Summary
Denne protokol beskriver rekonstituering af nukleosomer indeholder differentielt isotopmærkede søster histoner. Samtidig kan asymmetrisk posttranslationelt modificerede nukleosomer genereres efter anvendelse af en premodified histon kopi. Disse præparater kan let anvendes til at studere modifikation krydstale mekanismer, samtidigt på begge søster histoner, ved hjælp af høj opløsning NMR-spektroskopi.
Abstract
Asymmetrisk modificerede nukleosomer indeholder to kopier af et histon (søster histoner) dekoreret med forskellige sæt post-translationelle modifikationer (PTMS). De er nyligt identificerede arter med ukendte midler til etablering og funktionelle konsekvenser. Aktuelle analysemetoder er utilstrækkelige til at påvise kopi-specifikke forekomst af PTMS på nukleosomale søster histoner. Denne protokol udgør en biokemisk fremgangsmåde til in vitro rekonstitution af nukleosomer indeholdende differentielt isotopmærkede søster histoner. Den genererede komplekset kan være også asymmetrisk modificeres efter herunder en premodified histon pulje under refoldning af histon subcomplexes. Disse asymmetriske nucleosomstørrelse præparater let kan reageret med histon-modificerende enzymer til at studere modifikation cross-talk mekanismer pålagt af asymmetrisk forhånd indarbejdet PTM hjælp kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Især angår modifikationsreaktioner irealtid kan kortlægges uafhængigt på de to søster histoner ved at udføre forskellige typer af NMR-korrelations- eksperimenter, skræddersyet til den respektive isotop type. Denne metode giver mulighed for at studere krydstale mekanismer, der bidrager til dannelsen og udbredelsen af asymmetriske PTM mønstre på nukleosomale komplekser.
Introduction
Eukaryot DNA er stramt pakket i cellekerner i kromatin. Den grundlæggende byggesten i kromatin er nukleosom kernepartikel, der indeholder ~ 147 bp af DNA viklet omkring en octamere kompleks bestående af to kopier af hver af de fire centrale histoner (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteiner huser et væld af post-translationelle modifikationer (PTMS). Disse kovalente udskiftninger medføre forandringer i kromatin struktur, både direkte ved at påvirke den fysiske kemi af systemet og indirekte ved at rekruttere kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Med disse midler, histon PTMS styrer kromatin tilgængelighed og dermed regulere alle DNA-baserede cellulære funktioner 4.
PTMS installeres af histon-modificerende enzymsystemer hovedsageligt på de ustrukturerede N-terminale segmenter (haler) af nukleosom-inkorporeret kerne histoian. På grund af de mange modifikationssteder på forholdsvis kort sekvens af histon haler, PTMS påvirker hinanden ved at inducere eller blokering efterfølgende modifikationsreaktioner, en virkning, der kaldes modifikation krydstale 5. På grund af den samlede symmetriske arkitektur af nukleosom blev modifikationsreaktioner og krydstale mekanismer menes at opstå tilsvarende til de to kopier af hver nukleosomal histon (søster histoner). Dette koncept blev for nylig udfordret og efterfølgende modbevist. Især in vitro-enzymatiske assays på fri histon H3 hale peptider og på nukleosomer viste, at et sæt H3 kinaser indført fosforylering i en asymmetrisk måde 6. Derudover affinitet-oprensning-baserede LC-MS / MS-analyse afslørede tilstedeværelsen af asymmetrisk H3-methyleret nukleosomer i flere typer af eukaryote celler 7. Således asymmetrisk modificerede nukleosomer udgør hidtil ukendte arter, ogværktøjer er nødvendige for at afdække de mekanismer, der styrer deres dannelse og til at analysere krydstale effekter, som denne asymmetri kan udøve.
