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La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55184
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1, 2,3,4,5, 6, 4,5, 7, 4,5, 4,5, 1,5, 1,5
1School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, UNSW Australia, 2Department of Nuclear Medicine, Concord Hospital, 3National Imaging Facility, University of Sydney, 4Brain and Mind Centre, University of Sydney, 5Faculty of Health Sciences, University of Sydney, 6Life Sciences, ANSTO, 7CERMEP

Introduction

El propósito de este estudio fue desarrollar una tomografía por emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT) metodología basada cuantificar el, la captación en tiempo real in vivo de glucosa desde el torrente sanguíneo a los tejidos específicos en ratones. Esto se logró usando fluorodeoxiglucosa marcado con F 18 (FDG) para medir la captación de glucosa y modelado cinético para estimar las tasas de captación de 18 F-FDG desde el plasma al espacio intracelular, la tasa de transporte desde el espacio intracelular al plasma y la tasa de 18 fosforilación F-FDG.

En roedores, 18 F-FDG se ha utilizado en la evaluación pre-clínica de numerosos tratamientos para el cáncer 1, estudios de la progresión tumoral 2 y el metabolismo tumor 3, así como formación de imágenes de los depósitos de grasa marrón 4, neuroinflamación 5 y el cerebro metabolismo 6

Los métodos tradicionales utilizados para examinar la absorción específica de tejido de la glucosa en ratones (y ratas) generalmente implican el tratamiento con radiomarcado 2-desoxiglucosa, ya sea con 3 H o 14 C seguido de la eutanasia, la recogida de tejidos y la medición de la radiactividad en cada tejido 7. El uso de PET / CT permite la determinación no invasiva de la captación de glucosa y el metabolismo en múltiples órganos y regiones simultáneamente en animales vivos. Adicionalmente, como la eutanasia no es un requisito, esta técnica es adecuada para uso en estudios longitudinales.

Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) se caracteriza por un metabolismo alterado de la glucosa y la hiperglucemia secundaria a la reducida respuesta tisular a la insulina (resistencia a la insulina) y la incapacidad de -Cells pancreáticas para producir cantidades adecuadas de insulina 8. El análisis cinético de la captación de glucosa y el metabolismo puede proporcionar importantes conocimientos sobreel mecanismo de acción y la eficacia de las intervenciones terapéuticas, así como permitir la supervisión avanzada de la progresión de la enfermedad.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos en este estudio fueron aprobados por el Sydney área básica de salud y de la Universidad de Sydney Comités de Ética Animal y siguieron la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, Octava edición (2011).

1. Preparación Animal

NOTA: En este db macho / protocolo de ratones db (BKS.Cg- Dock7 m + / + Lepr db / J) se mantuvieron en el alojamiento en grupo con acceso ad libitum a Chow y agua hasta las 6 semanas de edad. En el momento de formación de imágenes, los ratones se pesaron ~ 30 g. Todos los ratones utilizados en este protocolo habían ayuno niveles de glucosa en sangre entre 10 y 14 mmol / L.

  1. Si es necesario, ayunar a los ratones. En el presente ejemplo, ayunar a los ratones durante 5 h antes del procedimiento experimental.
  2. Tratar ratones con el agente deseado (por ejemplo, fármaco, proteína, péptido) antes del comienzo de formación de imágenes. En este ejemplo, administrar una inyección subcutánea de insulina (3U / kg de insulina humana) o un volumen equivalente de PBS 30 min antes del inicio de formación de imágenes.

2. Configurar flujo de trabajo

NOTA: Este protocolo se llevó a cabo en un escáner PET / CT. Adquirir datos de PET en primer lugar, seguido de adquisición de datos de la TC.

