Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral

L’objectif global de ces procédures est d’évaluer la spécificité et l’efficacité des conjugués d’anticorps pour s’accumuler à l’intérieur des cellules cibles et des tumeurs au cours des premières étapes de développement afin qu’ils puissent finalement être utilisés en clinique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la réponse aux champs conjugués, telles que l’efficacité de la localisation nucléaire et l’accumulation intercellulaire globale. L’un des avantages de cette technique est que, grâce à l’imagerie TEP, les chercheurs peuvent évaluer l’efficacité et la sélectivité des conjugués d’anticorps candidats.

Les implications de ces techniques s’étendent à la thérapie et au diagnostic du cancer, car l’accumulation inefficace de cellules tumorales est une limitation majeure de ces applications pour les conjugués d’anticorps. Après avoir synthétisé un conjugué d’anticorps de séquence de localisation nucléaire colique-acide selon le protocole de texte, traitez les cellules cibles TF1A avec 200 nanomolaires de conjugué d’anticorps MLS d’acide colique 7G3. Inclure les cellules traitées avec des anticorps monoclonaux de contrôle modifiés.

Incuber cinq fois 10 à la sixième cellule positive à l’antigène avec les conjugués à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez ensuite le surnageant et utilisez un millilitre de PBS glacé pour laver les cellules trois fois. Ajoutez du milieu frais et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure supplémentaire.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de PBS, contenant 0,25 % de trypsine et d’EDTA, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes maximum. Utilisez ensuite 1,5 millilitres de milieu RPMI1640 avec 10 % de FBS pour neutraliser la trypsine. Centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, retirez le surnageant et utilisez 0,5 millilitre de PBS glacé pour laver à nouveau les cellules trois fois.

Ajoutez 0,5 millilitre de 1 % de PFA et 1 % de saccharose et de PBS aux cellules, et placez-les sur de la glace pendant 30 minutes pour les fixer. Ensuite, utilisez 0,5 millilitre de PBS glacé pour laver les cellules trois fois, et centrifugez les échantillons à 250 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 0,15 % de Triton X-100 et de PBS aux cellules et faites-les perméabiliser sur de la glace pendant cinq minutes.

Ensuite, avec du PBS glacé, lavez les cellules et répétez la centrifugation. Suspendez les cellules dans 0,1 millilitre de PBS, contenant deux microgrammes par millilitre d’un anticorps polyclonal secondaire FC antireflet conjugué à Alexa Fluor 647, et incubez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure. Centrifugez les cellules à 250 fois G pendant cinq minutes et utilisez 0,5 millilitre de PBS glacé pour laver les cellules trois fois.

Ensuite, suspendez les cellules dans 0,5 millilitre de PBS. Ajoutez 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium aux cellules. Ensuite, utilisez le support de montage pour monter une fois 10 à la cinquième cellules sur des lames de verre avant de recouvrir l’échantillon d’une lamelle de verre.

Examinez les cellules avec un objectif à immersion dans l’huile Plan APO 60X, ouverture numérique de 1,42, sur un microscope confocal à balayage laser inversé. Détectez la fluorescence PI à l’aide du laser à argon de 488 nanomètres et du prisme de balayage spectral réglé pour 600 à 650 nanomètres. Pour la fluorescence AF 647, utilisez le laser hélium-néon de 633 nanomètres et le prisme à balayage spectral réglé pour 650 à 700 nanomètres.

Collectez des images de PI et AF 647 de manière séquentielle, de 1024 x 1024 pixels, avec une moyenne de ligne 2X, prise à des intervalles de 0,5 micron sur toute l’épaisseur de la cellule. Présentez des images sous forme de projections Z. Pour analyser les cellules, évaluer et enregistrer si la fluorescence intracellulaire dans le cytoplasme est groupée et proche de la surface cellulaire ou diffuse et homogène.

Évaluez également l’intensité relative de la fluorescence par cellule. Après avoir préparé et concentré le conjugué d’anticorps NLS anti-acide colique radiomarqué conformément au protocole de texte, déterminez l’efficacité du radiomarquage en appliquant 0,5 microlitre de citrate de sodium PH5.5 à 0,1 molaire, ou éluant ITLC, sur une bandelette ITLC. Former une autoradiographie de la bande et obtenir une image numérique.

Effectuer une densitométrie pour obtenir la proportion de Cuivre-64 lié et libre. Si la teneur en cuivre 64 libre est supérieure à 5 %, concentrez davantage l’échantillon. Pour les études d’accumulation cellulaire de cuivre-64, traitez les cellules avec 100 nanomolaires de conjugués A14 marqués au cuivre-64 à 37 degrés Celsius pendant une, six et 24 heures, comme décrit précédemment.

Traitez les cellules avec de l’A14 non modifié pour bloquer les alphacytes de l’IL5R et à quatre degrés Celsius pour bloquer l’internalisation médiée par le récepteur. Après avoir lavé les cellules et incubé avec un milieu frais, comme démontré précédemment dans cette vidéo, ajoutez 0,5 millilitre de PBS contenant 0,25 % de trypsine et d’EDTA, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, après avoir neutralisé et lavé les cellules comme précédemment, ajoutez un tampon de lyse à membrane plasmique aux cellules et incubez-les sur de la glace pendant 10 minutes.