Sædvanligvis har Western Blotting (WB) og massespektrometri (MS) analyse blevet anvendt til at detektere histon PTMS. På trods af sin nem anvendelse, WB lider specificitet / krydsreaktivitet problemer. Oven i det, er det ude af stand til at udføre samtidige multi-PTM analyse og direkte kvantificering af modifikationen reaktioner 8. På den anden side, MS-analyse anvender sofistikeret instrumentering, der kræver uddannelse på højt niveau, men giver høj specificitet samt samtidig kortlægning og kvantificering af multiple PTMS 9. Men begge metoder er forstyrrende og nukleosomale komplekser dissocieres før analyse, hvilket giver anledning til en blanding af histoner og / eller histon-afledte peptider. Denne manipulation fjerner evnen til at skelne uafhængigemodifikation reaktioner, der forekommer på hver af de to søster histoner og at rapportere kopien-specifikke modifikation status nukleosomale histoner.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi udviklet sig som en alternativ metode til kort PTM reaktioner. NMR er uforstyrret og tillader således overvågning af PTM begivenheder i en real-time måde i rekonstituerede blandinger, og selv i intakte celler 10, 11. Udviklingen af rutiner til hurtig dataindsamlings- og for høj opløsning kortlægning baseret på 2D hetero-nuklear sammenligningstabeller metoder til isotopmærkede (15N og / eller 13C) prøver 12 tillod den samtidige kortlægning af forskellige typer PTMS, såsom som serin / threonin / tyrosinphosphorylering, lysin acetylering / methylering og arginin methylering 13. Afhængigt af PTM under undersøgelsen, 15 N- eller 13C-mærkning protocols kan anvendes til at markere det protein funktionel gruppe, der fungerer som en modifikation reporter. Følgelig kan PTM kortlægning udføres ved at følge den karakteristiske kemiske skift forskydning af den tilsvarende funktionelle gruppe "sensing" ændringen på det kemiske miljø. I de fleste tilfælde kan både NH og CH kemiske grupper anvendes til at rapportere udviklingen i PTM af interesse.
Den nuværende protokol beskriver generation af nukleosomer indeholder differentielt isotopmærkede søster histoner. Den kombinerer fleksibiliteten af NMR-spektroskopi til kort PTMS anvendelse af både 1 H- 15 N og 1H-13C korrelationsspektre med udnyttelsen af forskellige protein affinitetsmærker til oprensning af de udvalgte rekonstituerede histon-komplekser. Især protokollen anvender to forskellige puljer af en bestemt histon for nukleosom rekonstituering. Disse puljer er differentielt isotop-mærket (et med
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rekonstituering af nucleosomer med differentielt Isotope-mærket (og Asymmetrisk ændret) Sister Histoner
BEMÆRK: Den nuværende protokol beskriver rekonstituering af nukleosomer med forskelligt isotop-mærket histon H3. Til dette formål blev to puljer af histon H3 anvendes; en var 15 N-mærket og indeholdt en 6xHis-tag ved N-terminus og andet var 13 C-mærket og indeholdt Strep peptid (WSHPQFEK) fusioneret ved N-terminalen. Begge mærker blev separeret fra den native H3-sekvens med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease genkendelsessite. For at forberede yderligere asymmetrisk modificerede nukleosomer, er en af de to H3 puljer indgår i en premodified formular. Premodification af en histon pulje kan udføres ved omsætning af isotop-mærket histon af interesse med den respektive histon-modificerende enzym i nærværelse af den nødvendige for hver type reaktion cofaktorer / ns donorer 16. Den effektive placering af den respektive PTM kan vurderes ved NMR-spektroskopi eller massespektrometri. Mængderne af histoner / DNA anvendt her, er ru anbefalinger om at anskaffe en nukleosom præparat med en omtrentlig koncentration på 10 uM (målt som DNA-koncentration ved 260 nm) .Dette endelige udbytte er tilstrækkelig til at optage god kvalitet NMR-spektre med relativt korte erhvervelsestider.
