Summary
この作品は、ハイブリッドの β-ラクタマーゼ技術に基づく伝導度センサーを用いたタンパク質間相互作用を研究する手法を報告する.このメソッドは、β-ラクタムの加水分解時に陽子のリリースに依存しています。
Abstract
バイオ センサーは、病原体検出、分子診断、環境監視、および食品安全性の管理などさまざまな分野でますます重要かつ実装になっています。この文脈では、いくつかのタンパク質間相互作用研究の効率的なレポーター酵素と β-ラクタマーゼを使用しました。さらに、強くペプチッドまたは構造化蛋白質/ドメインの挿入を受け入れる能力はキメラ蛋白質を生成するこれらの酵素の使用を奨励しています。最近の研究ではバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼに単一ドメイン抗体フラグメントを挿入されます。Nanobodies とも呼ばれるこれらの小さなドメインは、ラクダから一本鎖抗体の抗原結合ドメインとして定義されます。共通の二重鎖抗体のよう彼らは高い親和性と特異性の目標を表示します。結果のキメラ蛋白質 β-ラクタマーゼの活性を維持しながらその目標に対して高い親和性を展示しました。機能生物学: ナノボディで、β-ラクタマーゼの鎖を維持することが示唆されました。現在の仕事では、バイオ センサー技術に当社のハイブリッド β-ラクタマーゼのシステムを組み合わせた詳細なプロトコルを報告します。生物学: ナノボディでターゲットの特定の結合は、酵素の触媒活性が発表したプロトンの伝導度測定のおかげで検出できます。
Introduction
バイオ センサー、トランスデューサー1と呼ばれる物理または化学のシグナリング デバイスと生体分子の相互作用を結合した分析機器です。記録された信号の解釈および固定化と無料のパートナー間の相互作用を監視に変換できます。グルコのほとんどは、ホルモンなど異なる病原体マーカー2検体を検出する抗体の使用を含みます。別のセンサー フォーマットは使用でき、質量ベース、磁気、光学または電気化学バイオ センサーが含まれます。後者は最も一般に使用されるセンサーとバインディング イベントを電気信号に変換することによって機能します。公演とすべて抗体を用いたバイオ センサーの感度は、本質的に 2 つのパラメーターに強く依存する: i) 抗体と ii)2の信号を生成するために使用するシステムのプロパティの品質。
抗体は 2 つの重鎖および 2 つの軽鎖から成る高分子質量二量体蛋白質 (150-160 kDa) です。光と重鎖間の相互作用を主に保存されたジスルフィド結合と同様に、疎水性相互作用によって安定させます。各チェインには、本質的に補完決定領域 (CDR1-2-3) という 3 つの超可変領域を介して抗原と相互作用変数の領域が含まれています。フィールド、大規模な低コスト式システム (例えば、エシェリヒア属大腸菌) とフルレングス抗体発現の多数の進歩にもかかわらず、しばしば不安定で集約された蛋白質の生産に 。だからこそ、さまざまな抗体フラグメント、単一鎖変数3 (ScFvs ≈ 25 kDa) の断片のように設計されてです。彼らは、それぞれ 1 つの重いと共有結合合成アミノ酸シーケンスによってリンクされている 1 つの軽鎖の可変領域で構成されます。ただし、これらのフラグメントはしばしば安定性の悪いを表示され、集計、溶剤4その疎水性領域の大きい部分を公開するために傾向があります。この中で、nanobodies または VHHs と呼ばれる、単一のチェーン ラクダ科動物抗体フラグメントは ScFvs に優れた選択肢と思われます。これらのドメインは、ラクダ科一本鎖抗体の可変領域に対応します。従来の抗体と対照をなしてラクダ科動物抗体軽鎖を欠いている、のみ 2 つの重鎖5が含まれます。したがって、nanobodies は、従来の抗体6のような親和性を持つ抗原に結合することができる最小単量体抗体フラグメント (12 kDa)。さらに、安定性の向上と他のフルレングスの抗体や抗体フラグメントと比較して溶解性を呈する。最後に、その小さなサイズと、拡張 CDR3 ループに、不可解なエピトープを認識し、酵素活性部位7、8にバインドする許可にします。今日では、これらのドメインはかなりの注目を受けているし、バイオ センサー技術に結合されています。たとえば、黄ら。検出と人間の前立腺特異抗原 (PSA)9の定量化のための生物学: ナノボディでベースのバイオ センサーを開発しました。