Centrifugez les cellules lysées par membrane plasmique à 90 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et transférez-le dans un tube frais. Celle-ci représente la fraction cytoplasmique.

Ensuite, utilisez du PBS glacé pour laver les noyaux trois fois, et ajoutez les lavages à la fraction cytoplasmique. Assurez-vous que les flacons contenant les fractions nucléaires et cytoplasmiques sont scellés, puis placez-les dans un compteur gamma calibré pour le cuivre-64 afin de convertir les numérations brutes en mégabécaril. Déterminer la qualité de l’isolement des noyaux en effectuant une analyse Western-Blot pour la lamine AC, une protéine nucléaire restreinte ; et Rab-7, une protéine cytoplasmique abondante, sur des fractions lysat, nucléaire et cytoplasmique en gros.

Traitez cinq fois 10 sur les six cellules avec 500 microlitres de dosage par radioprécipitation amino-amino-précipitée, ou tampon RIPA, et un tampon de lyse plasma-membranaire contenant 1%2 % et 4 % de NP-40. De plus, traitez les noyaux isolés avec 500 microlitres de tampon RIPA pour obtenir des protéines nucléaires isolées. Ajoutez quatre fois le volume d’échantillon d’acétone froide aux protéines nucléaires, cytoplasmiques et en gros isolées, et incubez pendant 60 minutes à moins 20 degrés Celsius.

Centrifugez les échantillons à 13 000 fois G pendant 10 minutes. Décantez le surnageant en faisant attention de ne pas déloger la pastille de protéine. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS pour dissoudre les protéines.

Après avoir effectué le Western Blot comme décrit précédemment, coupez la membrane en deux au niveau du marqueur de poids moléculaire de 40 kilodaltons. Utilisez des anticorps spécifiques de lamin-AC pour sonder le transfert contenant les protéines de poids moléculaire supérieur, et utilisez des anticorps spécifiques de Rab-7 pour sonder la moitié inférieure de la membrane. Dans les groupes contenant quatre souris nodskit, injecter dans la veine de la queue 20 à 30 microgrammes de conjugué d’anticorps anti-acide colique NLS A14 radiomarqué, de NLS A14 radiomarqué et de A14 radiomarqué.

Le même jour, placez un fantôme cylindrique contenant cinq mégabecaril de cuivre-64 dans le scanner TEP pour convertir le nombre de substances radioactives par seconde en dose injectée par gramme de tissu. 48 heures plus tard, après avoir anesthésié les souris selon le protocole textuel, transférez rapidement une souris sur une table de scanner TEP en position couchée tête première avec un cône de nez pour l’isoflurane. Démarrez l’acquisition des données TEP à l’aide d’un mode d’échantillonnage régulier et d’une fenêtre d’énergie de 250 à 650 kiloélectronvolts.

Après l’analyse, retirez la souris du scanner et remettez-la dans la cage. Comme le montre cette figure, les flèches montrent la différence lors de l’évaluation de l’accumulation de conjugués d’anticorps avec et sans trypsinisation. Dans les cellules qui ne sont pas trypsinisées, l’accumulation et la distribution intracellulaires sont difficiles à évaluer en raison de la surexpression des récepteurs de surface de la cellule cible.

Les flèches montrent la différence dans l’accumulation intracellulaire et la distribution de deux candidats conjugués d’anticorps lorsque les cellules sont correctement trypsinisées. Le conjugué radiomarqué de l’anticorps NLS de l’acide colique A14 présente une affinité nanomolaire pour l’IL5R alpha. Avec l’augmentation des concentrations de conjugué d’anticorps NLS d’acide colique A14 radiomarqué, la liaison spécifique du conjugué d’anticorps NLS d’acide colique A14 s’est approchée de la saturation à des concentrations de 3,5 nanomolaires dans les cellules HT-1376 et HT-B9.

Le comptage gamma révèle que l’augmentation de la radioactivité dans le noyau et dans le cytoplasme du conjugué d’anticorps anti-acide colique A14 NLS radiomarqué est spécifique et augmente avec le temps. Les cellules HT-1376 et HT-B9 ont été incubées avec un tampon de lyse membranaire plasmatique contenant 1 %2 % ou 4 % de NP-40. Pour les cellules HT-1376 et HT-B9, le tampon de lyse contenant un ou 2 % de NP-40 Rap-7 n’a pas été détecté dans la fraction nucléaire, et la lamine AC n’a pas été détectée dans la fraction cytoplasmique.

L’imagerie TEP permet d’évaluer les conjugués d’anticorps candidats pour leur capacité à cibler les tumeurs positives à l’antigène, les flèches rouges et bleues et leurs propriétés de biodistribution associées par rapport à l’anticorps parental non modifié par le peptide. On peut voir l’accumulation du signal dans la tumeur pour aider à sélectionner le potentiel d’un conjugué d’anticorps développé. L’imagerie TEP permet également d’évaluer l’absorption des anticorps candidats conjugués dans les tissus sains tels que le foie.

Après avoir maîtrisé ces techniques, les chercheurs dans le domaine de l’administration tumorale ciblée de charges utiles moléculaires seront en mesure d’explorer d’autres agents où l’accumulation de cellules tumorales est entravée en raison du piégeage de l’endosome.