Summary
在这项工作中, 我们报告了一个新的方法来研究蛋白质-蛋白质相互作用的电导生物传感器的基础上的混合β-酶技术。这种方法依赖于质子在β-内酰胺水解时的释放。
Abstract
生物传感器在病原检测、分子诊断、环境监测、食品安全控制等各个领域的应用越来越重要。在这方面, 我们使用β-酶作为有效的报告酶在几个蛋白质-蛋白质相互作用研究。此外, 他们接受多肽或结构蛋白/域插入的能力强烈鼓励使用这些酶产生嵌合蛋白。在最近的一项研究中, 我们在芽孢杆菌地衣BlaP β-酶中插入了一个单域抗体片段。这些小的域, 也称为 nanobodies, 被定义为骆驼单链抗体的抗原结合域。就像常见的双链抗体一样, 它们具有很高的亲和力和特异的靶向。所产生的嵌合蛋白在保持β-酶活性的同时, 对其靶向性具有较高的亲和力。这表明, nanobody 和β-酶基保持功能。在目前的工作中, 我们报告了一个详细的协议, 结合我们的混合β-酶系统的生物传感器技术。由于酶的催化活性释放出的质子的电导测量, 可以检测到 nanobody 对其目标的特定约束力。
Introduction
生物传感器是一种与物理或化学信号装置相结合的分析设备, 称为传感器1。然后, 可以对记录的信号进行解释和转换, 以监测固定和自由伙伴之间的相互作用。大多数的生物传感器涉及使用抗体来检测分析如激素或不同的病原体标记物2。可以使用不同的传感器格式, 包括基于质量的、磁的、光学的或电化学的生物传感器。后者是最常用的传感器之一, 通过将绑定事件转换为电信号来发挥作用。所有基于抗体的生物传感器的性能和灵敏度主要取决于两个参数: i) 抗体的质量和 ii) 用于生成信号2的系统的属性。
抗体是由两个重链和两个光链组成的高分子质量二蛋白 (150–160 kDa)。光与重链之间的相互作用主要通过疏水相互作用以及一个守恒的二硫化键稳定。每个链包括一个变量域, 它通过三变区域 (CDR1-2-3) 来与抗原相互作用。尽管在该领域取得了许多进展, 但具有低成本表达系统 (例如、大肠杆菌) 的全长抗体的大规模表达往往导致不稳定和聚合蛋白的产生。这就是为什么各种各样的抗体片段被设计了例如单链可变片段3 (ScFvs ≈ 25 kDa)。它们由一个重和一个轻链的可变域组成, 由一个合成氨基酸序列共价键连接。然而, 这些碎片往往表现出很差的稳定性, 并有聚合的倾向, 因为它们将其疏水区域的很大一部分暴露给溶剂4。在这种情况下, 单链骆驼抗体片段, 称为 nanobodies 或 VHHs, 似乎是很好的替代 ScFvs。这些域对应于骆驼单链抗体的可变域。与常规抗体相比, 骆驼抗体缺乏光链, 只包含两个重链5。因此, nanobodies 是最小的单体抗体片段 (12 kDa) 能够绑定到一个抗原的亲和力类似于常规抗体6。此外, 与其他全长抗体或抗体片段相比, 它们具有更好的稳定性和溶解度。最后, 他们的小尺寸和他们的扩展 CDR3 循环允许他们辨认隐晦的表位并且束缚到酵素活跃站点7,8。目前, 这些领域得到了相当的重视, 并已与生物传感器技术相结合。例如, 黄等人。开发了一种基于 nanobody 的生物传感器, 用于检测和量化人类前列腺特异抗原 (PSA)9。