言及した上としてバイオ センサーの試金で重要なパラメーターは電気信号を生成するために使用するシステムの効率です。このため、酵素法による電気化学バイオ センサーはますます注目を集めている、健康管理、食品の安全性や環境モニタリングなど様々 な用途に広く使用されています。これらのバイオ センサーは、電気信号を生成する酵素による基質の触媒加水分解に依存します。この文脈では、β-ラクタマーゼより具体的より敏感とアルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ10など多くの他の酵素よりも実験的に実装する方が簡単に示されていた。Β-ラクタマーゼは β-ラクタム系抗生物質に耐性菌の責任、それらを加水分解する酵素です。彼らは、単量体、非常に安定した、効率的、かつ小さなサイズが。さらに、β-ラクタマーゼ挿入ドメイン/ペプチドはタンパク質-リガンド相互作用を研究する効率的なツールであることが示された bi 機能のキメラ蛋白質を生成します。確かに、最近の研究はその標的抗原に高い親和性と結合することができるままキメラ蛋白質 TEM1 β-ラクタマーゼ結果に変数の抗体のフラグメントをその挿入を示しています。興味深いことに、抗原結合 TEM1 触媒活性11,12のアロステリック効果を誘導するために示されました。さらに、我々 はバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼの寛容なループにタンパク質ドメイン挿入が蛋白質-リガンド相互作用13 を監視に適しています機能のキメラ蛋白質を生成するいくつかの研究で示した ,14。生物学: ナノボディで、ブッ15のこの寛容な挿入部位にという名前の cAb Lys3、最近挿入した.この生物学: ナノボディで示した鶏卵白リゾチーム (リゾチーム) にバインドする16その酵素活性を阻害します。ブッ-タクシー-Lys3 の名前生成されたハイブリッド蛋白質は高い特異性を保持/親和性リゾチーム β-ラクタマーゼ活性のまま変更しないことを示した.そして我々 は正常に β-ラクタマーゼ技術のハイブリッド電気化学バイオ センサーを組み合わせるし、生成された電気信号の量がブッ cAb Lys3 と電極に固定化したリゾチームの相互作用に依存していたことを示した。確かに、ブッによる β-ラクタム系抗生物質の加水分解は、定量的な電気信号に変換することができますプロトン放出を誘導します。このハイブリッド β-ラクタマーゼ技術電気化学バイオ センサーとの組み合わせは、高速、高感度、定量、生成された信号のリアルタイム測定が可能.この方法を次に記載します。
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Protocol
1. タンパク質サンプル調製
- 生成し、ブッ cAb Lys3 私たちの以前の研究15で報告されたハイブリッドの蛋白質を浄化します。50 mM リン酸バッファー pH 7.4 次の組成のタンパク質を格納: 塩化ナトリウム 8 g、KCl の 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、800 mL の蒸留水に溶解した KH2PO4 0.24 g 前に 7.4 に溶液の pH を修正L. フィルター 1 の解決策の最終的な音量を調整するタンパク質溶液を滅菌します。
- 鶏卵白リゾチーム (リゾチーム) 原液を準備します。リン酸バッファー生理食塩水 (PBS は、2.1.1 のステップを参照) の 10 mL の市販購入したリゾチーム (40,000 単位/mg) 100 mg を溶解します。0.22 μ m のカットオフ フィルターを用いたろ過によるタンパク質溶液を滅菌します。
2. バイオ センサーを試金します。
-
ソリューションおよびバッファーの準備
- 50 mM PBS を準備するには、8 g の NaCl、KCl の 0.2 g、Na2HPO4、1.44 g と 800 mL の蒸留水で KH2PO4 0.24 g 溶解します。1 l. フィルター滅菌し、4 ° C で保存する溶液の量を調整する前に N HCl または 1 N NaOH pH 1 7.4 に調整します。