  1. Configuración de PET:
    1. Seleccionar isótopo como 18 F, establece la duración del análisis a 3.600 s, y la discriminación de energía de nivel superior e inferior a 350 keV - 650 keV (por defecto) con una ventana de tiempo coincidencia de 3.432 ns (por defecto). Histograma de datos en modo de lista en 16 marcos (6 x 10 s, 4 x 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) para la el período 0 - 60 min después de la inyección del trazador. Reconstruir emisión sinogramas utilizando 2D-FBP con un zoom 1.5.
      NOTA: Las imágenes reconstruidas consistieron en 16 cuadros dinámicos, cada uno con 128 × 128 × 159 voxels y un tamaño de vóxel de 0,52 × 0,52 × 0,796 mm 3.
  2. Configuración CT:
    1. poruna TC de todo el cuerpo, establece la corriente a 500 A, voltaje a 50 kV, tiempo de exposición de 500 ms y 200 proyecciones más de una rotación de 360. Ajuste el campo detector de visión (FOV) a 30722048, el número de posiciones de la cama a 3 (para cubrir la gama completa FoV PET), la superposición entre las posiciones de cama = 30,234713% y detector binning a 4.
      NOTA: TC reconstrucción se realizó mediante tomografía de haz de software de reconstrucción de la imagen cono con la calibración HU, la interpolación bilineal y el filtro Shepp-Logan.
  3. 18 F-FDG:
    1. Suficiente orden 18 F-FDG (por ejemplo 450 MBq en 0,5 ml) de un proveedor local para llegan ~ 30 min antes de la primera inyección. Alícuota y diluir la 18 F-FDG para que los animales reciben ~ 10 MBq de 18 F-FDG en un volumen final de 0,1 ml.

3. Protocolo Imaging

  1. Limpie cámara de inducción y la cama de imagen con 80% (v / v) de etanol para mantener las condiciones asépticas. Place el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con 5% de isoflurano en oxígeno.
  2. Coloque el ratón sobre un lecho de formación de imágenes equipado con una almohadilla de calefacción eléctrica para mantener la temperatura corporal y un cono vaporizador nariz precisión para entregar isoflurano (mantenimiento, 1,5 - 2%) a una velocidad de flujo de 1 L / min. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
  3. Coloque el ratón en una posición de decúbito prono sobre una almohadilla de sensor para supervisar la respiración y asegurar un plano adecuado de anestesia se mantiene.
  4. Calentar la cola usando un paquete de calor para 1 - 2 min para dilatar la vena de la cola lateral. Cateterizar la vena lateral de la cola mediante la inserción de una aguja de calibre 30 en la vena lateral de la cola. Fije la aguja en su lugar con pegamento quirúrgico y asegurar el catéter.
  5. formación de imágenes carga del lecho en el escáner y mover el lecho a través de la máquina de modo que el catéter se puede acceder desde la parte posterior de la máquina.
  6. Una el catéter a la jeringa 18 F-FDG en un syrInge conductor. Calcular la 18 dosis F-FDG exacta (10 MBq) en base a la actividad en la jeringa antes de la inyección y el volumen a ser administrado (<100! L, se inyecta más de 10 s).
  7. Para minimizar el impacto de la anestesia en la variabilidad de la absorción de glucosa, asegurar una constante de tiempo entre la inducción de la anestesia y la inyección de 18 F-FDG (por ejemplo, 30 min).
  8. Comenzar la TEP inmediatamente antes de la inyección de 18 F-FDG. Después de terminar la exploración PET (3,600 s), realizar una exploración CT (~ 10 min) para permitir la co-registro de la captación de radiotrazador con los tejidos.
  9. Mover la cama de formación de imágenes a la posición de partida, retirar el animal de la cama.
  10. En este punto sacrificar al animal o permite que se recupere:
    1. Para la eutanasia, realice dislocación cervical, mientras que todavía bajo anestesia y recoger órganos de interés para su posterior análisis.
    2. Si permitiendo el ratón para recuperar, colocar el ratón en el alojamiento individual en una almohadilla de calefacción odelante de una lámpara de calentamiento. Monitorear el ratón hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Permitir que el ratón para recuperar durante 1 h antes de volver a la vivienda grupo.

