Summary
マイクロタイタープレートからの培地の不均一な損失は、均一な多細胞腫瘍スフェロイド形成の再現性に影響を与えます。重要な媒体の損失を低減するために培養条件を改善するスフェロイド形成の再現性及び液体オーバーレイ技術を使用して回転楕円体に基づくアッセイの結果を改善します。
Abstract
密接にインビボ条件で模倣する腫瘍モデルは、潜在的な抗癌薬のスクリーニングのための薬物発見および開発にますます普及しつつあります。多腫瘍スフェロイド（MCTSes）を効果的にリード最適化および標的バリデーションのためのインビトロモデルにおけるそれらの優れた製造、固形腫瘍の生理学的条件を模倣します。 MCTS培養のための利用可能な様々な技術のうち、アガロース上に液体オーバーレイ方式は、MCTSの世代のための最も安価な方法の一つです。しかし、ハイスループットスクリーニングのための液体オーバーレイを使用してMCTS培養の信頼できる転送をアガロースウェルにわたって均一MCTS形成の非再現性を有するマイクロタイタープレート（MPS）のコーティングを含む多くの制限によって妥協されてもよいです。国会議員は、薬物のためのプレート全体の使用を防止する、プレートの外部から媒体の過度の蒸発に起因するエッジ効果に有意傾向がありますテスト。この原稿は、均一なMCTS形成の拡張性と再現性を高めるために液体オーバーレイ技術に詳細な技術改良を提供します。薬物治療が提示された後に加えて、MCTSの評価のためのシンプルな、半自動、および普遍的に適用するソフトウェア・ツールの詳細については備えています。
Introduction
腫瘍中の癌細胞は、生理学的に細胞外マトリックスと相互作用する細胞に囲ま複雑な3次元（3D）構造に配置されています。ほぼ組織内のすべてのセルは、3D環境内に存在する、より生理学的に関連する腫瘍の特性を模倣するインビトロ腫瘍モデルでの必要性は、いくつかの3次元培養技術1、2、3の開発をもたらしました。これらのモデルは、現在、3D 2の治療薬への転移および細胞応答に腫瘍微小環境の役割を研究するための基礎的な研究ツールになってきています。また、2次元（2D）細胞培養物4と比較して、3Dモデルは、細胞シグナル伝達経路に影響を与える、腫瘍-間質相互作用のよりよい理解を可能にします。
癌細胞株の多腫瘍スフェロイド（MCTSes）は、しばしば、3DセルCで使用されていますin vivoでの腫瘍に対するそれらの相対的な近さに起因するultureモデル。使用中のいくつかの技術のうち、アガロースでコーティングされたプレート上でMCTS生成の液体オーバーレイ技術（LOT）は、リード最適化とターゲットバリデーション5、6、7、8、9、10、11のために大きな関心を集めています。これが成功しLOT 6、7を使用してMCTS培養における化合物ライブラリーのパイロットの画面を実行することができました最近の研究から明らかです。しかし、媒体の蒸発によって誘導される不均一な損失にMCTSの形態と成長のウェル間の変動は、マイクロタイタープレートを使用して、LOT（MPS）を伴う一般的なハードルがあります。その結果、不均一なMCTSesの形成は有意との関連性を損ないます薬理学的アッセイ8、12、13からのデータ。自動液体分注装置を使用する際の再現性の問題に加えて、LOTベースのハイスループットアッセイに影響を与える別の実用的な問題は、アガロースでMPのコーティングです。分配ユニットは、アガロースのゲル化を防ぐために加熱保持することができるが、分注カセットおよび管の目詰まりは、ロボットシステム6のための潜在的な問題です。
これらの課題のいくつかを克服するために、我々は最近、MCTS文化8用のLOTでいくつかの変更を考案しました。これらの修飾は、主に一般的ハイスループットスクリーニング実験室で発見された機器を用いたMPから不均一媒体の損失を防止することができる方法に基づいています。 3に均一なサイズで再現性のMCTSesの世代のために修正されたLOTの詳細な手順84ウェルプレート（WPS）は、ここに提示されています。原稿は、特に断面積の測定のために明確に定義された境界を持っていない、部分的に崩壊し、薬剤処理MCTSesで、MCTSサイズの評価のための半自動化ルーチンを示しています。
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Protocol
アガロースでコーティングされたプレートの調製
- 低融点アガロースの0.75グラムを計量し、血清を含まない（フェノールレッドの有無にかかわらず）マッコイ5A培地の100ミリリットルに追加します。電子レンジ内の溶液を加熱し、完全にアガロースを溶解するために、すべての1-2分を旋回。それを殺菌するための解決策をオートクレーブ。
