Summary
En funksjonell vurdering av nevromuskulær krysset (NMJ) kan gi viktig informasjon om kommunikasjonen mellom muskler og nerve. Her beskriver vi en protokoll for grundig vurdere både NMJ og muskel funksjonaliteten med to forskjellige muskel-nerve preparater, i.e. soleus-ischias og membran-phrenic.
Abstract
Nevromuskulær krysset (NMJ) funksjonaliteten spiller en avgjørende rolle når studere sykdommer der kommunikasjonen mellom motor neuron og muskel er svekket, som aldring og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Her beskriver vi en eksperimentell protokoll som kan brukes til å måle NMJ funksjonalitet ved å kombinere to typer elektrisk stimulering: direkte membran muskelstimulasjon og stimulering gjennom nerve. Sammenligning av muskel respons på disse to forskjellige stimulations kan bidra til å definere, på funksjonell nivå, mulige endringer i NMJ som fører til funksjonelle nedgang i muskel.
Ex vivo forberedelser er velegnet for godt kontrollerte studier. Her beskriver vi en intensiv protokoll for å måle flere parametere av muskel- og NMJ funksjonalitet for soleus-sciatic nerve utarbeidelse og membran-phrenic nerve forberedelse. Protokollen varer ca 60 min og utføres uavbrutt gjennom et skreddersydd programvare som måler egenskapene twitch kinetikk, kraft-frekvens forholdet for både muskel- og stimulations og to parametere gjelder for NMJ funksjonaliteten, i.e. neurotransmission svikt og intratetanic trøtthet. Denne metoden ble brukt til å oppdage skader i soleus og membran muskel-nerve forberedelser ved hjelp SOD1G93A transgene musen, en eksperimentell modell av ALS som overalt overexpresses mutant antioksidant enzymet superoxide dismutase 1 (SOD1).
Introduction
Nevromuskulær krysset (NMJ) er en kjemisk synapse dannet av forbindelsen mellom den motor endplate av muskel fiber og motor neuron axon terminal. NMJ har vist seg å spille en avgjørende rolle når kommunikasjonen mellom muskler og nerve er svekket, som forekommer i aldring eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Som muskel- og kommunisere på et toveis måte1,2, kan å kunne måle NMJ feil separat fra muskel defekter gi ny innsikt i deres physiopathological samspill. Faktisk kan denne funksjonelle evalueringen hjelpe for å vurdere om morfologiske eller biokjemiske endringer redusere neurotransmission signalering funksjonalitet.
Sammenligning av muskel kontraktile respons skapte nervestimulering og responsen fra det likt muskelen fremkalt av direkte stimulering av dets membran foreslått som en indirekte måling av NMJ funksjonalitet. Faktisk siden membranen stimulering by-pass neurotransmission signalering, kan eventuelle forskjeller i de to kontraktile svarene tilskrives endringer i NMJ. Denne tilnærmingen har vært mye foreslått for rotter,3,,4,,5,,6,,7, og også brukes til å samle informasjon om musen modeller8,9,10,11,12.
Her beskrive vi i detalj en prosedyre for å avgiftsdirektoratet og teste to muskel-nerve preparater, IE soleus-ischias og membran-phrenic forberedelsene. Ved hjelp av en skreddersydd programvare, vi utviklet en kontinuerlig testing protokoll som kombinerer måling av flere parametere som preger både NMJ og muskel-funksjonalitet, og dermed gir en omfattende vurdering av NMJ skade separat fra det muskler. Spesielt måler protokollen twitch styrken, muskel kinetikk, kraft-frekvens kurve for direkte og nerve stimulations, den neurotransmission feil13 for både en avfyring og tetanic frekvenser og intratetanic trøtthet7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen vi beskrev gir informasjon om funksjonelle denervation i flere neuromuscular sykdommen eller aldring-sarcopenia. Denne protokollen kan brukes til å fastslå om (og hvis så, på hvilket nivå) muskel endringer leies selektiv endringer som skjer i muskel selv eller nevromuskulære overføring. Dataene nedenfor er resultatet av et tidligere verk av vår gruppe18, gjennomført på SOD1G93A transgene musemodell av amyotrofisk lateral sklerose på slutten-stadium av sykdommen20. SOD1G93A transgene musen overexpresses overalt mutant antioksidant enzymet superoxide dismutase 1 (SOD1). Tall 3 og 4 viser dF/dt og tetanic kraft verdier for soleus-sciatic nerve (venstre) og membran-phrenic nerve (høyre) forberedelsene. Disse resultatene viser evne til teknikken foreslått her å oppdage de funksjonelle mangler i transgene muskler som er knyttet til NMJ i motsetning til de strengt knyttet til muskel selv. Faktisk for både dF/dt og tetanic kraft vises SOD1G93A soleus musklene redusert kontraktile svar, sammenlignet med kontrollen muskler, når stimulert direkte, og vises en ytterligere reduksjon når stimulert gjennom nerve. Derimot ble mild endringer observert i disse to parametere når membran muskel strimler ble stimulert gjennom membran, mens betydelige endringer ble oppdaget da membran muskelen ble stimulert gjennom nerve.