- Rekonstituering af et histon octamer med forskelligt isotop-mærket (og asymmetrisk modificeret) histon H3
BEMÆRK: Rekombinant histonproteiner kan fremstilles i mg kvantiteter i BL21 (DE3) pLysS celler 14. Til opnåelse isotopmærkede histoner, er det samme udtryk / oprensningsprotokol følges med undtagelse af anvendelse af for bakterievækst et minimalt medium indeholdende 15 NH4CI og / eller 13C-glucose som nitrogen- og carbonkilder, for 15 N- eller 13 respecti C-mærkningholdsvis. Rensede histoner er udførligt dialyseres mod 5 mM β-mercaptoethanol og opbevaret frysetørret før brug.- Opløs lyofiliserede histon alikvoter indeholdende ~ 5 mg af hver histon i 1 ml udfoldning buffer (7 M guanidinium-HCI, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Medtag begge typer histon H3. Bland ved pipettering og ikke vortex. Hold rørene på is i 30 minutter for at tillade fuldstændig udfoldning.
- Bestemme den nøjagtige koncentration af hver histon ved måling af absorbansen ved 280 nm mod udfoldning puffer og under anvendelse ekstinktionskoefficienter beregnet med ProtParam redskab for ExPASy portalen. 15
- Bland de centrale histoner til ækvimolære forhold, holde sig for øje at omfatte 50% hver af de to histon H3 puljer. Start med at bruge hele indholdet af mindre koncentreret histon og tilføje alle de andre i overensstemmelse hermed.
- Juster endelig proteinkoncentration på ca. 1 mg / ml under anvendelse af udfoldning puffer.
- overfr af blandingen til en 6 kDa-cutoff dialyse membran og dialyseres mod 1-2 L kølet genfoldningsbufferen (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) ved 4 ° C. Ændre puffer mindst én gang efter dialyse er forløbet i mindst 3 timer. Udfør en endelig dialyse O / N ved 4 ° C.
- Indsamle dialyseret materiale og fjerne eventuelle præcipitater ved centrifugering i en mikrofuge i 5 minutter ved 4 ° C på maksimal hastighed (normalt ingen udfældning bør observeres). Bestem octamer koncentration ved at måle absorbansen ved 280 nm. I beregningerne bruge den ekstra ekstinktionskoefficienter af histoner, holde sig for øje at fordoble hver værdi.
- Opkoncentrering af et slutvolumen på ~ 2 ml under anvendelse af en 10 kDa-afskæring centrifugalfilterenhed. Genberegn octamer koncentration og estimat tab. På dette tidspunkt, en octamer koncentration mellem 50 - skal indhentes 100 uM.
- Tilslut gelfiltreringskolonne (angivet i tabellen Materialer) til enFPLC-system og tempereres med 2 søjlevolumener (CV) på 0,22 um-filtreret og afgasset refoldningsbuffer ved en strømningshastighed på 1 ml / min og et tryk grænse på 0,5 MPa.
BEMÆRK: gelfiltrering run skal udføres i det kolde rum eller i et koldt skab. - Injicere koncentrerede materiale under anvendelse af en strømningshastighed på 1 ml / min og indsamle 1,0 - 1,5 mL fraktioner.
- Følg den kromatografiske profil og observere histon octamer eluering ved ~ 65 - 68 ml.
BEMÆRK: En lille skulder af toppen eluering og en top på ~ 80 ml indikerer eksistensen af frie H3-H4-tetramerer og H2A-H2B dimerer hhv. - Kør 20 pi af hver opsamlet fraktion i en 18% SDS-PAGE-gel.
BEMÆRK: Fortynd prøverne med en faktor på mindst 2 med vand, før du lægger dem på gelen for at mindske den høje saltkoncentration og dermed undgå forvridninger. Det samme gælder for efterfølgende SDS-PAGE-analyser af prøver i genfoldningspuffer. - Pool relevant FRAKTIONER indeholder rene oktamerer bedømt af den lige fordeling af de 4 histoner på den farvede gel og bestemmer koncentrationen som før (trin 1.1.7).
- Tilslut en 1 ml Ni-NTA søjle (tabel of Materials) til et FPLC-system og ligevægt med 10 CV på 0,22 um-filtreret og afgasset refoldningsbuffer ved en strømningshastighed på 1 ml / min.
BEMÆRK: Ni-NTA kromatografi skal udføres i det kolde rum eller i et koldt skab. - Passere oprenset octamer gennem Ni-NTA under anvendelse af en strømningshastighed på 1 ml / min.