- 約70℃にアガロースオートクレーブし冷却し、層流ボックス内の真空濾過により500ミリリットル、0.22μmのフィルター上部からそれをフィルタリングします。一度に全体のソリューションを使用していない場合はより小さなボリュームに0.75％フィルタリングアガロース溶液（FAS）を等分。低温室または4週間まで4℃の冷蔵庫で、このすぐに使用アガロース溶液を無菌的に保管してください。
- 70％エタノール（エタノール）でカセットコンビ試薬ディスペンサーとプライムにplastic-または金属傾け調剤カセットで小さなチューブを取り付け、その後、フローボックス内の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で。
- 使用前に、FAS私の保存されたアリコートを加熱 nは、マイクロ波は、溶融しました。総理アガロース溶液とコート384ウェル、組織培養（TC）との分注カセットは、FASの15μLとマイクロプレート「特別な」 - 処置しました。プレート内のアガロースは細胞を播種する前に、15〜20分間冷却してください。低温室で、または4℃、直射光からポリエチレン袋に包まれ、無菌的にアガロースコーティングしたプレートを保管してください。
注：原液中のアガロースの濃度の変化を防止するために、0.75％FASの繰り返し加熱を避けてください。上記の条件で保存した場合、アガロースでコーティングされたプレートは、最長2週間保存することができます。 FASは、プレートのコーティング時の加熱を必要としません。 - カセットのヒントやチューブに残っているアガロースを除去するために、70〜80℃の滅菌水でそれをプライミングすることにより、分注カセットをきれいにしてください。
2.細胞培養およびMCTSの形成
- 培養ヒト結腸直腸癌HCT116細胞を、前述のように小娘= "外部参照"> 8。
- アガロースでコーティングされたの必要数を削除し、384ウェル、冷蔵保存からマイクロTC処理し、15分間室温（RT）にそれらを平衡化。
- 70％エタノールと滅菌PBSで標準管分配カセットをプライミングすることによって、細胞播種のためのコンビ試薬ディスペンサーを準備します。ディスペンサーの手動設定ボタンを使用して、メディアに必要μLに播種量と分注速度を調整します。
注記：全細胞播種プロセスは、無菌条件下で層流ボックス内で行われます。 - 組換え細胞解離酵素を用いて組織培養フラスコから接着細胞を解離します。完全増殖培地50μL中ウェル当たり2.5×10 4細胞/ mlの密度でシード細胞と無菌ビーカー中の細胞懸濁液のストックを作ります。複数の384-WPを播種する際、ビーカーの底に沈降するのを防ぐために、マグネチックスターラーを用いて細胞をかき混ぜます。
- 許可しますプレートを室温で30分間休憩した後、4×gで15分間遠心分離します。
- 一方、蒸発還元環境蓋を取り、短辺中の滅菌H 8mLの2 Oまたは5％のジメチルスルホキシド（DMSO）で塗りつぶし5mLのピペット（ 図1A）を使用して（左および右）。まず、ゆっくりと上下にピペットチップを掃引することにより、左側の谷に液体を充填4mLのを分配します。右側の谷で、この手順を繰り返します。
注：サイドトラフに追加された液体は、蓋の中央部で合流し、ガス交換（ 図1A）のためのギャップを残さないことを確認してください。蓋の外部にH 2 Oの浸透2 O結果Hの過剰量を添加し、続いて384ウェルTCプレートの外側のウェルに。 - （ 図2Aを滅菌H 2 Oで384ウェルTCプレートの液溜りを記入し、液体充填環境蓋との定期的なプレートの蓋を交換）。
- 湿度95％、5％CO 2及び20％O 2、37℃のロータリーインキュベーターにプレートを置き、そして細胞を4日間MCTSesに凝集することを可能にします。突然落下湿度レベルを防ぐために、後続の日には長すぎるためのインキュベーターの扉を開けないでください。
3.培地交換ロボットシステムを使用して
- MCTSの形成後4日目に、よく自動化されたマイクロプレートウォッシャーディスペンサーを使用して、あたり予め温め媒体の30μLを追加します。 MCTSesは、さらに3日間増殖することを可能にします。彼らは実験のために希望のサイズを達成するまで、定期的に3日ごとに培地を交換してください。
- 各ウェルから培地の定義されたボリュームを吸引するために、経験的にワッシャーマニホールドのz -heightを調整します。ウェルあたり培地を吸引30μL、新鮮な、予め温めた培地を30μLと交換してください。
注：ディスペンシング速度を設定し、ワッシャーマニホールドがダウンして移動する速度最低速度でのウェルにウェル内の乱流を最小限に抑えることができます。
4. MCTSの高コンテンツイメージングと半自動画像解析
- 画像4X空気対物レンズを用いた高含量の自動画像化システムにおけるMCTS（NA 16）。
