Summary
La producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones. Aquí se demuestra un protocolo sencillo para la alimentación de la garrapata inmadura que es rentable y menos estresante para ratones.
Abstract
Ixodes scapularis , el vector de la enfermedad de Lyme, es uno de los más importantes vectores de enfermedades en el este y el medio oeste de los Estados Unidos. Esta especie es una garrapata de tres huéspedes que requiere una comida de sangre de un huésped vertebrado para cada etapa de desarrollo, y las hembras adultas requieren una comida de sangre para su reproducción. Las garrapatas larvales se unen a su huésped durante 3 - 5 días para la alimentación y dejar al huésped cuando están completamente hinchadas. Esta dependencia de varios huéspedes diferentes y el largo tiempo de fijación para el engorgamiento complica la elevación de las garrapatas en el laboratorio. Sin embargo, para entender la biología de la garrapata y las interacciones de la garrapata-patógeno, la producción de garrapatas sanas, criadas en laboratorio es esencial. Aquí, demostramos un sencillo, costo-efectiva protocolo para inmaduros tick alimentación en ratones. Se modificaron los protocolos existentes para disminuir el estrés en los ratones y el aumento del éxito de la alimentación de garrapatas y la supervivencia mediante el uso de jaulas desechables sin fondo de malla para evitar el contacto de garrapatas wiAgua contaminada con orina y heces de ratones.
Introduction
Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados de los vertebrados y se distribuyen en todo el mundo. En los Estados Unidos, al menos 11 especies de garrapatas son vectores de patógenos de importancia para la salud pública 1. Ixodes scapularis es responsable de la transmisión de varios patógenos tales como los agentes causantes de la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi) fiebre recurrente (B. miyamotoi), anaplasmosis granulocítica humana (Anaplasma phagocytophilum), y babesiosis (Babesia spp.). A pesar de la importancia de I. scapularis como vector de la enfermedad, la recogida de estos arácnidos en abundancia en la naturaleza para los estudios en el laboratorio no siempre es factible. Por lo tanto, la producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones.
El ciclo vital de todas las garrapatas duras (Ixodidae) de la familia, incluyendo I. scapularis, consiste en el huevo y tres activetapas e: larva, ninfa y adulto. Cada etapa activa se alimenta de un huésped vertebrado. Las complejas interacciones que tienen lugar entre las garrapatas y sus anfitriones lo largo de varios días de fijación y la alimentación son casi imposibles de replicar usando alimentadores artificiales, y es improbable que proporcionar suficientes números de Fed garrapatas para la cría masiva de 2, 3, 4. Por lo tanto, los ratones y conejos vivos son los más usados como anfitriones para la crianza de inmaduros (larvas y ninfas), y etapas maduras (adultos) de las garrapatas, respectivamente. El requisito de múltiples hosts para la alimentación de sangre durante cada etapa de desarrollo complica la cría de garrapata, y es el tiempo y el coste intensivo de 5, 6, 7. La mayoría de los protocolos de garrapatas cría requieren mantenimiento de los ratones en una jaula de alambre suelo de rejilla suspendido 7, 8 o en una ca cilíndricaGe de tales dimensiones que el animal no puede moverse libremente y prepararse 6 , 9 , 10 .
Estas jaulas cilíndricas se transfieren posteriormente a una jaula de caja de zapatos con una rejilla de alambre. Las garrapatas engorged, separadas se recogen entonces del agua debajo. Sin embargo, este método resulta en la exposición de las garrapatas alimentadas a agua contaminada con orina y heces que pueden aumentar el crecimiento de hongos y la mortalidad de garrapatas 9 . Además, aumenta la posibilidad de escape de garrapata de la depresión de agua, así como causar estrés a los ratones. Para eludir estos problemas, aquí se demuestra la alimentación de garrapatas de larvas en ratones dentro de jaulas desechables de tipo caja de zapatos de plástico. Este método permite el comportamiento normal de los ratones, aumenta la recuperación de garrapatas engorged, y disminuye la mortalidad de garrapatas debido a la contaminación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo (Número-00682) se describe a continuación es aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Nevada, Reno y sigue las directrices de la Universidad de Nevada, animal comité de ética de investigación de Reno. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se utilizó un cono de la nariz para mantener los niveles de isoflurano continuas durante 20 min. Un ungüento veterinario se utilizó para evitar el secado de los ojos bajo anestesia. pellizco del dedo del pie se utilizó para determinar el nivel de anestesia y la frecuencia respiratoria se midió durante todo el procedimiento. Los ratones se mantuvieron en jaulas individuales y supervisados hasta que se recuperó la conciencia. Los ratones se usaron sólo una vez para marcar la alimentación y se sacrificaron recuperación posterior garrapata. La eutanasia se llevó a cabo por el Laboratorio de personal del personal de medicamentos para animales. CO 2 y dislocación cervical se utilizaron para la eutanasia de los animales.