- Saml gennemstrømning og opbevare prøver til SDS-PAGE / WB analyse (20 pi og 4 uL, henholdsvis). Derefter vaskes søjlen med 10 CV af genfoldning buffer eller indtil en baseline signal er nået.
- Eluer med 10 CV af genfoldningspuffer indeholdende 250 mM imidazol under anvendelse af en strømningshastighed på 1 ml / minut. Holde prøver til SDS-PAGE / WB analyse (20 pi og 4 uL, henholdsvis).
- Ækvilibrer en 1 ml affinitetssøjle af acommercial streptavidin (tabel of Materials) med 10 CV refoldningsbuffer indeholdende 250 mM imidazol ved hjælp af en batch / tyngdekraft flow setup.
BEMÆRK: Denne kromatografiske trin skal udføres i det kolde rum. - Pass Ni-NTA eluering gennem den kommercielle streptavidin affinitetssøjlen.
- Indsamle gennemstrømning og opbevare prøver til SDS-PAGE / WB analyse (20 pi og 4 uL, henholdsvis). Efterfølgende vask med 10 CV af genfoldningspuffer.
- Eluer med 10 CV af genfoldningspuffer indeholdende 2,5 mM desthiobiotin. Hold prøver til SDS-PAGE / WB-analyse (20 og 4 uL henholdsvis).
- Mål octamer koncentration tilsættes 10 gange mindre TEV-protease og lad reaktionen forløbe natten over ved 4 ° C i en standard plastik centrifugerør.
BEMÆRK: Den nødvendige mængde af TEV at opnå fuldstændig fordøjelse (fjernelse af affinitetsmærkerne) afhænger af oprindelse (konstruere), og på aktiviteten (frisklavede, rekombinant TEV er mereaktiv sammenlignet med den opbevares i længere perioder ved - 80 ° C). Prøv i første omgang tilføje 10 gange mindre TEV forhold til octamer (anslået som proteinkoncentrationer) og justere i overensstemmelse hermed. - Check for effektiv fordøjelse ved at køre 20 pi forudgående blandingen, og efter TEV tilsætning på en 18% SDS-PAGE-gel. Hvis fordøjelsen ikke er fuldstændig, tilsættes mere TEV protease og fortsætte inkubation i en anden 3-4 timer.
- Dialyseres prøven mod refoldningsbuffer anvendelse af en 50 kDa-cutoff dialyse membran for at fjerne TEV protease og justere bufferen sammensætning.
- Koncentrer den oprensede asymmetrisk octamer anvendelse af en 10 kDa-afskæring centrifugalfilterenhed (samme filterenhed fra trin 1.1.7 kan også bruges) til et volumen på 1,0-2,0 ml. Mål slutkoncentration. Brug enten snart efter til nukleosom rekonstitution eller justere til 50% (v / v) glycerol til opbevares ved -20 ° C i længere perioder. På dette tidspunkt, og forventer mindst 70% tab i løbet af de foregående trin, the octamer koncentration bør ligge i området på 20 - 50uM.
- nukleosom rekonstituering
- Hvis octamer blev opbevaret i 50% glycerol, dialyse natten over ved 4 ° C mod refoldningsbuffer før man går videre med nukleosom rekonstitution.
- Juster DNA (indeholdende en nukleosom-positionering sekvens) saltkoncentration til 2 M NaCl ved anvendelse af en 5 M NaCl stamopløsning.
BEMÆRK: Det oprensede DNA enten isoleret efter oprensning af et plasmid, der indeholder flere kopier af den ønskede sekvens eller syntetiseres ved PCR-amplifikation skal opbevares koncentreret til ~ 50 um i vand eller en standard Tris-EDTA-buffer. - Bland octamer og DNA under anvendelse af optimale forhold bestemt ud fra en lille test. Brug refoldningsbuffer at det endelige rumfang justeres til ~ 3,0 ml. Altid tilføje octameren sidste til at forhindre enhver mulighed for at blande octamer og DNA ved <2 M saltkoncentrationer.