- 4×4に11ミリ秒とビニングに露光時間を設定して実験のために所望のようにウェル当たり全体MCTSをキャプチャするために数と間隔のz -stacksのとピクセルビニングを調整します。
- プログラミング言語で記述され、社内のルーチンを使用して "は、Readme」に記載されているように、画像を段階的に処理します。
注：.mファイルコード.txtのreadmeファイルには、補助コードファイル（ 図1B）として入手可能です。ルーチン対策2D画像からMCTS面積、長軸と短軸、周囲、および堅牢。
図1：環境蓋の調製と半自動ルーチンのフローチャート。正しい（左）および過剰の液体を充填する（右）の量（ここでは、5％DMSO）で充填された蒸発還元環境蓋の（A）画像。矢印は、液体を追加するための短辺のトラフを示します。アスタリスクは、DMSOの正しいボリュームの添加後、蓋の中央にあるギャップを示しています。 （B）半自動画像解析ルーチンに必要な手順を示すワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
特に、周辺井戸からの媒体の不均一な損失は、小さな培養容量を持つ国会議員で頻繁に遭遇する問題です。このような、よく制御された温度/加湿システムと蒸発低減国会議員とプレートの蓋付きインキュベーターと実質的に改善された培養条件は、井戸8を横切る媒体の重大な損失を低減します。相対蒸発を測定するために、オレンジG（OG）の等容積を各ウェルに添加し、3日間のOGの吸光度の変化は、標準、ロータリーインキュベーターで定期的かつ環境ふたを有するプレートに記録しました。プレートウェルプレート（ 図2A）の端からの距離に基づいて6つのグループに分けました。グループ1-4では、標準のインキュベータ（ 図2B）で定期的にふたを有するプレートの経時OGの吸光度に大きな変化がありました。 OGの吸光度の変化からもありましたが、グループ環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせ（ 図2C）の下のプレート中の1ウェルは、変動係数（CVが）標準インキュベータ（ 図2D）での定期的な蓋つきのプレートに比べてはるかに低かったです。
媒体の蒸発によって誘導される不均一な損失は、国会議員8でMCTSサイズおよびアッセイ読み出しにおけるウェル間の変動の潜在的な理由の一つです。しかしながら、環境蓋/ロータリーインキュベーターの組み合わせで384ウェルTCプレートウェルの6つの群（ 図2E）にわたって均一MCTSesの形成をもたらしました。これとは対照的に、定期的な蓋/標準インキュベーターの組み合わせを有するプレートでMCTSesは、大きさや堅（ 図3F）で大幅に変化します。ソリディティはMCTSの真球度の尺度であり、MCTSの崩壊の度合いを与えます。 2D領域の堅牢性は、共同での画素の割合でありますnvex関心領域（ROI）の船体およびROIの凸包の面積によりROIの領域を分割することによって決定されます。円形や楕円両領域1の堅さを持っている、とMCTSは崩壊として、堅牢は減少します。面積の差は、既にダスらに報告されています。 （2016年）8。ボリュームはMCTSesの長軸と短軸から計算しました。
図2：増加MCTS再現性の最小限の蒸発結果にプレート。 （A）のプレートマップは6グループに井戸の区分を示すために提示されています。 （BおよびC）正規の蓋（B）と標準的なインキュベーターで培養プレート内のグループ1-4のウェルからOGの相対的な吸光度の大幅な時間依存性のばらつきがあり、グループ1、私たちからロータリーインキュベーター（C）の環境ふたを有するプレートでLLS。日3-5 OGの吸光度は、0日目（D）に正規化グループのOGの吸光度のCVの日3-5から1ウェルが2板蓋/インキュベーターの組み合わせのために示されているが平均化されます。 CVが3つの独立した実験の平均です。環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせでプレートに形成された（E）MCTSesウェルの6グループ間で有意差は認められませんでした。 （B）ただし、標準のインキュベータ内で定期的にふたを有するプレートは、可変サイズのMCTSesが形成されました。データは1群につきn>は60 MCTSesのために示されています。箱と箱ひげ図でボックス内の水平バーは、それぞれ、25 番目と75 番目のパーセンタイル値と中央値を表します。ウィスカは5 番目と95 番目のパーセンタイルを表し、外れ値は、箱ひげ図で整列黒丸で示されています。クラスカル・ワリス分析のp値は、EACの下に提示されます時間箱ひげ図。