NOTA: Trabajar sobre las garrapatas requiere el uso de la ecuación de protección personal completaUipment. Para contar las garrapatas inmaduras, use batas de laboratorio blancas, guantes largos de nitrilo para cubrir la abertura de la manga de la bata de laboratorio tapada con gomas y zapatos cerrados. Para infestar ratones con garrapatas, utilice una red de pelo, trajes desechables, guantes de manga larga sobre las mangas y cubiertas de los pies. Use batas blancas o de colores claros para detectar garrapatas rebeldes. Revise periódicamente los guantes y las mangas de las garrapatas.
1. Sala de Preparación para la Vivienda de Animales
- Designe una sala separada para alojar ratones infestados con garrapatas. Coloque una alfombra pegajosa o cinta adhesiva de dos caras en el exterior y en el interior de la puerta para evitar el escape accidental de garrapatas.
2. Cuenta de las garrapatas para la infestación de ratón
- Coloque cinta adhesiva de doble cara alrededor de los bordes superiores de un recipiente de plástico de 7 "x 5" x 14 "y rellene con agua hasta aproximadamente 2 cm.
- Coloque otra pequeña caja o placa de Petri en el centro del recipiente y rellene con agua hasta 1 cm,# 34; foso" alrededor de este envase
- Almacenar el vial que contiene larvas o ninfas dentro de la placa de Petri.
- Utilice un pincel fino para eliminar las larvas o ninfas del vial y contar con el microscopio. Contar 50 larvas o ninfas 25 en viales de centelleo separados. Cubrir los viales inmediatamente con malla de nylon o pantalla de tela organdí y cerrar con bandas de goma.
3. Los ratones que infestan con garrapatas inmaduras
- Utilizar un banco de trabajo de color blanco o claro y se adhieren cinta de doble cara en todo el perímetro de la zona de trabajo.
- Anestesiar al ratón con isoflurano. Comprobar el nivel de anestesia mediante la pizca dedo del pie. Una vez anestesiados, transferir el ratón para una resistencia de calentamiento cubierto con toallas de papel y adjuntar a un cono de la nariz para el suministro continuo de isoflurano.
- Aplicar petróleo ungüento para los ojos a base de jalea para evitar la sequedad. Tenga en cuenta el patrón de respiración del ratón para ajustar los niveles de isoflurano (80 -. 230 respiraciones por min es normal, Reducir el nivel de isoflurano si brtasa eathing es de menos de 80 respiraciones por min para evitar la muerte del animal).
- Tomar un vial de 50 larvas o ninfas 25 y el lugar garrapatas bajo la piel en la cabeza entre las orejas con un cepillo de pintura (Figura 1). Mantenga ratón bajo anestesia durante 20 min después de la colocación para dar tiempo suficiente para que las garrapatas adjuntar.
- Mueve el ratón para un plástico caja de zapatos en forma de jaula de ratón estándar desechable con tapas estáticas y ropa de cama blanco. Proporcionar juguetes, agua y alimento ad libitum de acuerdo con el cuidado normal de ratón.
- Almacenar la jaula del ratón dentro de una jaula de rata o jerbo grande forrado con cinta de doble cara adhesiva alrededor de los bordes superiores. Llene la jaula externa con 3 cm de agua (Figura 2).