- Udfør indledende small-scale rekonstitutioner at bestemme octamer: DNA-forhold, der fører til optimale nucleosomstørrelse udbytter. For dette, samle tre reaktioner af 0,9: 1,0, 1,0: 1,0, og 1,1: 1,0 DNA: octamer nøgletal i et volumen mellem 50-100 uL. Typisk brug en koncentration på 5 uM DNA.
- Fortsæt med rekonstituering som beskrevet nedenfor (trin 1.2.4-1.2.8) og i slutningen, vurdere mængden af opløseligt og god kvalitet rekonstitueret nukleosom ved måling af DNA-koncentration ved 260 nm og ved at køre en 6% nativ PAGE DNA gel , farvet med ethidiumbromid, henholdsvis (figur 5A).
- Overfør blandingen til en 6 kDa-cutoff dialyse membran og dialyseres mod 1 liter refoldningsbuffer natten over ved 4 ° C.
- Reducere koncentrationen af dialysebufferen salt i en trinvis måde fra 2 til 0,85, 0,64 og 0,2 M NaCl hhv. Holde prøven i hver puffer i mindst 3 timer. Undertiden bundfald efter den sidste overgang. I dette tilfælde continue dialyse som planlagt, og fjern bundfald ved mikrofuge centrifugering ved slutningen af det næste trin.
- Transfer dialysemembran i et bægerglas med 1 I assaybuffer (25 mM NaH 2 PO4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) og fortsætte dialyse O / N ved 4 ° C.
- Indsamle prøven, fjerne eventuelt bundfald dannet i trin 1.2.5 ved centrifugering i en mikrofuge i 5 minutter ved 4 ° C på maksimal hastighed og koncentrere anvendelse af en 30 kDa-afskæring centrifugalfilterenhed til et endeligt volumen på ~ 300 pi.
- Måling af DNA-koncentration ved 260 nm, køre en 18% SDS-PAGE proteingel (4 pi prøve) og en 6% nativ PAGE DNA gel (0,2 pi prøve) og opbevare prøven ved 4 ° C i adskillige uger. Slutkoncentrationen bør være i intervallet 10-20 uM.
2. NMR Analyse af Ændring Reaktioner på de to søster Histoner
BEMÆRK: Tildeling af2D 1 H- 15 N korrelation spektre af nukleosomale histon haler kan findes på referencer 16, 17, 18. Derudover tildelinger af CH x grupper af lysiner, seriner og threoniner på 2D 1 H- 13C korrelation spektre kan findes på henvisning 16.
- NMR opsætning og registrering af henvisning spektre
BEMÆRK: Enzymatiske assays blev udført under anvendelse 140 pi af nukleosom prøve i assaypuffer i en 3-mm NMR-rør ved 300 K. Forskellige NMR rør med andre prøvevolumener kan også anvendes. Den førnævnte temperatur er hensigtsmæssigt at opnå god kvalitet 1H 15N korrelationsspektre af nukleosomale histon haler og gode enzymatiske aktiviteter. 2D-SOFAST-HMQC 1 H- 15 N og 2D-HSQC 1H 13C-spektre blev registreret med henholdsvis en opsætning that giver tilsvarende erhvervelse tider. Typiske erhvervelse parametre er 128 transienter med 1.024 (1H) x 128 (15 N) komplekspunkter og 32 transienter med 1.024 (1H) x 64 (13C) komplekse point for de to forskellige typer af korrelationsspektre. For både 2D spektre, erhvervelse gang var ~ 30 min.- Sæt 300 K som prøve temperaturen i spektrometer. Tilsæt 10% D2O (v / v) til prøven, der skal anvendes til spektrometer frekvens lås.
- Anbring prøven i spektrometer og udføre grundlæggende operationer (låsning, tuning, afstandsstykker). Derudover bestemme optimale puls længder og generelle parametre erhvervelse.
- Optag 1D og 2D 1 H- 15 N og 1H-13C referencespektrer.
- Proces referencespektrer og sikre, at de signaler, der skal anvendes til kortlægning af modifikationsreaktioner er godt opløst og har gode intensiteter.
- Gendan prøve og overføre jegt til et mikrofugerør.
