterale staartader. Bevestig de naald vast met chirurgische lijm en zet de katheter.
- Load beeldopnamebed in de scanner en het bed bewegen door de machine, zodat de katheter kan worden benaderd vanuit de achterkant van de machine.
- Bevestig de katheter naar de 18F-FDG spuit in een syringe driver. Bereken de exacte dosis 18F-FDG (10 MBq) op basis van activiteit spuit voor injectie en het toe te dienen volume (<100 gl, geïnjecteerd gedurende 10 s).
- Om de invloed van verdoving op de variabiliteit van glucoseopname minimaliseren, zorgen voor een constante tijd tussen de anesthesie en de injectie van 18F-FDG (bijvoorbeeld 30 minuten).
- Begint de PET scan onmiddellijk vóór injectie van 18F-FDG. Nadat de PET-scan (3,600 s), uitvoeren van een CT-scan (~ 10 minuten) om te co-registratie van radiotracer opname met weefsels.
- Beweeg de imaging bed naar de startpositie, verwijder het dier uit het bed.
- Op dit punt inslapen het dier of laten herstellen:
- Voor euthanasie uit te voeren cervicale dislocatie terwijl nog onder narcose en het verzamelen van organen van belang zijn voor verdere analyse.
- Indien waardoor de muis te herstellen, plaatst de muis in één behuizing op een verwarmingskussen ofvoor een warmtelamp. Bewaken van de muis totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Laat de muis om te herstellen gedurende 1 uur voordat hij terugkeerde naar groepshuisvesting.
4. PET Beeldverwerking
OPMERKING: Beeldreconstructie werd uitgevoerd met behulp van acquisitie werkplek software v1.5.0.28 en analyse in het onderzoek werkplek software v4.2.
- Co-register CT en PET-beelden en dat de uitlijning juist 3-dimensioneel is.
- In het menu 'Bestand' de optie 'Zoeken naar een map / Import' en selecteer de map met de gegevens. Selecteer de gewenste PET en CT-gegevens in en klik op het tabblad 'Algemeen Analysis'.
- Sorteer de gegevens, zodat de CR is aangeduid 'Source' en PET is aangeduid 'Target'. In het 'Workflow' menu, selecteer 'Registration'. Als de beelden moeten worden aangepast om de juiste co-geregistreerd, de tools te gebruiken in thmenu e 'Registratie'.
- In het 'Workflow' menu, selecteer 'ROI kwantificering'.
- Gebruik de functies van de 'Pan' en 'Zoom' in het tabblad 'Beeld' om de gewenste regio te vinden. In het menu 'Extra' selecteert u het tabblad 'Create' en klik op het penseel. Teken de ROI op het beeld
- Extract tijd-activiteit curves door het selecteren van 'Save ROI kwantificering' in het menu 'Opslaan'. Sla de gegevens als een CSV-bestand.
- Kwantificeren radioactiviteit opname als Bq per cm3 weefsel. Converteren waarden in percentage geïnjecteerde dosis per cm3 (% ID / cm3) door het laden van het CSV-bestand in een spreadsheet.
5. Voer Functie
- Om te corrigeren voor het systeem puntverdeelfunctie, Deconvolutie het geschatte systeem PSF 5 iteraties met de reblurred Van Cittert deconvolutiewerkwijze zoals eerder beschreven 9.
NB: Dit is nodig vanwege de geringe omvang van de vena cava in een muis. - Gebruik na deconvolutie beelden een bloed- invoerfunctie time-activiteitscurve gegenereerd zoals hierboven beschreven.
6. Kinetische modellering
NB: De twee FDG-weefselcompartiment model (Figuur 1) vereist het plasma invoerfunctie.
- Omzetten bloed invoerfunctie in het CSV-bestand aan het plasma invoerfunctie met de volgende vergelijking 10: Input_plasma Input_blood = x (0,386 e - 0.191t + 1.165).
- In de kinetische modeling tool klikt u op het 'Kinetic' te klikken. Importeer het weefsel en plasma totale activiteit tellen CSV-bestanden in de kinetische modeling tool door het selecteren van 'Load Time Activity Curve' in het 'Menu'.
- In het menu 'Model' te selecteren 2 weefsel compartimenten. Zorg ervoor dat het selectievakje naast k4 niet is geselecteerden geef een waarde van 0. Voor eerste afstelling het vinkje voor vB (bloedvolume fractie) en voert een waarde van 2%.
- Klik op de 'Fit huidige gebied'. Corrigeer de gewonnen regio van belang zijn voor dispersie 11, 12. Bereiken dit door het minimaliseren van de Chi-kwadraat waarde voor de FDG-model voor verschillende dispersie tijden.
- Voer een tweede fit behulp van drijvende vB waarde (het vakje naast het vak voor vB) en de geoptimaliseerde spreidingswaarde de regionale snelheidsconstanten te berekenen (1 k -k 3). Bereken de regionale instroom constant Ki = (K1 x k3) / (k + 2 k3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder gebruik gemaakt van de db / db muis model om de impact van de stijgende plasma apoA-I niveaus op de kinetiek van de opname van glucose en metabolisme 13 onderzoeken. In deze studie hebben we gebruik db / db-muizen behandeld met insuline om de bruikbaarheid van PET / CT toont tegenover de opname van 18F-FDG uit het plasma te controleren in de gastrocnemius spier in real time.