- 100 mL の PBS は、前述のように準備にカゼイン加水分解物の 3 g を溶解することにより彩度/遮断ソリューションを準備 (2.1.1 の手順を参照してください)。フィルター滅菌し、4 ° C で保存
- 100 mL の PBS は、前述のように準備にカゼイン加水分解物の 1 g を溶解することにより結合ソリューションを準備 (2.1.1 の手順を参照してください)。フィルター滅菌し、4 ° C で保存
- 洗浄液の準備 (0.1% トゥイーン - PBS) 100 mL の PBS は、前述のように準備の Tween 20 (100%) 100 μ L の追加によって (2.1.1 の手順を参照してください)。4 ° C でのストア
- 電極の準備ソリューションを準備 (1% トリトン X-100-PBS) トリトン X-100 (100%) 1 mL を 100 mL の PBS は、前述のように準備に追加して (手順 2.1.1 参照)。4 ° C でのストア
- 最終巻の蒸留水で KCl の 26 g を溶解することにより電極再生液 (3.5 M KCl) を準備 100 mL。フィルター滅菌と 4 ° C で保存
- 蒸留水 1 l. フィルター滅菌し、4 ° C で保存の最終巻ににおける NaCl の 0.29 g を溶解することにより 5 mM の NaCl 水溶液を準備します。5 mM の NaCl 水溶液 20 mL のベンジル ペニシリンの 26.7 mg を溶解することにより検出ソリューション (4 mM ベンジル) を準備します。フィルター滅菌し、-20 ° C で保存
-
センサーの作製と再生
注: ポリアニリン被覆センサー チップを開発し、博士 p. Bogaerts、s. ユヌス博士と教授 Y. Glupczynski (カトリック大学のルーバン ・ ラ ・ ヌーブ - 朱モン Godinne) によって提供されました。これらのセンサーを合成に使用するポリアニリンの電気重合プロトコルと同様に、センサーの説明は彼らの前の仕事17で詳細に説明します。簡単に言えば、このシステムは、古典的なプリント回路基板 (PCB) の技術によって製造された 8 つの個々 のチップの再利用可能なセンサーを使用します。個々 のチップは 3 つの電極から成るスポットをラウンドします。一番上は作用電極、ポリアニリンの電気合成だった。中間の 1 つは、参照電極と下部電極が対向電極を構成します。参照とカウンター電極の両方はカーボン層の上に固体の銀/塩化銀アマルガムを使用して官能基化します。- ヒントを含む電極作製の 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルに浸すことによって電極の 3 洗浄を実行 (1% トリトン X-100-PBS を参照してくださいステップ 2.1.5。)。室温で穏やかな混合によって 2 分の各洗浄を実行します。
- 含む室温で穏やかな混合で 2 分間蒸留水 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極をすすいでください。
- 含む再生ソリューションの 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極を再生成 (3.5 M の KCl、参照 2.1.6) 4 ° C または室温で 1 h で一晩。
- 含む生理食塩水リン酸バッファー 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにヒントを浸すことによって電極の 3 洗浄を実行 (手順 2.1.1 を参照)。室温で穏やかな混合で 2 分の各洗浄を実行します。
-
センサーに対して結合の試金
- 40 μ g/mL の PBS で電極表面上に作製したリゾチームの 15 μ L のドロップを堆積することにより電極のパニ (ポリアニリン) 表面にリゾチームのコート。4 ° C または 1 時間室温で一晩インキュベートします。