如上所述, 生物传感器检测的一个重要参数是用于产生电信号的系统的效率。因此, 基于酶的电化学生物传感器越来越受到人们的关注, 并被广泛应用于医疗保健、食品安全和环境监测等各种领域。这些生物传感器依赖于一种酶对基质的催化水解来产生电信号。在这种情况下, β-酶被证明是更具体, 更敏感和更容易实施实验比其他许多酶, 如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶10。β-酶是酶, 负责对β内酰胺抗生素的细菌耐药性, 通过水解它们。它们单体, 非常稳定, 高效, 体积小。此外, 域/肽插入β-酶产生双功能嵌合蛋白, 被证明是研究蛋白质-配体相互作用的有效工具。事实上, 最近的研究表明, 在 TEM1 β-酶中插入抗体可变片段的结果是嵌合蛋白, 仍然能够与其靶抗原的高度亲和性结合。有趣的是, 抗原结合被证明能诱发 TEM1 催化活性的构调节11,12。此外, 我们在几项研究中表明, 蛋白质域插入到一个允许循环的芽孢杆菌地衣BlaP β-酶产生功能嵌合蛋白, 非常适合监测蛋白配体的相互作用13 ,14。我们最近在 BlaP15的这个允许插入站点中插入了一个名为 cAb-Lys3 的 nanobody。这 nanobody 被证明绑定到母鸡-蛋清溶菌酶 (HEWL) 和抑制其酶活性16。我们表明, 生成的杂交蛋白, 命名为 BlaP-cAb-Lys3, 保留了高特异性/亲和力对 HEWL, 而β-酶活性保持不变。然后, 我们成功地将混合β-酶技术与电化学生物传感器相结合, 结果表明, 产生的电信号量与固定在电极上的 BlaP-cAb-Lys3 和 HEWL 的相互作用有关。事实上, β-内酰胺抗生素的水解 BlaP 诱导质子释放, 可以转化为定量的电信号。这种组合的混合β-酶技术与电化学生物传感器是快速, 灵敏, 定量, 并允许实时测量生成的信号。本文介绍了这种方法。
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Protocol
1. 蛋白质样品制备
- 生产和纯化杂交蛋白 BlaP-cAb-Lys3 如我们以前的研究报告15。将蛋白质储存在50毫米磷酸盐缓冲液 pH 值7.4 以下组成: 8 克氯化钠, 0.2 克氯化钾, 1.44 克 Na2HPO4和 0.24 g 的下一2PO4溶解在800毫升蒸馏水中修复溶液的 pH 值为7。4将溶液的最终体积调整到 1 l. 过滤器对蛋白质溶液进行杀菌。
- 准备一个母鸡卵白溶菌酶 (HEWL) 库存解决方案。溶解100毫克 (4万单位/毫克) 的商业购买 HEWL 在10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS 见步骤 2.1.1)。用0.22 μ m 截止过滤器对蛋白质溶液进行消毒。
2. 生物传感器检测
-
解决方案和缓冲准备
- 准备50毫米 PBS 通过溶解 8 g 氯化钠, 0.2 克氯化钾, 1.44 g Na2HPO4, 和 0.24 g 的, 在2毫升的蒸馏水4PO800 。调整到 pH 值7.4 与 1 n HCl 或 1 n 氢氧化钠, 然后调整解决方案的体积到 1 l. 过滤消毒和存储在4° c。
- 准备一个饱和/堵塞解决方案, 溶解3克的酪蛋白水解物在100毫升的 PBS 制备如上文所述 (见步骤 2.1.1)。过滤消毒, 贮存在4° c。
- 准备一个结合的解决方案, 溶解1克的酪蛋白水解物在100毫升的 PBS 制备如上文所述 (见步骤 2.1.1)。过滤消毒, 贮存在4° c。
- 准备一个洗涤解决方案 (0.1% 补间-pbs), 添加100μ l 吐温 20 (100%) 在100毫升的 pbs 准备如上文所述 (见步骤 2.1.1)。贮存在4° c。
- 准备一个电极准备解决方案 (1% 海卫 X-100-pbs), 增加1毫升的海卫 X-100 (100%) 在100毫升的 PBS 制备如上所述 (见步骤 2.1.1)。贮存在4° c。
- 准备一个电极再生解决方案 (3.5 米氯化钾) 溶解26克的氯化钾在蒸馏水到最后一卷100毫升。过滤灭菌, 贮存在4° c。
