Summary
En funktionell bedömning av den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) kan ge viktig information om kommunikationen mellan muskel och nerv. Här beskriver vi ett protokoll för att fullständigt utvärdera både NMJ och muskel funktionaliteten med hjälp av två olika muskel-nerv preparat, dvs soleus-ischiasnerven och membran-phrenic.
Abstract
Neuromuskulära förbindelsen (NMJ) funktionalitet spelar en nyckelroll när man studerar sjukdomar där kommunikationen mellan motor neuron och muskel är försämrad, till exempel åldrande och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Här beskriver vi ett experimentellt protokoll som kan användas för att mäta NMJ funktionalitet genom att kombinera två typer av elektrisk stimulering: direkt membran muskelstimulering och stimulering genom nerv. Jämförelse av muskel svaret på dessa två olika stimuli kan hjälpa till att definiera, på den funktionella nivån, potentiella förändringar i NMJ som leder till funktionella nedgång i muskel.
Ex vivo preparat är lämpade för välkontrollerade studier. Här beskriver vi ett intensivt protokoll för att mäta flera parametrar för muskel och NMJ funktionalitet för soleus-ischias nerv beredning och för membran-phrenic nerv beredning. Protokollet varar ca 60 min och bedrivs oavbrutet genom en skräddarsydd programvara som mäter egenskaperna twitch kinetik, kraft-frekvens förhållandet för både muskel- och nerv stimuli och två parametrar som är specifika för NMJ funktionalitet, dvs neurotransmission misslyckande och intratetanic trötthet. Denna metod användes för att upptäcka skador i soleus och membranet muskel-nerv preparat med hjälp av SOD1G93A transgena möss, en experimentell modell av ALS som ubiquitously overexpresses den muterade antioxidant enzymet superoxiddismutas 1 (SOD1).
Introduction
Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en kemisk synaps bildas av anslutningen mellan den motoriska endplate av muskelfibern och motorneuron axon terminal. NMJ har visat sig spela en avgörande roll när kommunikationen mellan muskler och nerver är nedsatt, som sker i åldrandet eller amyotrofisk lateralskleros (ALS). Som muskel- och nerv kommunicera i en dubbelriktad väg1,2, kan att kunna mäta NMJ defekter separat från muskel defekter ge nya insikter i deras physiopathological samspelet. Faktiskt, detta funktionell utvärdering kan hjälpa till att bedöma om morfologiska eller biokemiska förändringar minska neurotransmission signalering funktionalitet.
Jämförelse av muskel kontraktila svar framkallas av nervstimulering och respons av samma muskel frammanade av direkt stimulering av dess membran har föreslagits som en indirekt mätning av NMJ funktionalitet. Faktiskt, sedan membran stimulering av-passerar neurotransmission signalering, eventuella skillnader i två kontraktila Svaren kan tillskrivas förändringar i NMJ. Detta synsätt har i stor utsträckning föreslagits för råttor3,4,5,6,7, och också används för att samla information om mus modeller8,9,10,11,12.
Här beskriver vi i detalj en procedur för att punktskatt och testa två muskel-nerv preparat, i. e. soleus-ischiasnerven och membran-phrenic förberedelserna. Med en skräddarsydd programvara, vi utformade en kontinuerlig testning protokoll som kombinerar mätning av flera parametrar som kännetecknar både NMJ och muskel funktioner, därmed ger en omfattande utvärdering av NMJ skada separat från det av muskel. I synnerhet mäter protokollet kraften som twitch muskel kinetik, kraft-frekvenskurvan för direkt och nerv stimuli, neurotransmission misslyckande13 för både en bränning tetanic frekvenserna och den intratetanic trötthet7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som vi beskrivit ger information om funktionella denervering i flera neuromuskulära sjukdomar eller åldrande-sarcopeni. Detta protokoll kan användas för att avgöra om (och i så fall på vilken nivå) muskel förändringar är på grund av selektiva förändringar som sker i muskeln själv eller neuromuskulär transmission. Uppgifterna nedan är resultatet av ett tidigare verk av vår grupp18, bedrivs på SOD1G93A transgen musmodell av amyotrofisk lateralskleros på slutstadiet av sjukdomen20. Den SOD1G93A transgena möss overexpresses ubiquitously den muterade antioxidant enzymet superoxiddismutas 1 (SOD1). Figur 3 och 4 visar dF/dt och tetanic kraft värden för soleus-ischias nerven (vänster) och membran-phrenic nerv (höger) förberedelserna. Dessa resultat visar förmågan hos den teknik som föreslås här att upptäcka de funktionella bristerna i transgena muskler som är relaterade till NMJ i motsats till de strikt relaterade till muskeln själv. Verkligen, för både dF/dt och tetanic kraft, SOD1G93A soleus musklerna visas en minskad kontraktila reaktion, jämfört med kontroll muskel, när direkt stimuleras och visas en ytterligare minskning när stimuleras genom nerv. Däremot observerades lindriga förändringar i dessa två parametrar när membranet muskel remsor stimuleras genom membranet, medan betydande förändringar upptäcktes när diafragma muskeln stimulerades genom nerv.