- リン酸バッファー生理食塩水で電極の 3 つの洗浄を実行 (手順 2.1.1 参照) 含む生理食塩水リン酸バッファー 300 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルにセンサー チップの電極部分を浸すことによって。室温で穏やかな混合によって 2 分の各洗浄を実行します。
- ブロッキング溶液 50 μ L のドロップを追加することで、電極を飽和状態 (ステップ 2.1.2 参照) 電極表面上に。室温で 1 時間インキュベートします。洗浄 3 回、前に記載されているステップ (ステップ 2.3.2 を参照)。
- 20 μ g/ml ソリューション バインドにブッ cAb Lys3 ソリューションを希釈 (手順 2.1.3 参照) の電極上にこの希釈液 15 μ L の滴を適用し、。室温で 10 分間インキュベートします。抗原生物学: ナノボディで反応後は洗浄液を使用して前の手順で 3 回に記載されて洗浄 (2.1.4 の手順を参照してください)。PBS で一度電極をすすいで (2.1.1 の手順を参照してください)。
- 検出用センサー チップを経由してデジタル ・ マルチメータの銅回路部分を差し込みます。次に、50 μ L の滴検出ソリューションを適用することによってセンサー応答を開始 (2.1.7 のステップを参照) に、正極と負極 (2.1.7 のステップを参照) に食塩 5 mM の 50 μ L の滴を適用します。室温で 30 分間インキュベートします。デジタル ・ マルチメータとコンダクタンスを監視します。
注: マルチメータと定められた博士 p. Bogaerts、s. ユヌス博士と教授 Y. Glupczynski (カトリック大学のルーバン ・ ラ ・ ヌーブ - 朱モン Godinne。この電気化学測定装置は USB ポート経由でコンピューター制御し、センサーの 8 つの異なるチップを同時に分析します。ユヌス氏と同僚の17によって作成されたソフトウェアは、時間とリファレンスとサンプルの電極間のコンダクタンスの違いの測定を表すリアルタイム プロットを作成します。
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Representative Results
デザインとエンジニア リングのキメラ蛋白質ブッ cAb Lys3
図 1 は、バチルス リチェニホルミス由来 BalP クラス A の β-ラクタマーゼの寛容なループに cAb Lys3 の挿入を表します。残基 Asp198 と Lys199 間挿入を行った。トロンビン切断部位は、cAb Lys3 の各側に導入されました。ブッ cAb Lys3 キメラ蛋白質発現プラスミドで形質転換細胞アンピシリンの小さな濃度の存在下で成長することができた。この結果は、ハイブリッドの β-ラクタマーゼは正しく折り返されて溶ける、効率的にアンピシリンに対して抵抗を提供することができますそれ細菌のペリプラズム空間に正常に排泄できることを示します。さらに、私達のキメラ蛋白質の bifunctionality を行った。私たちの以前の研究で報告は、我々 のデータ キメラタンパク質の cAb Lys3 鎖と同様、β-ラクタマーゼが彼らの生物学的活動の15を保持を示した。
伝導度のバイオ分析
センサー チップでこの試金は図 2 に示します。これらの実験に使用されるセンサーには、8 つのチップが含まれています。各チップには、3 つの電極が含まれています: 1 つの作用電極、1 つのカウンター電極、1 つの参照電極。これらの 8 つのチップは、センサーの 4 つのペアとして構成されます。ペアごとに 1 つのチップのラベル」-「チップというラベルの付いた「+」のテスト サンプルに対応するに対し、否定的な制御に対応します。
図 3 は、電位差バイオ ハイブリッド β-ラクタマーゼ技術を組み合わせたこの作業で使用する実験装置の概略説明を表します。このセットアップでは、2 つの電極を使用: i) 参照電極と ii) (ぱ) ポリアニリン被覆電極。リゾチームは、他研究18,19で報告されたぱ被覆電極に吸着されます。ブッ cAb Lys3 十分な洗浄後 (の「+」というラベルの付いたチップ) または挿入された生物学: ナノボディでなくブッ (の"-"チップをラベル) 電極に適用されます。次の β-ラクタム (ベンジル ペニシリン) 電極の追加により、電極の電気伝導の変化が測定されます。確かに、β-ラクタマーゼによる β-ラクタム系加水分解生成陽子; のリリースこれは、非常に短い応答時間と電極の伝導度の大幅な変更を作成する示されました。図 4 バイオ センサー法を示すぱ電極に固定化したリゾチームにブッ-タクシー-lys3 の結合が検出および固定化 β-ラクタマーゼ活動から生じるプロトン放出を測定によって監視されています。対照的に、コンダクタンスの違いは見つかりませんでした任意の挿入された生物学: ナノボディでなくブッと実験を行ったとき。