- Opsætning af den enzymatiske reaktion, NMR overvågning og kvantitativ analyse
- Kopier og arrangere en række sammenflettede 2D 1 H- 15 N og 1H-13C-spektre. Målet for en total overtagelse tid på flere timer og justere i overensstemmelse hermed i en ny kørsel baseret på de enzymatiske satser opnået fra den første reaktion.
- Der tilsættes de nødvendige cofaktorer for den pågældende type modifikation reaktion (1 mM ATP / 2 mM MgCl2 for phosphorylering, 1 mM acetyl-CoA for acetylering, 1 mM SAM for methylering, osv.).
- Tilføj enzymet af interesse, bland ved pipettering, overføre prøven tilbage i NMR rør og senere i spektrometer (udføre disse operationer hurtigt).
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen data om den forventede enzymaktivitet, justere substrat-til-enzym molforhold til 10: 1. Udfør en første prøvekørsel og justere i overensstemmelse hermed forden virkelige løb. - Udfør en hurtig automatisk afstandsstykker og bruge resten af parametrene fra henvisningen spektre.
- Indled serien af den indskudte 2D 1 H- 15 N og 1 H 13C-spektre.
- Følg udviklingen af reaktionen i realtid og stoppe erhvervelse når reaktionen når færdiggørelse eller et ønsket niveau.
- Proces spektre som før med nøjagtig de samme parametre.
- Gentage hele styres af en anden erhvervelse For at de to typer af korrelationsspektre. Hvis en 1H-15N korrelation i det første eksperiment var første i serien, starte nu med en 1H-13C korrelation. Med dette og med samme erhvervelse tid for begge spektre, er det muligt at plotte og sammenligne PTM reaktioner på begge differentielt isotopmærkede histoner på samme tidsskala. Desuden er det muligt at beregne gennemsnit og plot fejlsøjler.
BEMÆRK: En thorough beskrivelse af metoder til NMR signal analyse og efterfølgende kvantificering af enzymatiske reaktioner kan findes her 19. - Vælg NMR signaler fra hver tidsforløbet NMR-spektrum, der rapporterer progressionen af reaktionen og beregne deres relative signalintensiteter bruger visualisering og analyse software til NMR-spektre. Gør dette for signaler, der rapporterer den umodificerede samt den ændrede tilstand. Uddrag modifikation niveauer.
- Plotte beregnede værdier af ændringsniveauer mod reaktionstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt genfoldede octamere arter isoleres efter en kørsel af rekonstituering blandingen gennem en gelfiltreringssøjle (figur 2). Det rekonstituerede octamere pool indeholdende de tre forskellige typer af octamerer underkastes tandem affinitetsoprensning ordning. Der udtages prøver fra alle de trin og analyseret ved SDS-PAGE og efterfølgende WB. Kontrol af den korrekte udførelse af den protokol, der resulterer i isoleringen af asymmetriske arter opnås ved at følge tilstedeværelsen af de to affinitet tags (His og Strep-) i de forskellige prøver (figur 3). Efterfølgende affinitetsmærker fjernet efter TEV protease-fordøjelse (figur 4). Asymmetrisk oktamerer afhændede affinitet tags bruges til at rekonstruere asymmetriske nukleosomer. Til at begynde med en lille test-skala rekonstituering anvendes til at bestemme det optimale molære forhold af DNA: octamer som resulterer i et højtudbytte dannelse af en monodispers kompleks. Efterfølgende optimeret blandingsforhold anvendes til at rekonstituere nukleosomer i stor målestok. Nukleosom rekonstitutioner analyseres ved protein / DNA-geler og NMR-spektroskopi for en korrekt montering og tilstedeværelsen af de differentielt isotopmærkede søster H3 histoner (figur 5). En ansøgning eksempel er vist i figur 6. Især differentielt isotopmærket og asymmetrisk phosphorylerede på H3S10 nukleosomer omsættes med Gcn5 acetyltransferase, og acetylering af H3K14 på begge H3 kopier følges i realtid ved NMR-spektroskopi. Analysen afslører, at H3S10 fosforylering stimulerer H3K14 acetylering af Gcn5 i cis i forhold til i trans.