データは、プレート蓋/インキュベーターの組み合わせごとに少なくとも3つの独立した実験からのものです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ルーチンの適用可能性を判断するには、7日齢MCTSesは、3つの異なる濃度でパクリタキセル（PTX）、ビンクリスチン（VCR）、オキサリプラチン（OXA）、ドキソルビシン（DOX）、および5-フルオロウラシル（5-FU）で処理しました4日間。薬は大学病院オロモウツ、パラツキー大学から入手しました。 MCTSの画像は分析された、面積、長軸と短軸、周囲、および処理されたMCTSesの堅牢性は、対照（CTL）を比較しました。長軸と短軸は、幾何学的体積を計算するために使用しました。薬物治療（ 図3）後の濃度依存性のMCTS面積の減少とボリュームがありました。 0.001 / mlのVが、CRおよび0.4 / mlのDOXおよび5-FUは、MCTS面積の増大をもたらし、体積が大きく0.001 / mlのVCR以下だけ増加しました。 MCTSの周囲にのみ完全にMCTSのサイズに影響を与えPTX、DOX、及び5-FUの最高濃度で有意差がありました。 PTXおよび0.25μgの/ mLおよび0.06μgの/ mLおよびDOXおよび100μg/ mLの5-FUでVCRがMCTSes（ 図3）の完全な対の部分的崩壊を示し、堅牢性の有意な減少をもたらしました。
図3：半自動化ルーチンによってMCTSesにおける薬物効果の測定。 CTLおよび薬物処理MCTSesの（A）の画像が提示されています。 =10μmのスケールバー。 / mlの中の濃度は、画像ごとに与えられています。 （B）棒グラフは、上のPTX、VCR、OXA、DOX、5-FUの用量依存効果を示します地域と治療の4日後7日齢MCTSesのボリューム。 MCTSの周囲はかなりの0.25μg/ mLのPTXおよび100μg/ mLのDOXと5-FU以下に減少しました。 MCTSesの完全なツー部分的崩壊をもたらした薬物濃度が有意CTLに比べMCTSの堅牢性を減少させました。データは3つの独立したプレートから少なくとも5 MCTSesの平均±SDです。 * P <0.001、＃の P <0.01、φて p <0.05 CTL対薬物処理、Dunnettの多重比較検定で一方向ANOVA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
フィルタリングされたアガロースで384ウェルTCプレートをコーティング
LOTにおける標準的技法を被覆するアガロース、アガロースを必要とする、及び/又は分配ユニットは、アガロース6のゲル化を防ぐために加熱保持するプレートを1〜1.5％の低融点を使用することです。直径が0.2〜0.4ミリメートルの範囲の小さなチューブ開口を有する液体分注カセットを使用して複数のプレートを準備している間、アガロースのゲル化は、潜在的な関心事です。それは分配中は追加の加熱を必要としないように分配するカセットを目詰まりの潜在的な問題を克服するために、0.75％FASは、使用されました。なお、それはまた、0.75％FASはとして急速に濾過されていない1〜1.5％、またはさらには0.75％アガロース溶液としてゲル化しないことが観察されました。 0.75％FASを使用して、分注カセットを詰まらせることなく被覆する35未満の全384ウェルTCプレートをとります。カセットは、残留Aを除去するために加熱された水でプライミングすると、最後に洗浄することができますカセットを使用していないときのヒントを詰まらせる可能性がgarose、。
レギュラープレート蓋とインキュベーターの上に環境蓋とロータリーインキュベーター
媒体の蒸発によって誘発される不均一な損失を大幅に均一MCTS形成の再現性に影響を及ぼし、その結果、アッセイの14の結果を損ないます。驚くべきことに、環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせの下で384ウェルTCプレートのグループ1ウェルは、OGの吸光度（ 図2C）において統計的に有意な変動を示しました。しかし、グループ1ウェル中OGの吸光度の低いCVは、環境蓋を有する回転インキュベーターで384ウェルTCプレートの外側のウェル中の蒸発がMCTSの成長（ 図2D）に影響を与えるほど過大ではないことを示しています。これは、環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせでプレートに、グループ1のウェル内に形成された均一なサイズのMCTSesから明らかです。また、損失を減少させましたメディアの環境蓋8と、回転インキュベーター中で培養384ウェルTCプレートからの薬物アッセイにおけるウェル間のばらつきを防ぐことができます。