4. Procesamiento de imágenes PET

NOTA: la reconstrucción de imágenes se realizó utilizando el lugar de trabajo de adquisición y análisis de software v1.5.0.28 en investigación de software v4.2 lugar de trabajo.

  1. Co-registro de CT y PET imagen y asegurar que la alineación es correcta en las 3 dimensiones.
    1. En el menú 'Archivo', seleccione 'carpeta de búsqueda / Importar' y seleccionar la carpeta que contiene los datos. Seleccione los datos de PET y CT deseados y haga clic en la pestaña "Análisis General.
    2. Ordenar los datos para que el CR se designa 'Fuente' y PET se designa 'Target'. En el menú 'flujo de trabajo', seleccione 'Registro'. Si las imágenes requieren un ajuste para ser correctamente registradas conjuntamente, utilizar las herramientas de XXmenú 'Registro' e.
  2. En el menú 'flujo de trabajo', seleccione 'ROI Cuantificación'.
    1. Utilizar las funciones de la 'Pan' y 'zoom' en la pestaña 'Imagen' para localizar la región deseada. En el menú 'Herramientas', seleccione la pestaña 'Crear' y haga clic en el icono de pincel. Dibujar el retorno de la inversión en la imagen
  3. Extraer curvas de tiempo-actividad seleccionando 'Guardar ROI cuantificación' en el menú 'Guardar'. Guardar los datos como un archivo CSV.
  4. Cuantificar la captación de radiactividad como Bq por cm 3 de tejido. Convertir los valores en porcentaje de dosis inyectada por cm 3 (% ID / cm 3) mediante la carga el archivo CSV en una hoja de cálculo.

5. Función de entrada

  1. Para corregir para la función de dispersión de punto del sistema, deconvoluir la PSF sistema estimado para 5 iteraciones utilizando el método de desconvolución de Van Cittert reblurred como se describió previamente 9.
    NOTA: Esto es necesario debido al pequeño tamaño de la vena cava en un ratón.
  2. Utilice imágenes enviar deconvolución para generar una curva de función de tiempo de actividad de entrada de sangre como se describió anteriormente.

6. Modelado Cinético

NOTA: La FDG de dos tejido modelo de compartimentos (Figura 1) requiere la función de entrada de plasma.

  1. Convertir la función de entrada de sangre en el archivo CSV a la función de entrada de plasma usando la siguiente ecuación 10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e - 0.191t + 1,165).
  2. En la herramienta de modelado cinético haga clic en el botón de 'Kinetic'. Importar el tejido y la actividad total en plasma cuentan archivos CSV en la herramienta de modelado cinético mediante la selección de 'Actividad curva de tiempo de carga' del 'Menú'.
  3. En el menú 'Modelo' seleccionar 2 compartimentos de tejido. Asegúrese de que la casilla junto a K4 no está seleccionadae introducir un valor de 0. Para el montaje inicial, desactive la casilla para VB (fracción de volumen de sangre) e introduzca un valor de 2%.
  4. Haga clic en la 'región actual Fit'. Corregir la región extraída de interés para la dispersión 11, 12. Lograr esto mediante la minimización del valor de Chi-cuadrado para el modelo FDG para diferentes tiempos de dispersión.
  5. Realizar un segundo ajuste utilizando el valor vB flotante (marca la casilla junto a la caja para VB) y el valor de dispersión optimizada para calcular las constantes de velocidad regionales (k 1 -k 3). Calcular la constante como K i = (k 1 × k 3) afluencia regional / (k + 2 k 3).