図 1: リゾチームとブッ cAb Lys3 キメラタンパク質の相互作用を表す方式。ブッは、水色、オレンジの cAb Lys3 と青のリゾチームで示されます。この図は、ブッの三次元構造を組み合わせることによって得られた (PDB ID: 4BLM) と cAb-Lys3/リゾチーム複合体 (PDB ID: 1MEL)。Β-ラクタマーゼには、2 つのドメインが含まれています: 触媒部位は、両方のドメインの間のインターフェイスに位置する α/β ドメインと α ドメインの。挿入に使用されるループで、α ドメインの溶媒露出ループで黄色で強調表示されます.CAb Lys3 の N 末端と C 末端の部分は赤で表示されます。CAb Lys3 の CDR3 ループ リゾチーム触媒部位との接触のほとんどになります。リゾチームに cAB Lys3 のバインディングは、その酵素活性を阻害します。この図と記載の結果は、以前作業15公開されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 実験で使用されているセンサーの画像。各センサーには、8 つの個々 のチップのグループが含まれています。各チップに 3 つの電極があります: 1 つの作用電極、参照電極とカウンター イオン電極。銅で覆われた部分は、コンピューターに接続されたデジタルマルチメータに差し込まれています。個々 のチップは 4 つのペアとして構成されます場所、"-"ラベル付きチップは、負の制御電極と「+」ラベル付きのチップ サンプル電極。この設定により異なる実験的複製またはリゾチーム/β-ラクタマーゼ濃度同時にテストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 当社のバイオ センサーの試金で使用される実験装置の概略図。リゾチームはパニ (ポリアニリン) 被覆電極に固定化。キメラ蛋白質ブッ cAb Lys3 は電極上に適用されます。ベンジル ペニシリンの加水分解によるプロトンの放出を測定することによって決定される固定化 β-ラクタマーゼ活性はリゾチームとキメラ蛋白質間の相互作用に直接比例します。プロトン放出は、ユーザーによって解釈できる信号に変換される電気伝導度変化を誘導します。時間の関数としてコーティング パニと参照電極間観察コンダクタンス違いの進化。この図と記載の結果は、以前作業15公開されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: グラフィカル、伝導度のリゾチームにブッ cAb Lys3 の特異的相互作用を示す測定。ベンジル ペニシリンの添加は、矢印で示されます。この電位差は抗生物質の加水分解時に発生したプロトン放出に起因します。ネガティブ コントロールとしてハイブリッド タンパク質ブッ-タクシー-Lys3 (赤) となし、挿入された生物学: ナノボディで (青), ネイティブの β-ラクタマーゼ ブッ測定を行った。別のカーブは、別のチップで実行される独立した測定を表します。この図と記載の結果は、以前作業15公開されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この作品で生物学: ナノボディでキャリア蛋白質としてブッ β-ラクタマーゼを使用しての高機能化する手法を提案し、電位差センサー アッセイで、結果として得られるハイブリッド タンパク質を正常に実装できることを示します。他のバイオ センサーの試金と比較して我々 の仕事の主な技術革新の側面は、電気信号を生成する酵素活性の抗体部分の共有カップリングです。このいわゆるタンパク質挿入技術提案する利点と制限事項このセクションの主な焦点となります。
Β-ラクタマーゼのハイブリッド技術の利点。
Β-ラクタマーゼは効率的な酵素
