Summary
신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 기능 모터 신경 및 근육 사이 통신 장애, 노화 등 루 경화 증 (ALS)에서는 질병을 공부 하는 때 중추적인 역할을 한다. 여기 우리가 NMJ 기능 전기 자극의 두 종류를 결합 하 여 측정 하는 데 사용할 수 있는 실험 프로토콜 설명: 근육 막 자극과 자극이 신경을 통해 직접. 이러한 두 가지 다른 stimulations에 근육 응답의 비교 정의 기능 수준, 근육에서 기능 감소로 이어질는 NMJ에 잠재적인 변경 시킬 수 있습니다.
Ex vivo 준비는 잘 통제 연구에 적합. 여기는 근육 기능과 NMJ soleus 좌 골 신경 준비 및 다이어 프 램 인할지 신경 준비의 여러 매개 변수를 측정 하는 집중적인 프로토콜에 설명 합니다. 프로토콜 약 60 분을 지속 하 고는 주문에 의하여 uninterruptedly 실시 트 위치 속도 론 속성, 근육 및 신경 stimulations의 힘-주파수 관계와 두 개의 매개 변수 NMJ 기능, 즉 neurotransmission 실패와 intratetanic 피로 측정 소프트웨어. 이 방법론 soleus과 횡 경 막 근육 신경 준비에 SOD1G93A 유전자 변형 마우스, 편 overexpresses 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) ALS의 실험 모델을 사용 하 여 손해를 검출 하 사용 되었다.
Introduction
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 근육 섬유의 모터 종판 및 터미널 모터 신경 축 삭 사이 연결에 의해 형성 된 화학 시 냅 스 이다. NMJ 근육과 신경 사이 통신 장애, 노화 또는 루 경화 증 (ALS)에서 발생 되는 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 근육과 신경, 의사 소통 양방향 방법1,2로 근육 결함 별도로 NMJ 결함을 측정할 수 있는 그들의 physiopathological 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사실,이 기능 평가 형태학 또는 생 화 확 적인 변경 감소 neurotransmission 신호 기능을 도울 수 있다.
근육 수축 반응 elicited 신경 자극과 같은 근육의 막의 직접 자극에 의해 evoked의 응답에 의해 비교 NMJ 기능의 간접 측정으로 제안 되었습니다. 실제로, 막 자극에 의해 패스 neurotransmission 신호, 이후 두 수축 성 반응의 차이 변화는 NMJ에 관찰 될 수 있습니다. 이 방법은 광범위 하 게 쥐3,,45,6,7, 제안 되었고 또한 마우스 모델8,,910,,1112에 정보를 수집 하는 데 사용.
여기, 우리가 자세히 설명 삭제할 soleus 좌 골과 횡 경 막 인할지 준비 두 근육 신경 준비, 즉 테스트 하는 프로시저. 주문 품을 사용 하 여 소프트웨어, 우리 설계 NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수 측정을 결합 하 여 지속적인 테스트 프로토콜 함으로써 근육의 NMJ 손상의 포괄적인 평가 별도로 저조한. 특히, 프로토콜 트 위치 힘, 근육 활동, 힘 주파수 곡선에 대 한 직접 및 신경 stimulations, 모두는 발사와 tetanic 주파수 및 intratetanic 피로7neurotransmission 실패13 측정합니다.
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Representative Results
우리가 설명 하는 프로토콜은 여러 신경 근육 학 질병 또는 노화 sarcopenia 기능 denervation에 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 여부 (그리고, 그렇다면, 어떤 수준)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 근육 변경 근육 자체 또는 신경 근육 학 전송에서 발생 하는 선택적인 변경 됩니다. 아래 데이터는 우리의 그룹18, 루 경화 증 질병20의 최종 단계에서의 SOD1G93A 유전자 변형 마우스 모델에 의해 이전 작업의 결과입니다. SOD1G93A 유전자 변형 마우스 편 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. 그림 3과 4는 dF/dt 및 tetanic 힘 값 soleus 좌 골 신경 (왼쪽)와 횡 경 막 인할지 신경 (오른쪽) 준비를 보여줍니다. 이러한 결과 근육 자체를 엄격 하 게 관련 된 그 반대 NMJ에 관련 된 유전자 변형 근육에 기능적 결함을 탐지 하 여기 제안 하는 기술의 능력을 보여 줍니다. 실제로, dF/dt와 tetanic 힘, SOD1G93A soleus 근육 표시 제어 근육을 직접 자극 하 고 신경을 통해 자극 때 추가 감소를 표시 하는 때에 비해 감소 된 수축 성 응답. 대조적으로, 가벼운 변경에서에서 관찰 되었다 이러한 두 개의 매개 변수 때 횡 경 막 근육 스트립, 막 통해 자극 했다 반면 때 신경을 통해 횡 경 막 근육 자극 했다 중요 한 변경 감지 했다.