提示された方法論はまた、いくつかの他の癌と非癌細胞株8の均一MCTSesの形成をもたらします。全ての細胞は本質的に非接着性表面上MCTSesに凝集することができないので、この方法は、多くの均一MCTS形成の再現性について試験されなかった他の細胞株には適していません。また、焦点は主にMCTS形成の再現性を高めるために、蒸発低減国会議員とプレートの蓋との組み合わせで高度な技術インキュベーターの使用にありました。 MCTS形成の再現性を高めるための別の安価で簡単な解決方法は、胚グレードの鉱物油や蒸発を防ぐ通気性シールテープまたは膜の使用であるが、通常のガス交換1の可能性があります5。アガロース高コンテンツイメージングへの障壁となることができボトムスをプレートに余分な厚さを加算したが、透過光イメージングにおけるアガロースボトムによって作成された被写界深度は、薬物治療後MCTSの大きさや形状の確認を妨げません。したがって、提示された方法は、MCTS文化のLOTで再現性の問題に直面している研究者への潜在的な対象としています。
半自動画像解析ルーチン
MCTSの画像解析のために利用可能な多くの半自動/自動化されたソフトウェアがあるが、完全な対部分崩壊MCTSes薬物治療後の大きさの測定は誤差16,17を起こしやすいです。提示ルーチンの最初のステップでは、最良焦点を合わせた画像が自動的に画像の勾配のノルムを計算し、最大0.999資格を有するものを選択することにより、Z -stack画像のセットから選択されますNTILE。これは、最大の堅牢性とノイズを区別しない尺度です。
次に、暗い境界がトリミングされ、処理された画像は、ポータブルネットワークグラフィックス形式で元の解像度で保存されています。このプロセスは、約100メガバイトに、全体を384ウェル、TC処理プレートを撮影から、2.5ギガバイトから合計サイズを削減します。その後、MCTSの中心は、ユーザー定義の半径の円形フィルターとの畳み込みを介して発見された（私たちは20ピクセルを使用; 図4A）。フィルタリングされた画像の明確な極小値は、中心（ 図4A）の位置を提供します。同心の環状部でこの中心から移動すると、中央値グレースケール値、Mは、各シェルでシェル半径の関数として計算され、R.関数M（R）の数値微分の後、最初の（実質的な）最大値であり、見つかった（ 図4B）。この最大の点MのOPTは、最適閾値として撮影し、画像は、Sでありますこのレベルで閾値処理することによってegmented。
MCTSは、画像の最大中央セグメントとして識別されます。多くの場合、薬物治療（ 図4Cおよび4D）から生じる崩壊部分からMCTSコアを分離することができるため、この手順は、通常、標準的な閾値処理技術よりも優れて動作します。また、ここで採用されたアプローチは、MCTSの球形の暗黙的に使用します。アクティブな輪郭に基づいて、単純な閾値処理ルーチン、またはアルゴリズムは、球状の物体が発見される先験的知識を悪用しないでください。 MCTSが明確に検出し、線引きされた場合、最大のM OPTは、明確かつ単一です。次いで、ルーチンは、このような領域としてMCTSの特性、長軸と短軸、周囲、そして当てはめた楕円の堅さを測定し、セグメント化された画像のプレビューを保存します。最大値は明確ではない場合、および/または複数の極大値は、事前に存在する場合提案したセグメント化の観点からは、補正フォルダに保存されます。
最後から二番目のステップでは、ルーチンは手動で上下のしきい値を移動させ、マスクの可能な冗長部分を遮断するために関心の多角形領域を選択することにより、提案したセグメンテーションを調整するための補正フォルダを介してユーザーを歩きます。この手動補正した後、ルーチン対策、上述したように、MCTS特性を保存します。
図4：画像分割手順のイラスト。 （A）MCTSの中心は緑のアスタリスクでマークされています。環の例は、赤色で描画されます。各シェルにおけるメジアン階調値（B）はシェルの半径（青線）の関数としてプロットされています。この曲線の数値誘導体（赤線）が計算されます。最初の実質的なミリアンペア数値誘導体のximumは（黒アスタリスク）を発見されました。 （C）MCTSコアおよび崩壊MCTSパーツと背景に画像の結果の正しいセグメンテーション。 （D）大津の方法によって得られる誤った区分。 4X目的。スケールバー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、チェコ教育省、青年、およびスポーツ（LO1304）、チェコ共和国の科学技術振興機構（TE01020028）からの助成金によってサポートされていました。著者は、環境蓋の静止画を撮影するための博士ラクシュマンバラナシに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
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