感度とバイオ センサーの信号対雑音比に影響を与える最も重要なパラメーターの 1 つは、信号を生成するために使用する酵素活性です。このコンテキストで β-ラクタマーゼは、いくつかの利点を提示: 小 (≈29 kDa)、単量体、非常に安定した、そしてより重要なは、高の特定のアクティビティとグルコースなど電位差センサー試金で使用される他の酵素と比較して高回転を展示オキシダーゼ、ウレアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ20。これらすべての理由から、β-ラクタマーゼは、さまざまなバイオ センサーの試金のための好みの酵素です。
Β-ラクタマーゼに直接挿入は、歩留まりと挿入されたタンパク質/ドメインの安定性を向上できます。
多くの免疫アッセイの制限の側面の 1 つは2検体を検出するために使用する抗体の品質 (安定性、純度など) です。現在、抗体や抗体フラグメント (大腸菌など) の低コスト生産システムは剰し、集約されたタンパク質溶解性が悪いと安定性21があります。ハイブリッド β-ラクタマーゼ技術は、我々 は以前この戦略が式収量と挿入されたタンパク質ドメイン14の安定性を向上させることを示したので、これらの困難を克服するために良い方法のようです。特に、当社のハイブリッドの β-ラクタマーゼのシステムを使用して、本研究ではブッ cAb Lys3 というキメラ蛋白質正常に非常に良い利回り (1 リットルあたり文化の純粋な蛋白質の ≈10 mg) , 大腸菌で発現され、同質性に浄化されました。
抗体と酵素分子の共有結合は、安くて速いセンサーの試金
従来の immunosensors 試料の検出センサー チップ上に固定された、一次抗体の使用率が必要です。その後、酵素または分類されたプローブに結合する二次抗体も測定可能な信号を生成するため必要です。このアプローチは、いくつかの孵化および洗浄のステップが含まれます、そのため、時間がかかります。さらに、このプロトコルは、複数の抗体が必要と二次抗体と酵素・ プローブ間の共有カップリングも必要ですので高価です。対照的に、体制はのみハイブリッド蛋白質を使用して検出し、検体を定量化し、リアルタイム監視二次抗体を使用せずできます。
さらに、β-ラクタマーゼを示した展示アロステリックなスイッチのような振る舞い22,23ハイブリッド タンパク質を生成するクラスにそのドメイン挿入に注意してくださいすることが重要です。このようなスイッチは、バイオ センサーに基づく試金で多数のアプリケーションを見つけることができます。
ハイブリッド β-ラクタマーゼ技術の限界。
タンパク質工学による制限。
このシステムでは、主な困難は、設計および β-ラクタマーゼに抗体部分を挿入してハイブリッド タンパク質を取得します。この結果想像上蛋白質は二官能性である必要があります: 酵素部位の抗体部分バインドする必要が高い親和性と対象となる試料に対し効率的に電気信号を生成する β-ラクタム系抗生物質を加水することがまま必要があり、特異性。二官能性キメラ蛋白質を得るためには、さまざまなパラメーター立体の制約を避けるために考慮される必要があります。最初の重要なポイントは、挿入部位の位置です。複数の挿入ポイントが可能な24,25,であることが示されているが26、溶媒中での位置にある挿入は遠くから運搬体蛋白質の活性部位ループを公開しました。これは、潜在的な構造変化または挿入されたタンパク質による立体障害を最小限に抑えます。同じ理由で、挿入された蛋白質の活性部位配置されること遠く挿入部位からその活動の変化を防ぐためにそれをもお勧めします。最後に、柔軟性や近隣 N 末端と C 末端の四肢を示す蛋白質の挿入を容認しては良い。確かに、遠いと剛体の四肢はキメラ蛋白質の両方のパートナーで立体の制約を課すし、それぞれの生物学的活動をこのように変更できます。したがって、挿入された蛋白質のサイズでは、結果のキメラタンパク質の少し影響のみを言及することが重要です。確かに、それは、大規模な構造化されたドメイン正常に挿入できる β-ラクタマーゼ、その N 末端と C 末端の四肢が柔軟な限りまたはお互い13,14,2,に近いに示されています。3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. 