4. Recogida de las garrapatas de ratones
- garrapatas inmaduras se separan entre los días 3 y 6 de la alimentación. Compruebe las jaulas y un foso de agua de garrapatas saciadas todos los días después del día 3.
- Recoger las garrapatas desprendidas de la jaula entre los días 4 y 6. Uso de un dolorT pincel o fórceps suave para recoger las garrapatas congestionadas y almacenar en viales de centelleo limpios cubiertos con tela de malla de nylon asegurada con bandas de goma.
- Anestesiar y comprobar el ratón en el día 7 para cualquier resto de garrapatas adjunta.
- Compruebe la ropa de cama, el comedero y la botella de agua para las garrapatas congestionadas el día 7. Eutanee los ratones siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Autoclave las jaulas desechables, la ropa de cama, la botella de agua, y el comedero de la comida para evitar cualquier garrapatas sin escape.
5. Almacenamiento de garrapatas Fed
- Mantener las garrapatas con congestión a 90% de humedad, 20 ° C y un ciclo de 12:12 luz: oscuridad en una incubadora de humedad y temperatura controlada hasta que ocurre la muda. Esto puede tomar aproximadamente 12 a 18 semanas para ocurrir.
- Mientras que la alta humedad promueve la supervivencia de la garrapata, también hace que las garrapatas sean propensas al crecimiento excesivo de hongos. Compruebe las garrapatas alimentadas bajo el microscopio al menos una vez a la semana para el moho. Si se detecta, lave a los supervivientes en etanol al 70% durante 5min., enjuague en agua, la transferencia a un papel de filtro para secar, y transferir a las nuevas, viales limpios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemos modificado los protocolos de cría de garrapatas existentes 6, 10 para mejorar la eficiencia de la alimentación y la reducción del estrés en el host del ratón. Los resultados demuestran que las jaulas de ratón estándar estilo caja de zapatos son muy adecuados para la cría de garrapata. La ropa de cama blanca proporciona un buen contraste para facilitar la recogida de las garrapatas alimentadas. La mayoría de las garrapatas subieron por las paredes de los recipientes después de la alimentación y eran fáciles de obtener. Además, la tapa apretada equipado de las cajas de plástico desechables (usado de forma rutinaria para los ratones de cubierta en UNR) impidió tick escape de la caja. Además, no se afeitaba ratones para la infestación por garrapatas (Figura 1). Estos cambios en los protocolos publicados como resultado significativo fijación de la garrapata, la congestión, y la supervivencia.
Este protocolo es rentable, ya que no requiere de ninguna de las jaulas especiales del ratón fuera de los alreadY en uso. También es menos intensivo de mano de obra, ya que no tenemos que recoger las garrapatas congestionadas todos los días. Se recogieron las garrapatas entre los días 4 y 6 después de las infestaciones. La mayoría de las garrapatas se separaron por el día 4 y algunas restantes se desprendieron por el día 5. Al día 7 todos los ratones estaban libres de garrapatas. Hemos sido capaces de recuperar una media de 67% (rango 52 - 92%) garrapatas larvadas ingurgitadas ( Tabla 1 ]. Todos los ratones estaban sanos y no mostraron ningún signo de malestar.
Figura 1: Alimentación de larvas de Ixodes scapularis en ratones. Los ratones se infestaron individualmente con 50 garrapatas larvarias. Las garrapatas congestionadas dejaron caer el ratón entre los días 4 - 6. Las jaulas fueron revisadas para detectar cualquier garrapata restante el día 7 y descartadas después. A: Infestación de ratones con garrapatas larvales no depuradas. B: Una garrapata larval que se adhiere a la oreja de un ratón. C: Ungarrapata larval llena de sangre unido a la oreja de un ratón, 3 días de post infestación. D: Espontánea y larvas de garrapata completamente llena de sangre.