Figur 1: Flowdiagram til fremstilling af differentielt Isotope-labeled (og Asymmetrisk ændret) nucleosomer. (A) Rekonstituering og tandem affinitetsoprensning af differentielt isotopmærket (og asymmetrisk modificeret) histon octamerer. (B) nukleosom rekonstitution ved at kombinere de oprensede asymmetriske octamerer og en DNA nukleosom-positionering sekvens. (C) NMR overvågning af i-cis og trans-modifikation krydstale efter blanding af asymmetrisk modificerede og differentielt isotopmærkede nukleosomer med histon-modificerende enzymer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Rekonstituering af Histon oktamerer. En gelfiltrering elueringsprofil af genfoldet histon blandingen. Den største top ved ~ 70 ml svarer til histon octamerer. En 14 - 20% gradient SDS-PAGE-gel (Coomassie Blue-farvning) af eluerede fraktioner svarende til toppen octamer viser korrekt histon støkiometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Oprensning af Asymmetriske Histon octamerer. 14-20% gradient SDS-PAGE-gel (Coomassie farvning) og WB mod histo- og Strep- affinitet tags af prøver fra de forskellige stadier i tandem affinitetsoprensning ordningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fjernelse af Affinity tags. 18% SDS-PAGE-gel (Coomassie-farvning) af oprensede asymmetrisk histon octamerer før og efter blanding med TEV protease. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Biokemisk og NMR karakterisering af differentielt isotopmærket nucleosomer. (A) 6% nativ PAGE DNA gel (ethidiumbromidfarvning) af en lille prøve målestok nukleosom rekonstitution under anvendelse af forskellige molære forhold af DNA: octamer (venstre). 6% nativ PAGE DNA gel (ethidiumbromidfarvning) af en storstilet nukleosom rekonstitution hjælp af optimerede DNA: octamer molforholdet (højre). (B) 18% SDS-PAGE-protein gel (Coomassie-farvning) af rekonstituerede nukleosomer viser den korrekte støkiometri af de fire kernehistoner. (C) 1H-15N SOFAST-HMQC-spektrum af 15N-mærket H3 kopi af differentielt isotopmærkede nukleosomer (kun H3 tail rester er synlige - proteinkernen er usynlig på grund af den langsomme tumbling rate). (D) 1H-13C HSQC-spektrum af 13 C-mærket H3 kopi af differentielt isotopmærkede nukleosomer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: NMR Overvågning af In cis- og I trans Ændring Cross-talk pålagt af Asymmetrisk Phosphorylering af H3S10 på H3K14 Acetylering Aktivitet af Gcn5 acetyltransferase. (A) Skematisk gengivelse af forskelligt isotop-mærket og asymmetrisk fosforyleret på H3S10 nukleosomer reagerede med Gcn5 acetyltransferase og H3K14 acetylering kortlægning, i cis og trans. (B) 1H-15N SOFAST-HMQC og 1H-13C-HSQC-spektre (udvalgte regioner) af de asymmetriske nucleosomer før og efter reaktion med Gcn5. (C) Time-løst NMR overvågning af H3K14 acetylering af Gcn5 på asymmetrisk H3S10 phosphorylerede nukleosomer. Gennemsnittene og variation (fejl barer) fra to uafhængige forsøg er vist. Gengivet med tilladelse 16. Klik her for at se en større udgave afdette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For nukleosom rekonstitution den nuværende protokol anvender en 165 bp lang DNA-skabelon, der indeholder 601-Widom nukleosom positionering sekvens 20, men lignende ydeevne forventes ved hjælp af forskellige længder af DNA-skabeloner. Protokollen er designet og ansat ved hjælp af asymmetriske former for histon H3. Med det samme princip, kan metoden også anvendes for de øvrige centrale histoner og derudover kan bruges til at rekonstituere komplekser bærer to forskellige centrale histoner med forskellige isotop etiketter. Protokollen kan også ændret en smule i første omgang at rekonstituere histon sub-komplekser og ikke direkte histon oktamerer. Efter denne ændring, kan asymmetriske H3-H4 tetramerer rekonstitueres ved at anvende samme tandem rensning ordning. Sidstnævnte er blandet med separat rekonstituerede H2A-H2B dimerer og DNA til at samle nukleosomer 16. De endelige udbytter og de samlede resultater af den modificerede protocol ligner den oprindelige.