- 准备一个5毫米氯化钠溶液溶解0.29 克氯化钠在蒸馏水到最后的容量 1 l. 过滤器消毒并且存放在4° c。然后, 准备一个检测解决方案 (4 毫米青霉素) 溶解26.7 毫克的青霉素在20毫升5毫米氯化钠溶液。过滤消毒, 贮存在-20 ° c。
-
传感器的制备和再生
注: 聚苯胺涂层传感器芯片由 Dr. p Bogaerts、Dr. s ·尤努斯和 Prof. Glupczynski 的天主教大学 (鲁汶-拉-Neuve-楚-Godinne) 提供。对传感器的描述以及用于合成这些传感器的聚苯胺电聚合协议在以前的工作17中进行了详细介绍。简单地说, 该系统使用的是由传统印制电路板 (PCB) 技术制造的八单个芯片的可重新使用的传感器。单个芯片由三电极圆点组成。顶部是聚苯胺电合成的工作电极。中间一个是参考电极, 底部电极构成计数器电极。两个, 参考和计数器电极功能化使用固体银/氯化汞合金的顶部的碳层。- 执行3冲洗的电极, 浸渍的秘诀, 96-井板包含300µL/井的电极制备解决方案 (1% 海卫 X-100-PBS, 见步骤2.1.5。每洗2分钟, 在室温下进行温和搅拌。
- 冲洗电极, 将小贴士浸入含有300µL 的96井板的井中, 并在室温下温和搅拌2分钟。
- 在室温下, 在4° c 或 1 h 的条件下, 通过将尖端浸入96个井板 (3.5 M 氯化钾, 见步骤 2.1.6), 重新生成电极。
- 执行3冲洗的电极, 把小费浸入96井板含300µL/井的磷酸盐缓冲盐水 (见步骤2.1.1。每洗2分钟, 在室温下进行温和搅拌。
-
在传感器上进行的结合化验
- 通过将 PBS 制备的15µL 滴40µg/mL HEWL 沉积到电极表面, 将 HEWL 涂在电极上的聚苯胺表面。在室温下在4° c 或1小时孵育过夜。
- 用磷酸盐缓冲盐水 (见步骤 2.1.1) 将传感器芯片的电极部分浸入含磷酸盐缓冲盐水300µL/井的96井板的井中, 执行三的电极洗涤。每洗2分钟, 在室温下进行温和搅拌。
- 通过在电极表面加入50µL 滴的堵塞溶液 (见步骤 2.1.2) 使电极饱和。室温下孵育1小时。然后洗三次, 如前一步所述 (参见步骤 2.3.2)。
- 将 BlaP-cAb-Lys3 溶液稀释到20µg/毫升的结合溶液中 (见步骤 2.1.3), 并将该稀释溶液的15µL 滴放到电极上。室温孵育10分钟。在抗原-nanobody 反应之后, 洗涤三次被描述在前步使用洗涤解答 (参见步 2.1.4)。然后用 PBS 冲洗电极 (见步骤 2.1.1)。
- 用于检测, 将传感器芯片通过铜电路部件插入数字万用表。然后, 启动传感器的反应, 应用50µL 下降的检测解决方案 (见步骤 2.1.7) 到积极的电极和应用50µL 滴氯化钠5毫米溶液到负极 (见步骤 2.1.7)。室温孵育30分钟。用数字万用表监测电导率。
注: 万用表是由 Dr. p Bogaerts、Dr. 和 Prof. Glupczynski (鲁汶-拉-Neuve-楚 Godinne 天主教大学提供的。此电位是通过 USB 端口进行计算机控制的, 同时分析八种不同的传感器芯片。由尤努斯和同事们创建的软件17创建了一个实时图, 它表示参照和采样电极对时间的电导差的测量。
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Representative Results
嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lys3 的设计与工程