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Representative Results

Hemos utilizado anteriormente el / modelo de ratón db db para investigar el impacto del aumento de los niveles plasmáticos de apoA-I en la cinética de la captación de glucosa y el metabolismo de 13. En este estudio se utilizó ratones db / db tratados con insulina para demostrar la utilidad de formación de imágenes PET / CT para monitorizar la captación de 18 F-FDG desde el plasma en el músculo gastrocnemio en tiempo real.

Seis semanas de edad ratones db / db fueron anestesiados y se trataron con 3 U de insulina humana / kg, o el volumen equivalente de PBS por vía subcutánea, 30 min antes del inicio de la exploración PET. Los ratones recibieron 10 MBq de 18 F-FDG a través de inyección intravenosa y la absorción medida por PET para 60 min. Una tomografía computarizada se realizó para referencia anatómica.

Las regiones de interés fueron dibujados en el músculo gastrocnemio vena cava y el uso de las imágenes de TC (Figura 2). El tratamiento de ratones db / db con insulina aumentó la actividad 18 F-FDG en el ROI gastrocnemio durante el período de tiempo de adquisición (Figura 3A). Los valores obtenidos para el retorno de la inversión de la vena cava se convirtieron a partir de sangre a los valores de plasma y no fueron alterados por el tratamiento con insulina en los ratones tratados con insulina en relación con el control (Figura 3B).

Las curvas de actividades de tiempo fueron cargados en la herramienta de modelado cinético para el cálculo de los parámetros cinéticos. Datos se ajustaron inicialmente a un método compartimento de dos tejido con k = 4 0 con un valor V b (fracción de volumen de sangre) del 2% para calcular los valores de dispersión (80 s y 70 s para PBS y los ratones tratados con insulina, respectivamente). Montaje fue entonces realiza usando los valores de dispersión anteriores y un valor b V flotante.

No hubo diferencias significativas en la tasa de 18 F-Transporte FDG desde el plasma arterial al espacio intracelular (k 1) o desde el espacio intracelular al plasma (k 2) se observó en los ratones tratados con insulina en comparación con el control (Tabla 1). La tasa de 18 F-FDG fosforilación (k 3) se incrementó significativamente en los ratones tratados con insulina (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 × 10 -2 min -1 para PBS y los grupos tratados con insulina, respectivamente; p <0,05 ). El tratamiento con insulina también aumentó significativamente la constante de afluencia (K i) en comparación con los animales tratados con PBS (5,51 ± 4,25 × 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 × 10 -3 ml min -1 g -1, respectivamente; p <0,05).

Figura 1
Figura 1: curvas de tiempo-actividad regional se ajustaron a una de dos tissu e, tres modelo de compartimentos, con C1 siendo la concentración de FDG en el plasma y C2 y C3 de la concentración de FDG y fosforilados FDG en el tejido, respectivamente. k 1 representa la tasa de captación de FDG en el tejido, k 2 la tasa de aclaramiento del tejido de vuelta al compartimento de plasma y k 3 la tasa de fosforilación de FDG. La desfosforilación de FDG se asumió que era insignificante (k 4 = 0).

Figura 2
Figura 2: Ejemplo de dibujo de regiones de interés en el músculo gastrocnemio (A) y la vena cava (B) Imagen PET-CT un co-registrado en. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: curvas de tiempo-actividad para regiones de interés en el músculo gastrocnemio (A) y la vena cava (B). Los ratones db / db macho se dejaron en ayunas durante 4,5 h antes de recibir 3 U / kg de insulina (rojo) o el volumen equivalente de PBS (negro). 18 F-FDG (10 MBq) se entrega a través de inyección intravenosa y 18 niveles F-FDG en la cava músculo gastrocnemio y vena determinado por PET / CT para 60 min. Los valores son la media ± SD y se expresaron como porcentaje de dosis inyectada, calculado a partir de un campo de visión completo (n = 4 / grupo). Modificado de Cochran et al. 13 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tratamiento 1 k 2 k 3 Ki
(ml min -1 g -1) (min -1) (min -1) (ml min -1 g -1)
PBS 1,31 ± 0,42 × 10 -2 0,12 ± 0,11 7,06 ± 6,60 × 10 -3 5,51 ± 4,25 × 10 -4
Insulina 1,45 ± 0,59 × 10 -2 0,09 ± 0,05 2,26 ± 0,72 × 10 -2 * 2,01 ± 0,28 × 10 -3 *