Figur 3 - Contractile kinetics. Mener ± SEM av dF/dt for soleus (A) og membran (B) forberedelsene. Soleus prøver vises en betydelig bremse ned når direkte stimulert (-27%), og en ytterligere nedgang når stimulert gjennom nerve (-58%). Membran prøver vises en bremse ned når stimulert gjennom nerve (-30%). Tilpasset Rizzuto et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 - Tetanic kraft. Mener ± SEM tetanic bestemt kraft for soleus (A) og membran (B) forberedelsene. Soleus prøver vises en betydelig bremse ned når direkte stimulert (-26%), og en ytterligere nedgang når stimulert gjennom nerve (-50%). Membran prøver vises en force nedgang bare når stimulert gjennom nerve (-44%). Tilpasset Rizzuto et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Evalueringen av intratetanic trøtthet og neurotransmission feil tillatt NMJ bestemte parametere som skal måles. Figur 5 viser gjennomsnittlige verdiene av intratetanic utmattelse (hvis) målt under tetanic trøtthet paradigme for soleus muskler (figur 5A) og membran strimler (figur 5B). Som rapportert i delen protokollen, ble tretthet paradigme vi brukt utviklet på en slik måte å understreke NMJ skjønt ikke muskler. Hvis målt resultatet for den direkte muskelstimulasjon ble aldri endret. Faktisk hvis beregnet for nervestimulering er parameteren som må vurderes for sammenligninger mellom forskjellige musen stammer. Våre resultater viser hvis var betydelig lavere både transgene soleus og membran muskler enn i kontroll-kolleger. Denne forskjellen var større i mellomgulvet, som en liten muskel feil ble oppdaget, og mindre soleus, der betydelig muskel skader hadde allerede målt. Det skal bæres i bakhodet at siden transgene soleus muskelen ble betydelig skadet, NMJ evalueringen var bare riktig for opp til 8 min av stimulering, som er tiden det tar for transgene muskel returnere nullverdien kraft når stimulert. Transgene soleus hvis verdiene etter 8 min av stimulering i utgangspunktet uttrykke støy.
Figur 5 - Intratetanic trøtthet. Intratetanic trøtthet for soleus (A) og membran (B) musklene vises en betydelig reduksjon i transgene NMJ funksjonalitet. Verdiene er gjennomsnittlig ± SEM. tilpasset Rizzuto et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 viser neurotransmission svikt på tetanic frekvens målt i soleus (figur 6A) og membran (figur 6B) prøver. I tråd med Hvis resultatene, ble ingen feil i neurotransmission oppdaget i soleus muskler, mens membran muskel prøver vises en betydelig økning i nevromuskulær krysset fatigability.
Figur 6 -Neurotransmission svikt. Neurotransmission feil vise ikke noen endringer i den soleus muskler (A), mens merket en betydelig nedgang i NMJ funksjonalitet i transgene strimler membran (B). Verdiene er gjennomsnittlig ± SEM. tilpasset Rizzuto et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentell protokollen beskrevet ovenfor gir en ideell måte å måle og diskriminerende alle funksjonelle endringer som har skjedd i muskelen eller indirekte på nevromuskulær krysset nivå. Siden denne teknikken er basert på en indirekte måling av NMJ funksjonalitet, kan det brukes til å opprette hvis noen feil knyttet til morfologiske endringer eller biokjemiske endringer. Derimot, gir den en effektiv måte å avgjøre om noen morfologiske eller biokjemiske endringer har redusert neurotransmission signalering funksjonalitet. Men når force målinger er fullført, kan muskel fjernet fra bad, strøket, festet på optimale lengden, omgitt av innebygging sammensatte, og raskt frosset i smelter isopentane. Muskler kan lagres ved-80 ° C for senere vurdering som immunohistochemical og morfologisk analyse.
Teknikken foreslår vi her er basert på en eksperimentell testing protokoll som kombinerer, for første gang, måling av flere parametre som karakteriserer NMJ og muskel. Tre sentrale punkter sikre at denne teknikken gir pålitelige resultater.
Først, selv om Skjelettmuskel excision er nå en relativt vanlig teknikk, ekstra hensyn må tas når den kirurgiske prosedyren for å holde nerve intakt med muskler. Operatørens evne må dermed testes på kontroll mus før alle andre eksperimentelle modeller er forsøkt. I kontroll mus forventes muskel kontraktile svar direkte og indirekte stimulations å være den samme, gir en kontroll til operatør kirurgisk evne.
En annen avgjørende punktet er behovet for å sikre at direkte pulser ikke aktiverer muskelen av stimulerende intra-muskuløse grener av nerve og at pulser på nerve ikke aktiverer muskelen på en artefactual måte ved å spre gjeldende i badekaret. Det første punktet kan testes ved å utføre et separat sett av eksperimenter der musklene blir stimulert direkte på membranen både før og etter D-tubocurarin (25 µM) er lagt til fysiologiske badekaret. Når den gjeldende verdien for supramaximal er løst, bør muskel svaret ikke endres med tillegg av D-tubocurarine. Det andre punktet er knyttet til lengden på forbrukeravgift nerve, og er derfor mer utsatt for variasjon. Gjeldende på inntaks elektroden må evalueres før begynnelsen av hver test, som beskrevet i delen protokollen.
Til slutt, siden NMJ funksjonalitet vurderes ved å sammenligne muskel svaret direkte og indirekte stimulering, de elektriske pulser må synkroniseres meget presist. Dette punktet er spesielt viktig for to tretthet paradigmer på slutten av protokollen der musklene blir stimulert gang på membranen og 14 ganger gjennom nerve. Siden både stimulering fasene og resten times er svært lav (0,33 s og 0,67 s for membranen), med en svært lav lag ville føre til en ubalansert stimulering av en av de to avdelinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeid i forfatternes laboratorium ble støttet av Fondazione Roma og Telethon (gi nei. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