图1表示将 cAb-Lys3 插入到 BalP 类的一个允许循环中, 从地衣芽孢杆菌中的β-酶。在残余 Asp198 和 Lys199 之间进行插入。在 cAb-Lys3 的两侧引入了凝血酶劈裂部位。用本构表达质粒对 BlaP-cAb-Lys3 嵌合蛋白进行转化的细胞能够在氨苄青霉素的小浓度下生长。这一结果表明, 杂交β-酶是可溶性的, 正确折叠, 可以成功地排泄到细菌的周空间, 它可以有效地提供抗氨苄西林。我们进一步分析了嵌合蛋白的 bifunctionality。正如我们以前的研究报告, 我们的数据表明, β-酶以及嵌合蛋白的 cAb-Lys3 基保留了他们的生物活动15。
电导生物传感器检测
用于此检测的传感器芯片如图2所示。用于这些实验的传感器包含8芯片。每个芯片包括三电极: 一个工作电极, 一个计数器电极, 和一个参考电极。这8芯片在传感器中组织为4对。对于每对, 一个标记为 "-" 的芯片对应于一个负控制, 而标签为 "+" 的芯片对应于被测试的样本。
图3代表了在这项工作中使用的实验装置的示意图描述, 它将混合β-酶技术与电位传感器相结合。在这个装置中, 两个电极被使用: i) 一个参考电极和 ii) 聚苯胺涂层电极。HEWL 吸附在聚苯胺涂层电极上, 如其他研究报告18,19。在充分的洗涤以后 , BlaP - cAb - Lys3 ( 为 + 被标记的芯片 ) 或 BlaP 没有入的 nanobody ( 为 - 被标记的芯片 ) 在电极被应用。在电极上加入β-内酰胺 (青霉素) 后, 测量电极电导的变化。事实上, β-内酰胺水解β-酶产生质子释放;结果表明, 在极短的响应时间内, 电极电导率发生了显著的变化。图4所示的生物传感器测试表明, 通过测量固定化β-酶活性的质子释放, 可以检测和监测 BlaP-cAb-lys3 在聚苯胺电极上固定的 HEWL 的结合。相比之下, 在没有任何插入 nanobody 的 BlaP 进行实验时, 没有发现电导差异。
图 1: 表示嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lys3 与 HEWL 相互作用的方案.BlaP 以青色、橙色 cAb-Lys3 和 HEWL 蓝色显示。这个数字是通过结合 BlaP (pdb id: 4BLM) 和 cAb-Lys3/HEWL 复合体 (pdb id: 1MEL) 的三维结构得到的。β-酶包含2个领域: α/β领域和α领域, 催化作用的站点位于两个领域之间的接口。用于插入的循环以黄色突出显示, 位于α域中的溶剂暴露循环中。cAb-Lys3 的 N 和 C 终端部分以红色显示。cAb-Lys3 的 CDR3 回路使大部分接触 HEWL 催化点。cAB-Lys3 对 HEWL 的束缚抑制了其酶活性。此图和本文中的结果已在我们以前的工作15中发布。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 实验中使用的传感器的图片.每个传感器包括一组8个单独的芯片。在每个芯片上, 有三电极: 一个工作电极, 一个参考电极, 和一个计数器离子电极。铜盖部分被连接到计算机的数字万用表上。单个芯片被组织为4对, 其中 "-" 标记的芯片是负控制电极和 "+" 标记的芯片是样品电极。这种设置允许不同的实验复制或 HEWL/β-酶浓度同时进行测试。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用于生物传感器检测的实验装置的示意图表示.HEWL 被固定在聚苯胺涂层电极上。然后在电极上应用嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lys3。固定化β-酶活性, 这是由测量质子释放的水解诱导的青霉素, 是直接成正比的相互作用的 HEWL 和嵌合蛋白。质子释放诱导电导变化转换成一个信号, 可以由用户解释。聚苯胺涂层与参考电极之间的电导差的演变是时间的函数。