Figura 2: Ratón Jaula La configuración de la infestación por garrapatas. Dos jaulas de ratón desechables se mantuvieron dentro de una jaula de hámster. Aproximadamente 3 cm. Se añade agua a la jaula de hámster para hacer un foso. cinta de la alfombra pegajosa de doble cara se haya colocado alrededor de los bordes superiores de la jaula de hámster para evitar el escape de la garrapata.
| Animales (ratón) | Número total de larvas de garrapatas se recuperó | Porcentaje de larvas de garrapatas recuperadas |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| PROMEDIO | 66,8% |
Tabla 1: Número de Engorged Ixodes scapularis larvas recuperadas después de Laboratorio infestación en Hosts anestesiados mouse. Cada ratón se infestó con 50 larvas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Es importante tener varios niveles de medidas de seguridad cuando la crianza de garrapatas para evitar el escape accidental. El uso de cinta adhesiva y un foso de agua son fundamentales para garantizar la seguridad. Es importante mantener el ratón anestesiado en una almohadilla de calefacción para mantener constante la temperatura del cuerpo. También se encontró que afeitarse el ratón no proporciona ningún beneficio adicional para la fijación de la garrapata. Un ratón individual se puede mantener en la misma jaula durante una semana en un designado "habitación tick" que limita aún más el contacto de las garrapatas con el personal.
Modificaciones y solución de problemas
La producción de alta calidad, garrapatas criados en el laboratorio es necesaria para los estudios sobre la biología y las interacciones garrapata garrapatas patógenos. Protocolos de alimentación anteriores utilizan piso de alambre suspendida 8 o jaulas cilíndricas para mantener a los ratones inmóvil 6, 10 que incurren en un costo adicional, así como el estrés para el animal. Además, la jaula de alambre suspendida permite que las garrapatas hinchadas caigan a través del alambre en el agua contaminada con orina y heces del ratón, aumentando así el riesgo de crecimiento del moho.
Limitaciones de la técnica
Como se muestra en los datos, hemos recuperado con éxito en promedio 65% (hasta 92%) de las garrapatas. De vez en cuando encontramos garrapatas en el foso de agua fuera de la jaula del ratón pero ninguno escapó. La cinta pegajosa en las paredes exteriores del segundo contenedor impidió que las garrapatas escaparan.
Significado de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos
Nuestro protocolo de usar jaulas de ratones desechables de estilo caja de zapatos permite un rango libre de movimiento y demuestra que los ratones no necesitan ser restringidos para permitir la alimentación de garrapatas. La mayoría de las garrapatas alimentadas se veían fácilmente y se recogían de las paredes transparentes de la jaula y las garrapatas restantes eran fácilmentedetectado entre la ropa de cama al final del ciclo de alimentación. Este protocolo no requiere ningún tipo de jaula de ratón personalizado, por lo tanto, es rentable.
La literatura sugiere que menos del 50% de las garrapatas se adhieren a ratón y no todas las garrapatas fijadas a alimentar a la terminación. En promedio, se recogieron ~ 60% de larvas de garrapatas hinchadas. No se encontró ninguna escaparon garrapatas sin alimentar o Fed. De vez en cuando nos encontramos una o dos larvas de garrapatas hinchadas en un foso de agua, pero ninguno en la cinta adhesiva. Nuestros resultados sugieren que no todas las garrapatas se adhieren al huésped y pueden morir sin alimentarse. Sin alimentar, garrapatas muertas eran difíciles de encontrar en la hojarasca. De vez en cuando, también encontramos manchas de sangre en la ropa de cama blanca que sugiere que, o bien de ratón han matado a la garrapata llena de sangre después de dejar o rascado. Nuestros datos y la observación diaria de las jaulas sugieren que congestionan las garrapatas o bien moverse hacia arriba en las paredes de la jaula y la parte superior de la jaula o esconderse debajo de la ropa de cama, fuera del alcance del ratón. Por lo tanto, la jaula cerrada no tienen unaY el impacto negativo sobre la supervivencia de garrapatas.
Aplicaciones o direcciones futuras después de dominar esta técnica
Nuestro protocolo proporciona una alternativa simplificada para la cría en masa de garrapatas sin añadir costo adicional o reducir la seguridad del personal que maneja los animales. La futura experimentación se centrará en mejorar los métodos de alimentación de I. scapularis adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