Protokollen er stærkt afhængig af evnen hos de to affinitetssøjler til effektivt at binde de relevante arter og dermed til opnåelse ved udgangen yderst rene asymmetriske komplekser. Det er besværligt at yde direkte og konkret bevis på, at den endelige rensede kompleks er faktisk og kun asymmetrisk. Men WB analyser af prøver fra alle oprensningstrin med de relevante antistoffer giver pålidelige indikationer for succes tandem rensning ordningen (figur 3). De samme resultater og dermed yderligere beroligelse, blev opnået ved at analysere de samme prøver for tilstedeværelsen af affinitetsmærkerne ved NMR-metoder 16. Still, hvis WB analyse viser forurening af asymmetriske arter med symmetriske dem, en lille variation kan vedtages på det første rensning trin (Ni-NTA), der kan forbedre resultatet. Især i stedet for en isokratisk eluering, en imidazol gradien t eluering (10-250 mM) anvendes, og derefter, kun de første elueringsfraktioner, som er stærkt beriget med de asymmetriske arter samles og køres gennem affinitetssøjlen. Dette kan vurderes ved WB analyse af elueringsfraktionerne for tilstedeværelsen af strep affinitetsmærket.
Udvælgelsen af isotopen-etiket i forhold til PTM af interesse er temmelig fleksibel fordi for de fleste tilfælde, NMR er i stand til at kortlægge den samme PTM anvendelse af både 1 H- 15 N og 1 H- 13 Ccorrelation spektre. For visse aminosyrer, som lysiner, det kemiske skift dispersion til sidekæden 1H 13C resonanser er ret begrænset. Derudover, når målstederne af en lysin-modificerende enzym er ukendte, stedspecifik udlæsning af lysin PTMS er ikke ligetil. I disse tilfælde alternative fremgangsmåder anvender site-selektive 13C-mærkning, kombineret med semisyntetisk histon produktion"> 21 eller anvendelse af nyoprettede NMR impulssekvenser der muliggør specifik påvisning af modifikationstilstande gennem selektiv excitation rutiner 22. NMR-spektroskopi giver temmelig lav følsomhed. I denne henseende er relativt høje mængder af nukleosomer (um) nødvendig for at udføre enzymatiske reaktioner. Dette forhindrer udviklingen af metoden til en høj-throughput setup.
Samtidig er der indført en ny kemisk metode til syntese af kemisk rene, asymmetrisk modificerede nukleosomer, med høje udbytter, transporterer defineret PTMS 23. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt i kombination med fluorografi, at studere PTM crosstalk mekanismer. Grund af den lave opløsning evne fluorographic metoder i påvisning PTMS blev konklusioner udledes indirekte ved at sammenligne den samlede enzymatiske aktiviteter på et sæt nukleosomer bærer forskellige kombinationer af symmetriske og asymmetriske PTMS, snarereend ved direkte observation af PTM reaktioner på de tilsvarende steder på hver søster histon. inkorporering af isotopmærkede histoner og anvendelsen af NMR-spektroskopi for PTM udlæsning, kan dog udgøre den førnævnte fremgangsmåde et supplerende værktøj for høj opløsning PTM analyse af asymmetrisk modificerede nukleosomer.
I forbindelse med identifikation af nye typer af asymmetrisk modificerede nukleosomer i fremtiden, sigter den nuværende metode til at udgøre en høj opløsning værktøj til analyse i cis og trans PTM krydstale reaktioner på nukleosomale substrater. Især af stor betydning er afkodning af krydstale mekanismer, der giver anledning til bivalente nukleosomer 24, der indeholder asymmetrisk begge til transkriptionelt aktive og undertrykkende PTMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatteren takker Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) for at levere wet-lab plads og infrastruktur til at udføre eksperimenter og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) til finansiering af arbejde gennem en forskningsbevilling (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