此图和本文中的结果已在我们以前的工作15中发布。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 电导的图形表示形式测量显示 BlaP-cAb-Lys3 与 HEWL 的特定交互.青霉素的加法由箭头表示。这种潜在的差异的结果, 质子释放发生后, 抗生素水解。测量是用混合蛋白 BlaP-cAb-Lys3 (红色) 和本机β-酶 BlaP 没有任何插入 nanobody (蓝色), 作为一个负控制。不同的曲线代表在不同的芯片上进行的独立测量。此图和本文中的结果已在我们以前的工作15中发布。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这项工作中, 我们提出了一种方法来化 nanobody 使用 BlaP β-酶作为载体蛋白, 我们表明, 我们可以成功地实现的结果混合蛋白的电位传感器检测。我们工作的主要创新方面与其他生物传感器的检测相比, 是抗体部分与产生电信号的酶活性的共价耦合。这种所谓的蛋白质插入技术带来的优势和局限性, 将是本节的主要重点。
混合β-酶技术的优势。
β-酶是高效酶
影响生物传感器灵敏度和信噪比的最重要参数之一是用于生成信号的酶活性。在这种情况下, β-酶有几个优点: 它们是小 (≈29 kDa), 单体, 非常稳定, 更重要的是, 表现出高的具体活动和高营业额相比, 其他酶用于电位传感器的检测, 如葡萄糖氧化酶, 脲酶, 脂肪酶, 过氧化物或碱性磷酸酶20。由于这些原因, β-酶是各种生物传感器检测的首选酶。
直接插入β-酶可以提高插入蛋白质/域的产量和稳定性。
许多免疫传感器检测的限制性因素之一是用于测定分析物2的抗体的质量 (例如稳定性、纯度)。目前, 低成本生产系统的抗体或抗体片段 (如大肠杆菌) 仍然具有挑战性, 往往导致聚合蛋白的溶解度和稳定性较差的21。我们的混合β-酶技术似乎是克服这些困难的好方法, 因为我们以前表明, 该策略提高了插入蛋白域14的表达率和稳定性。特别是, 在本研究中, 使用我们的杂交β-酶系统, 在大肠杆菌中成功地表达了 BlaP-cAb-Lys3 的嵌合蛋白, 它具有很好的产率 (≈10纯蛋白每公升的培养), 并纯化为同质性。
抗体与酶基的共价耦合使传感器检测更便宜更快
在常规免疫中, 对分析物的检测需要利用传感器芯片上固定的主要抗体。随后, 与酶或标记探针耦合的二次抗体也需要产生可测量的信号。这种方法涉及几个孵化和洗涤步骤, 因此可以耗费时间。此外, 该协议是昂贵的, 因为有几个抗体是必需的, 第二抗体和酶/探针之间的共价耦合也是必要的。相比之下, 我们的系统只使用混合蛋白质来检测和量化分析物, 因此允许实时监测而不使用二次抗体。
此外, 重要的是要注意, 域插入到类β-酶被证明产生混合蛋白表现出构开关样的行为22,23。这种开关可以在基于生物传感器的检测中找到许多应用。
杂交β-酶技术的局限性。
蛋白质工程引起的局限性。
在这个系统中, 主要的难点是通过将抗体的基团插入β-酶来设计和获取杂交蛋白。这种产生的嵌合蛋白必须双: 酶的基团必须能够有效地水解β-内酰胺抗生素来产生电信号, 而抗体的基团必须与具有高亲和力的目标分析物结合,特异.为了获得双嵌合蛋白, 需要考虑各种参数, 以避免位点约束。第一个关键点是插入站点的位置。虽然已经表明多个插入点是可能的24,25,26, 插入位置通常位于远离载体蛋白活性部位的溶剂暴露回路中。这就最大限度地减少了潜在的构象变化或位阻的插入蛋白诱导。出于同样的原因, 还建议将插入的蛋白质的活性部位放置在远离插入部位的地方, 以防止其活动的改变。最后, 插入的蛋白质, 目前灵活或邻近的 n-和 C 末端四肢将更好地容忍。