Zes weken oude db / db-muizen werden verdoofd en met 3 U humane insuline / kg of equivalent volume PBS via subcutane injectie 30 minuten voor aanvang van de PET-scan. Muizen ontvingen 10 MBq 18F-FDG via intraveneuze injectie en opname gemeten met PET gedurende 60 min. Een CT-scan gemaakt anatomische referentie.
Regio's van belang werden getrokken op de vena cava en de kuitspier met behulp van de CT-beelden (FFIGUUR 2). Behandeling van db / db muizen met insuline verhoogde de 18F-FDG activiteit in gastrocnemius ROI via acquisitie tijdsperiode (Figuur 3A). De waarden verkregen voor de vena cava ROI werden omgezet van bloed plasma waarden en veranderde niet door insulinebehandeling insuline behandelde muizen ten opzichte van controle (Figuur 3B).
Time activiteit curves werden geladen in de kinetische modeling tool voor de berekening van de kinetische parameters. De gegevens werden aanvankelijk aangebracht op twee weefselcompartiment methode k4 = 0 met Vb (bloed volumefractie) van 2% tot dispersie berekenen (80 s en 70 s voor PBS en insuline behandelde muizen, respectievelijk). Fitting werd vervolgens uitgevoerd met de bovengenoemde dispersie waarden en een zwevende Vb waarde.
Geen significant verschil in het tarief van 18 F-FDG transport van de arteriële plasma naar de intracellulaire ruimte (k 1) of de intracellulaire ruimte plasma (k2) werd waargenomen bij insuline behandelde muizen vergeleken met de controle (tabel 1). De snelheid van 18F-FDG fosforylering (k3) is aanzienlijk toegenomen insuline behandelde muizen (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 x 10 -2 min-1 gedurende PBS en insuline behandelde groepen, respectievelijk p <0,05 ). Insulinebehandeling ook sterk toegenomen instroom constante (Ki) vergeleken met de met PBS behandelde dieren (5,51 ± 4,25 x 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 x 10 -3 ml min -1 g-1, respectievelijk p <0,05).
Figuur 1: Regional curves tijd-activiteit werden gemonteerd op een twee-tissu e, driecompartimentenmodel, met C1 waarbij de concentratie van FDG in plasma en C2 en C3 de concentratie van FDG en FDG gefosforyleerd in weefsel resp. k 1 de FDG opnamesnelheid in weefsel, k2 de klaringssnelheid uit het weefsel terug naar de plasma compartiment en k3 fosforylering snelheid van FDG. Defosforylatie van FDG werd verondersteld verwaarloosbaar te zijn (k4 = 0).
Figuur 2: voorbeeld van het tekenen van gebieden van belang in kuitspier (A) en vena cava (B) beeld-co geregistreerde PET-CT op. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
oad / 55184 / 55184fig3.jpg"/>
Figuur 3: Time-activiteit curves voor de regio van belang in kuitspier (A) en de vena cava (B). Mannelijke db / db-muizen werden gevast gedurende 4,5 uur voor het ontvangen 3 E / kg insuline (rood) of een equivalent volume PBS (zwart). 18F-FDG (10 MBq) werd toegediend via intraveneuze injectie en 18F-FDG niveaus in de gastrocnemius spieren vena cava bepaald PET / CT voor 60 min. Waarden zijn gemiddelden ± SD en uitgedrukt als percentage geïnjecteerde dosis, bepaald door het volledig gezichtsveld (n = 4 / groep). Gemodificeerd van Cochran et al. 13 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Behandeling | k2 | k3 | K i | |
| (min -1 ml g-1) | (-1 min) | (-1 min) | (min -1 ml g-1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 x 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 x 10 -3 | 5,51 ± 4,25 x 10 -4 |
| Insuline | 1,45 ± 0,59 x 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 x 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 x 10 -3 * |
Tabel 1: Kinetische analyse van verhoogde 18F-FDG van plasma kuitspier insuline behandelde db /db muizen. Waarden zijn gemiddelden ± SD. * P <0,05 versus PBS volgens een Mann-Whitney-test (n = 4 / groep).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol vormt een robuuste, niet-invasieve methode om de kinetiek van glucoseopname bepalen uit de bloedstroom in het weefsel, waarna metabolisme in muizen.
De db / db muis is een is een gevestigde diermodel van type 2 diabetes 14 die uitgebreid heeft gebruikt om insulineresistentie en relevante interventies te onderzoeken. Echter, eerdere studies hebben alleen gekwantificeerd eindpunt opname in het hart 15 en hart- en skeletspieren 16.