本研究ではブッで挿入部位は活性部位から離れたで挿入された生物学: ナノボディで、比較的長くて柔軟な四肢 (x 線構造では表示されません)、超から遠くに配置されています。これらの特定の機能は、ハイブリッド蛋白質の両方のパートナーの生物学的活性表面上最小限の立体制約が適用されることを確認します。ただし、挿入されたタンパク質が運搬体蛋白質に最適な挿入するため推奨される基準を示さないとき不可能だエンジニア リンカー領域に潜在的な立体制約を下げるために。確かに、キャリアを接続する適用範囲が広いリンカー (例えばGly Ser の繰り返し) と挿入されたタンパク質の存在が大きく、構造化された蛋白質の 1 つ30 キャリア挿入への耐性を大幅に向上示されました。 ,12。
電気化学的に固有の制約バイオ センサー 。
電気化学/電位差バイオ センサーの開発は、これまで成長のフィールドになっている、これらの試金はバイオ実験を設計時に考慮する必要のある重要な制限事項をあります。最初、H+リリースまたは取り込みに関連するすべてのバイオ センサー非常に弱くバッファリングされたソリューションを使用する必要 (すなわち< 5 mM)31重要な潜在的な違いを測定するために。H+リリース時に誘起される pH 変動タンパク質プロパティと使用して信号を生成する酵素の活性に影響します。第二に、pH およびイオン強度生体できます大幅に異なる結果セットが応答で重要な変化と増加バイオ センサー32のバック グラウンド ノイズ.だからこそ、様々 な研究グループ デバイス33,の界面に発生するプロセスの信号対雑音比を高めるために電気化学センサーのエレメントのサイズを減少するナノテクノロジーを開発しようとしています。34,35です。 結果として、そのターゲット32への 1 つの分子の結合により生じる信号を増加させる同じ酵素の複数の分子の付いた抗体分子を開発することも。ただし、これらの制限にもかかわらず電導べ度/バイオ センサー検出 (Lod) 10-8 10-11 M36の範囲で推定限界と非常に効率的かつ機密性の高いデバイスのまま。
この研究では、我々 は我々 は正常に、ブッというクラス A β-ラクタマーゼにリゾチームを対象とする生物学: ナノボディでを挿入できます、生成されたハイブリッド タンパク質が両方の生物学的活性を保持することを示されている: リゾチームおよび ii) 加水する能力 i) タイトな連結Β-ラクタム系抗生物質。本研究は、ブッに様々 な nanobodies または抗体フラグメントの挿入と電位差センサー アッセイこのハイブリッド タンパク質技術の実装のためのコンセプトの証明を構成します。この技術のタンパク質のさまざまなエピトープを検出するために使用、多くの診断ツールに実装潜在的可能性があります。確かに、開発とそのような試金の有効活用私たちの社会で非常に重要になっているし、本質的に低コストの社会的・経済的ニーズによって駆動とを中心に、食と健康など様々 な分野で技術を操作しやすい発展途上国。さらに、ナノテクノロジーは、このようなセンサーの開発で増加役割を果たします。今日では、信号処理技術は、信号処理の37のスマート フォン、タブレット、異なるスマート フォンのアプリケーションが既に存在しているなどのポータブル デバイスを承ります。たとえば、最近では、グルコース濃度38を監視できるようにスマート フォンには電位差センサー デバイスを統合されています。健康の専門家は、これらの種類の革新的なデバイスが来る年39,40のより重要な健康ソリューションになると確信しています。
結論としては、この作品は、可能性と私たちの蛋白質の挿入の技術の利点を示す例を表します。我々 はこの作品を研究、医療目的に革新的で有用な技術の開発に貢献することを願っています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、SENSOTEM と NANOTIC の研究プロジェクトの枠組みの中でベルギーのワロン地域だけでなく、国家資金の科学研究 (F.R.S.-F.N.R.S) 金融支援を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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