事实上, 遥远和僵硬的四肢可以对两个嵌合蛋白的伙伴施加空间限制, 从而改变它们各自的生物活动。因此, 重要的是要提到, 插入蛋白质的大小只对所产生的嵌合蛋白影响不大。事实上, 它已经表明, 大型结构化域可以成功地插入β-酶, 只要他们的 N 和 C 终端四肢是灵活或接近其他13,14,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. 在本研究中, BlaP 的插入点位于远离其活动位置的位置, 插入的 nanobody 具有相对较长和灵活的四肢 (在 X 射线结构中不可见), 它们位于远离 paratope 的位置。这些特定的特性确保了在混合蛋白质的两个伙伴的生物活性表面上施加最小的位阻约束。然而, 当插入的蛋白质不提出推荐的标准为最佳的插入到载体蛋白质, 它是可能的工程师链接器区域为了降低潜在的空间位约束。事实上, 有一个灵活的链接器 (例如甘重复) 来连接载体和插入的蛋白质的存在显著增加了对大的和结构化的蛋白质的插入的容忍到载体一30 ,12。
电化学的固有限制传感器.
虽然电化学/电位传感器的发展已成为一个不断增长的领域, 这些测试有重要的限制, 需要考虑时, 设计的生物传感器实验。首先, 所有涉及 H+释放或摄取的生物传感器都需要使用非常弱缓冲的解决方案 (即< 5 mM)31 , 以测量显著的潜在差异。pH 值变化诱发的 H+释放可以影响蛋白质特性和酶活性用于产生信号。其次, biofluids 中的 pH 值和离子强度会有很大的差异, 从而导致响应的重要变化, 并增加传感器32的背景噪声。这就是为什么, 各种研究小组都试图开发纳米来减小电化学传感器元件的尺寸, 以提高在设备33的接口上发生的进程的信噪比,34,35. 因此, 还可以开发标记有多个相同酶分子的抗体分子, 以增加由一个分子到其目标32的结合所产生的信号。然而, 尽管有这些限制, 电导/生物传感器仍然是高效和敏感的设备, 在 10-8到 10-11 M36的范围内, 估计的检测限制 (检测)。
在这项研究中, 我们已经表明, 我们可以成功地插入一个 nanobody 的目标 HEWL 到一个类β酶命名为 BlaP, 并认为所产生的杂交蛋白保留两个生物活动: i) 紧密结合的 HEWL 和 ii) 的能力水解β-内酰胺抗生素这项研究构成了一个概念的证据, 插入各种 nanobodies 或抗体片段到 BlaP 和实现这种混合蛋白技术的电位传感器检测。这种技术可能被用于检测各种蛋白质表位并在许多诊断工具中实现。事实上, 这种化验的发展和有效使用已成为我们社会的关键, 主要是由于社会和经济需要, 在诸如食品和保健系统等各个领域的低成本和易于操作的技术, 特别是在发展中国家。此外, 纳米在这种传感器的发展中发挥着越来越大的作用。现在, 信号处理技术可以在便携式设备 (如智能手机和平板电脑) 上获得, 并且在信号处理37中已经存在不同的智能手机应用程序。例如, 最近, 一个电位传感器装置已被集成到智能手机, 以允许血糖浓度监测38。健康专家相信, 这些创新的设备将成为未来几年更重要的健康解决方案39,40。
总之, 这项工作代表了一个例子, 显示了我们的蛋白质插入技术的潜力和优势。我们希望这项工作将有助于为研究和医疗目的开发创新和有用的技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认比利时的瓦隆地区在 SENSOTEM 和 NANOTIC 研究项目的框架内, 以及国家科研基金 (储备-f.n.r.) 的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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