Het gebruik van kinetische analyse fysiologische snelheidsconstanten te bepalen en het model van de opname van 18F-FDG uit plasma in weefsel maakt inzicht in de impact van antidiabetische behandelingen glucoseopname en metabolisme. Bovendien kunnen deze experimenten in de lengterichting worden uitgevoerd om te bepalen, bijvoorbeeld de invloed van leeftijd of dieet op het glucosemetabolisme. Dit is Advantageous ten opzichte van traditionele methoden die euthanasie en het verzamelen van organen van belangstellenden worden en op die manier informatie slechts op één tijdstip.
Terwijl invoerfuncties eerder zijn bepaald met het gehele hart 17 en het hart, de lever en bloedmonsters 18 bij muizen, de hier beschreven protocol maakt berekening van de invoerfunctie via een interessegebied via vena cava 19. Het is ook mogelijk invoerfuncties via arteriële bloedmonsters berekenen tijdens een PET studie. Dit is echter onpraktisch vanwege het geringe bloedvolume van muizen.
Het gebruik van een plasma invoerfunctie plaats van de 18F-FDGsignal in volbloed is het gevolg van de opname van 18F-FDG in muizen rode bloedcellen 20. Bovendien is de rode bloedcel geassocieerde activiteit vertegenwoordigt 18F-FDG binnen rode cellen, en derhalve isniet beschikbaar voor vervoer naar andere weefselcompartimenten.
In dit protocol is het essentieel om correcte plaatsing van de katheter in de staartader voor afgifte van de 18F-FDG bolus aan de vena cava en in het lichaam van de muis te waarborgen. Opwarming van de staart verwijden de staartader een aanzienlijke verbetering van het gemak van het inbrengen van deze katheter. Het is ook belangrijk dat de CT en PET opnamen correct coregistered zodat het ROI getekende afbeelding op het CT correct overeenkomen met de PET signaal.
Er is enige discussie over de keuze van het anestheticum in studies die de opname van glucose. Terwijl isofluraan is een veelgebruikte veterinaire verdoving, kan het gebruik van sevofluraan voordelig 18F-FDG PET experimenten 21 zijn. In dit protocol is het belangrijk dat eventuele vertekening verband met isofluraan anesthesie wordt geminimaliseerd door de tijdwaarneming betwEen inductie van de anesthesie en het begin van de beeldvorming constant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
- Jensen, M. M., Kjaer, A. Monitoring of anti-cancer treatment with (18)F-FDG and (18)F-FLT PET: a comprehensive review of pre-clinical studies. Am J Nucl Med Mol Imaging. 5, 431-456 (2015).
- Duncan, K., et al. (18)F-FDG-PET/CT imaging in an IL-6- and MYC-driven mouse model of human multiple myeloma affords objective evaluation of plasma cell tumor progression and therapeutic response to the proteasome inhibitor ixazomib. Blood Cancer J. 3, e165 (2013).
- Wang, Y., Kung, A. L. 18F-FDG-PET/CT imaging of drug-induced metabolic changes in genetically engineered mouse lung cancer models. Cold Spring Harb Protoc. 2015, 176-179 (2015).
- Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radu, C. G., Shu, C. J., Shelly, S. M., Phelps, M. E., Witte, O. N. Positron emission tomography with computed tomography imaging of neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1937-1942 (2007).
- Toba, S., et al. Post-natal treatment by a blood-brain-barrier permeable calpain inhibitor, SNJ1945 rescued defective function in lissencephaly. Sci Rep. 3, 1224 (2013).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Overexpression of hexokinase II increases insulinand exercise-stimulated muscle glucose uptake in vivo. Am J Physiol. 276, E70-E77 (1999).
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58, 773-795 (2009).
- Tohka, J., Reilhac, A. Deconvolution-based partial volume correction in Raclopride-PET and Monte Carlo comparison to MR-based method. NeuroImage. 39, 1570-1584 (2008).
- Wu, H. M., et al. et al. In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med. 48, 837-845 (2007).
- Oikonen, V. Model equations for the dispersion of the input function in bolus infusion PET studies. , Available from: http://www.turkupetcentre.net/reports/tpcmod0003.pdf (2002).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 536-545 (1986).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [18F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59, 1977-1984 (2016).
- Kobayashi, K., et al. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism. 49, 22-31 (2000).
- Yue, P., et al. Magnetic resonance imaging of progressive cardiomyopathic changes in the db/db mouse. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292, H2106-H2118 (2007).
- Hagberg, C. E., et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 490, 426-430 (2012).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. J Nucl Med. 54, 132-138 (2013).
- Tantawy, M. N., Peterson, T. E. Simplified [18F]FDG image-derived input function using the left ventricle, liver, and one venous blood sample. Molecular imaging. 9, 76-86 (2010).
- Thorn, S. L., et al. Repeatable noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG: evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med. 54, 1637-1644 (2013).
- Wagner, R., Zimmer, G., Lacko, L. An interspecies approach to the investigation of the red cell membrane glucose transporter. Biochim Biophys Acta. 771, 99-102 (1984).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Mol Imaging Biol. 10, 192-200 (2008).