Figur 3 - Kontraktila kinetik. Menar ± SEM av dF/dt för soleus (A) och membran (B) förberedelser. Soleus exemplar visas en betydande saktar ner när direkt stimuleras (-27%), och en ytterligare minskning när stimuleras genom nerv (-58%). Membranen exemplar visas en sakta ner endast när stimuleras genom nerv (-30%). Anpassad från Rizzuto et al. 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 - Tetanic kraft. Menar ± SEM av tetanic specifik kraft för soleus (A) och membran (B) förberedelser. Soleus exemplar visas en betydande saktar ner när direkt stimuleras (-26%), och en ytterligare minskning när stimuleras genom nerv (-50%). Membranen exemplar visas en kraft minskning endast när stimuleras genom nerv (-44%). Anpassad från Rizzuto et al. 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utvärderingen av intratetanic trötthet och neurotransmission misslyckande tillåtna NMJ särskilda parametrar som ska mätas. Figur 5 visar genomsnittet värderar av intratetanic trötthet (om) uppmätt under tetanic trötthet paradigm för soleus muskler (figur 5A) och membran remsor (figur 5B). Som rapporterats i avsnittet protokoll, utvecklades den trötthet paradigm som vi tillämpat på ett sådant sätt att betona NMJ dock inte muskeln. Som ett resultat, om mätt för den direkta muskelstimulering förändrades aldrig. Verkligen, om beräknats för nervstimulering är den parameter som måste beaktas för jämförelser mellan olika mus stammar. Våra resultat visar om var signifikant lägre i både transgena soleus och membran muskler än i de kontroll motsvarigheterna. Denna skillnad var större i membranen, som upptäcktes en liten muskel defekt, och mindre i soleus, där betydande muskelskada redan hade mätt. Det bör bäras i åtanke att eftersom den transgena soleus muskeln var betydligt skadad, NMJ utvärderingen var bara rätt i upp till 8 min av stimulering, som är den tid det tar för transgena muskel att returnera null-värdet av kraft när stimuleras. Transgena soleus om värden efter 8 min av stimulering uttrycka i princip buller.
Figur 5 - Intratetanic trötthet. Intratetanic trötthet för soleus (A) och membran (B) musklerna visas en signifikant minskning av transgena NMJ funktionalitet. Värden är medelvärde ± SEM. anpassas från Rizzuto et al. 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 visar neurotransmission misslyckandet med tetanic frekvens som mäts i soleus (figur 6A) och membran (figur 6B) exemplar. I linje med resultaten om upptäcktes ingen defekt i neurotransmission i den soleus muskeln, medan membranet muskel exemplaren visas en betydande ökning i neuromuskulära förbindelsen utröttbarhet.
Figur 6 -Neurotransmission misslyckande. Neurotransmission misslyckande framvisade inte ändringar i den soleus muskler (A), medan markerat en signifikant minskning av NMJ funktionalitet i transgena remsor membran (B). Värden är medelvärde ± SEM. anpassas från Rizzuto et al. 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det experimentellt protokoll som beskrivs ovan ger ett idealiskt sätt att mäta och diskriminera någon funktionella förändringar som har skett direkt i muskeln eller indirekt på neuromuskulära förbindelsen nivå. Eftersom denna teknik är baserad på en indirekt mätning av NMJ funktionalitet, kan inte det användas för att fastställa om defekter är relaterad till morfologiska förändringar eller biokemiska förändringar. Däremot ger den ett effektivt sätt att fastställa huruvida eventuella morfologiska eller biokemiska förändringar har minskat neurotransmission signalering funktionalitet. Dock efter kraft mätningar är slutförda, kan muskeln vara bort från badet, utplånas, fästs på optimal längd, omgiven av inbäddning förening och snabbt frysta i smältande isopentan. Muskler kan lagras vid-80 ° C för efterföljande utvärdering, såsom immunhistokemisk och Morfologisk analys.
Den teknik som vi föreslår här är baserad på ett experimentellt testa protokoll som kombinerar, för första gången, mätning av flera parametrar som kännetecknar NMJ och muskel funktioner. Tre avgörande punkter se till att denna teknik ger tillförlitliga resultat.
Först, även skelettmuskulatur excision är nu en relativt vanlig teknik, extra måste vara försiktig när du utför det kirurgiska ingreppet för att hålla nerven intakt med muskeln. Operatörens förmåga måste således testas på kontroll möss innan någon annan experimentell modell görs. I kontroll möss förväntas muskel kontraktila svaren på direkta och indirekta stimuli vara densamma, vilket ger en kontroll till operatörens kirurgisk förmåga.
En annan avgörande punkt är behovet av att säkerställa att direkt pulser inte aktiverar muskeln av stimulerande intramuskulär grenar av nerv och att pulserna tillämpas på nerven inte aktiverar muskeln i ett tingsliga sätt genom att sprida aktuella i badet. Den första punkten kan testas genom att utföra en separat uppsättning experiment där muskeln stimuleras direkt på membranet både före och efter D-tubokurarin (25 µM) har lagts till fysiologiska badet. När nuvärdet supramaximal har åtgärdats, bör muskel svaret inte ändras genom tillägg av D-tubokurarin. Den andra punkten är relaterat till längden på den exciderad nerven, och är därmed mer mottagliga för variation. Strömmen vid sug elektroden måste utvärderas före början av varje test som beskrivs i avsnittet protokoll.
Slutligen, eftersom NMJ funktionalitet bedöms genom att jämföra den muskel svaren på direkt och indirekt stimulering, de elektriska pulserna måste synkroniseras mycket exakt. Denna punkt är särskilt viktigt för två trötthet paradigm i slutet av protokollet under vilken stimuleras muskeln en gång på membranet och 14 gånger genom nerv. Eftersom både stimulering faser och de övriga tiderna är mycket låg (0,33 s och 0,67 s för diafragman), även en mycket låg fördröjning skulle leda till en obalanserad stimulering av en av de två avdelningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbete i författarnas laboratorium stöddes av Fondazione Roma och Telethon (bevilja nr. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