Tabla 1: Análisis cinético de un aumento de 18 F-FDG a partir de plasma en el músculo gastrocnemio en tratados con insulina db /ratones db. Los valores son la media ± SD. * P <0,05 frente a PBS de acuerdo con una prueba de Mann-Whitney (n = 4 / grupo).

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Discussion

El protocolo descrito aquí representa una metodología sólida, no invasivo para determinar la cinética de la absorción de glucosa desde el torrente sanguíneo en el tejido y la posterior metabolismo en ratones.

El ratón db / db es un es un modelo animal bien establecido de la diabetes de tipo 2 14 que ha sido utilizado ampliamente para examinar la resistencia a la insulina y las intervenciones pertinentes. Sin embargo, los estudios anteriores sólo han cuantificado captación de punto final en el corazón 15 y el músculo cardíaco y esquelético 16.

El uso de análisis cinético para determinar las constantes de velocidad fisiológicos y modelar la captación de 18 F-FDG a partir de plasma en el tejido permite penetraciones en el impacto de los tratamientos antidiabéticos en la captación de glucosa y el metabolismo. Además, estos experimentos pueden realizarse longitudinalmente para evaluar, por ejemplo, el impacto de la edad o de la dieta sobre el metabolismo de la glucosa. Esta es Advantageous sobre los métodos tradicionales que requieren la eutanasia y el conjunto de órganos de interés y por lo tanto proporcionan información sólo a un solo punto de tiempo.

Mientras que las funciones de entrada previamente se han determinado utilizando todo el corazón 17, así como el corazón, el hígado y una muestras de sangre 18 en ratones, el protocolo descrito aquí permite el cálculo de la función de entrada utilizando una región de interés sobre la vena cava 19. También es posible calcular funciones de entrada utilizando muestras de sangre arterial durante un estudio de PET. Sin embargo, esto no es práctico debido al pequeño volumen de sangre de los ratones.

El uso de una función de entrada de plasma en lugar de la 18 F-FDGsignal en sangre total se debe a la captación de 18 F-FDG en células rojas de la sangre del ratón 20. Además, la actividad asociada a las células rojas de la sangre representa 18 F-FDG dentro de las células rojas, y por lo tanto esno están fácilmente disponibles para el transporte en otros compartimentos de tejido.

En este protocolo, es crítico para asegurar la correcta colocación del catéter colocado en la vena de la cola para la entrega de la 18 F-FDG bolo a la vena cava y a través del cuerpo del ratón. El calentamiento de la cola para dilatar la vena de la cola mejora considerablemente la facilidad de la inserción de este catéter. También es importante asegurarse de que las imágenes PET y CT se corregistrados adecuadamente para que las regiones de interés extraídos de la imagen de TC corresponden correctamente a la señal de PET.

Existe cierto debate sobre la elección del agente anestésico en los estudios que examinan la captación de glucosa. Mientras isoflurano es un anestésico veterinario de uso común, el uso de sevoflurano puede ser ventajoso en 18 experimentos F-FDG PET 21. En este protocolo, es importante asegurarse de que cualquier sesgo potencial asociado con la anestesia con isoflurano se minimiza manteniendo el tiempo betwinducción een de la anestesia y el comienzo de la constante de formación de imágenes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PET/CT Scanner Siemens Inveon 
18F-FDG PETNET Solutions
Isoflurane Pharmachem
30 guage needle BD 305106
PMOD modelling software PMOD Technologies
BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice Jackson Laboratory 000642
Human insulin Sigma-Aldrich

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References

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La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT
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