그림 3 - 수축 속도 론. DF/dt의 ± SEM soleus (A)과 횡 경 막 (B) 준비에 대 한 의미. Soleus 표본 표시 상당한 둔화 내려 직접 자극 하는 경우 (-27%), 그리고 추가 감소 때 신경을 통해 자극 (-58%). 다이어 프 램 표본을 늦추고 신경을 통해 자극 하는 경우에 표시 (-30%). Rizzuto 외. 18에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 - Tetanic 힘. Soleus (A)과 횡 경 막 (B) 준비에 대 한 ± SEM tetanic 특정 힘을 의미 합니다. Soleus 표본 상당한 둔화 내려 때 표시 직접 자극 (-26%), 그리고 신경을 통해 자극 될 때 더 감소 (-50%). 다이어 프 램 표본 힘 감소는 신경을 통해 자극 하는 경우에 표시 (-44%). Rizzuto 외. 18에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Intratetanic 피로 neurotransmission 실패의 평가 측정 NMJ 특정 매개 변수 허용. 그림 5 는 intratetanic 피로 (soleus 근육 (그림 5A) tetanic 피로 패러다임 중 측정 경우)의 평균값과 다이어 프 램 스트립 (그림 5B). 프로토콜 섹션에서 보고, 하지 근육 피로 패러다임 적용 하지만 NMJ를 강조 하는 방식으로 개발 되었다. 그 결과, IF 직접 근육 자극은 절대 변경에 대 한 측정. 실제로, IF는 신경 자극은 다른 마우스 긴장 사이 비교를 위해 고려 되어야 하는 매개 변수를 계산 합니다. 우리의 결과 보여준다 IF 유전자 변형 soleus에 제어 대응에 횡 경 막 근육 보다 훨씬 낮은 했다. 이 차이는 작은 근육 결함 감지 되었습니다, 횡 경 막에 큰 되었고 중대 한 근육 손상 이미 측정 했다 soleus에 작은. 그것은 그 이후 유전자 변형 soleus 근육 크게 손상, NMJ 평가 했다만 자극, 유전자 변형 근육 힘을 자극 하는 경우의 null 값을 반환 하는 데 걸리는 시간이 8 분까지에 대 한 올바른 마음에 부담 한다. 자극의 8 분 후 유전자 변형 soleus IF 값은 기본적으로 잡음을 표현 한다.
그림 5 - Intratetanic 피로. Intratetanic 피로 soleus (A)과 횡 경 막 (B) 근육에 대 한 유전자 변형 NMJ 기능에 상당한 감소를 표시. 값은 평균 ± SEM. 적응 Rizzuto 외. 18에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 soleus (그림 6A)와 횡 경 막 (그림 6B) 표본에서 측정 tetanic 주파수 neurotransmission 실패를 보여준다. IF 결과 따라 횡 경 막 근육 표본 신경 근육 학 교차로 fatigability에 상당한 증가 표시 하는 반면 neurotransmission에 결함 없음 soleus 근육에서 발견 되었다.
그림 6 -Neurotransmission 실패. Neurotransmission 실패에는 soleus 근육 (A) 모든 변경을 표시 하지 않았다, 유전자 변형에 NMJ 기능에 상당한 감소를 강조 하는 동안 횡 경 막 스트립 (B). 값은 평균 ± SEM. 적응 Rizzuto 외. 18에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
위에서 설명한 실험 프로토콜에는 측정 하 고 차별 어떤 기능 변경 발생 한 근육에 직접 또는 간접적으로 신경 근육 학 교차로 수준에서의 이상적인 방법을 제공 한다. 이 기술은 NMJ 기능의 간접 측정을 기반으로, 이후 형태학 변화 또는 생 화 확 적인 변화에 어떤 결함 관련 된 경우 설정 하에서 사용할 수 없습니다. 대조적으로, 그것은 어떤 형태 또는 생 화 확 적인 변경 neurotransmission 기능 신호 감소 여부 결정의 효과적인 방법을 제공지 않습니다. 그러나, 힘 측정 완료 근육 목욕에서 제거, 얼룩이, 최적의 길이에 고정, 포함 화합물으로 둘러싸인 고 빠르게 녹는 isopentane에 냉동. 근육 후속 평가-80 ° C에서와 같은 immunohistochemical 및 형태소 분석에 대 한 저장할 수 있습니다.
우리가 여기에서 제안 하는 기술은 결합, 처음으로, NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수를 측정 하는 실험 테스트 프로토콜을 기반으로 합니다. 3 중요 한 포인트 확인이 기술은 신뢰할 수 있는 결과 생성 합니다.
첫째, 비록 골격 근육 절단은 지금은 비교적 일반적인 기술, 추가 해야 합니다 주의 신경 근육을 유지 하기 위해 수술을 수행 하는 경우. 다른 실험적인 모델을 시도 하기 전에 통제 쥐에 연산자의 능력 테스트 따라서 한다. 통제 쥐에 있는 근육 수축 성 응답 직접 및 간접 stimulations 같은 연산자의 수술 능력을 컨트롤 제공 될 것으로 예상 된다.
또 다른 중요 한 포인트가입니다 직접 펄스는 신경의 자극 내부 근육 지점에 의해 근육을 활성화 하지 않습니다 하 고 신경에 적용 하는 펄스 방식 artefactual 확산 하 여 현재 욕실에서 근육을 활성화 하지 않습니다. 첫 번째 D tubocurarine 전후에 둘 다 막에 직접 근육 자극 실험의 별도 집합을 수행 하 여 시험 될 수 있다 (25 µ M) 생리 목욕에 추가 되었습니다. Supramaximal 현재 값 수정 되었습니다 일단 근육 응답 해야 하지 D tubocurarine의 추가 의해 변경할 수 있습니다. 두 번째 포인트 삭제 신경의 길이에 관련 하 고 쉽습니다 따라서 더 변형. 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 각 테스트의 시작 전에 흡입 전극에 전류를 평가 합니다.
마지막으로, NMJ 기능 직접 및 간접 자극을 근육 응답을 비교 하 여 평가 하 게 됩니다, 이후 전기 펄스 해야 동기화 할 매우 정확 하 게. 이 포인트는 근육은 자극 한 번 막에와 14 번 신경을 통해 프로토콜의 끝에 두 피로 패러다임에 대 한 특히 중요 하다. 때문에 자극 단계와 나머지 시간이 매우 낮은 (0.33 s와 0.67 횡 경 막에 대 한), 심지어 매우 낮은 지연 중 두 구획의 불균형된 자극 이어질 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자의 연구실에서 작업 피코 로마와 텔 레 톤 (no를 부여에 의해 지원 되었다 GGP14066)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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