Summary
Metabolisk kompetence in vitro systemer er en afgørende forudsætning for biotransformation og disposition af narkotika og giftstoffer. I denne protokol, beskriver vi anvendelsen af reference- metaboliske prober til at vurdere Fase I metabolismen i cellekulturer.
Abstract
Xenobiotiske enzymer spiller en nøglefunktion i biotransformationen af lægemidler og toksiske stoffer ved tilsætning af funktionelle grupper, som øger opløseligheden og lette udskillelse. Ved nogle lejligheder disse strukturelle modifikationer fører til dannelsen af nye giftige produkter. For at reducere dyreforsøg, kan kemisk risiko vurderes ved anvendelse metabolisk kompetente celler. Ekspressionen af metaboliske enzymer er imidlertid ikke stabil over tid i mange in vitro primære dyrkningssystemer og er ofte delvis eller fraværende i cellelinier. Derfor bør ideelt gennemførte undersøgelsen af lægemidler, tilsætningsstoffer og miljømæssige forureninger metabolisme in vitro i cellesystemer hvor metabolisk aktivitet er blevet karakteriseret. Vi forklare her en fremgangsmåde til måling af aktiviteten af en klasse af metaboliske enzymer (Human fase I) i 2D-cellelinjer og primære 3D kulturer under anvendelse af kemiske prober og deres metaboliske produkter kvantificerbare af UPLC massespektrometri ogluminometri. Fremgangsmåden kan gennemføres for at teste den metaboliske aktivitet i cellelinier og primære celler afledt fra en række væv.
Introduction
Xenobiotisk metabolisme er den proces, hvorigennem kemikalier er fremmede for kroppen er modificeret ved tilsætning af hydrofile grupper og konjugater at lette deres udskillelse 1. Typisk metabolismen af xenobiotiske stoffer er en to-trins proces med fase I består hovedsageligt af en oxidation med tilsætning af en eller flere hydroxylgrupper 1, 2. I fase II er hydroxylgrupperne anvendes som acceptorer for en hydrofil konjugat såsom glucuronid eller et sulfat-del 1, 2. Hvis en acceptorgruppe er allerede til stede på molekylerne, kan konjugeringen trin ske uafhængigt af fase I-metabolisme. Hver reaktion udføres ved en specifik gruppe af enzymer, fx CYP'er (cytochrom P450'er), som katalyserer hydroxyleringen (figur 1) og dealkylering af kemiske substrater 3. Conjugation katalyseres af sulfotransferaser, UDP-glucuronosyltransferaser (figur 1), glutathion-S-transferaser og N-acetyltransferaser 4. Hvert væv og organ vil have en specifik metabolisk enzym ekspressionsprofil, med lever udtrykker de fleste af disse proteiner.
Figur 1: Eksempel på fase I og fase II Metabolism for coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysere 7-hydroxylering af coumarin. 7-hydroxycoumarin er konjugeret til et glucuroniddelen ved fase II enzymer UGT'er, med UGT1A6 og UGT1A9 viser den højeste aktivitet.
Forståelse metabolismen af xenobiotika er kritisk ved evaluering af lægemiddelsikkerhed og for risikovurdering af kemikalier af to grunde: reaktionskinetikken vil afgøre, hvor længe et lægemiddel eller kemisk vil forblive i kroppen i en aktiv eller inaktiv form before udskillelse; og stamforbindelsen kan modificeres til en mere reaktiv, ustabil og toksisk arter ved metaboliske enzymer. Sådanne reaktioner også kendt som "bioaktivering" er for det meste drevet af fase I CYP-enzymer, men også sjældnere lejligheder af fase II konjugering 5.
Baseret på denne evne til en in vitro model til præcist at forudsige risikoen i forbindelse med et lægemiddel eller et kemikalie er meget afhængig af den metaboliske kompetence cellesystemet. Cellelinier afledt fra syge væv eller fra transformationen af normale celler mister ofte en del, hvis ikke alle af det metaboliske enzym er repræsentativ deres væv af oprindelse 6. Opretholdelsen af den normale metaboliske enzym profil vises bedre i primære cellekulturer (mindst i korttidskulturer) og er yderligere forbedret, hvis vævet er dyrket i en matrix gør det muligt at bevare sin 3D-struktur 1. Derfor trækulletacterization af det metaboliske kompetence et in vitro celle er en vigtig indledende skridt i en vejledning Beslutningen om, hvilke celle model er hensigtsmæssigt at gennemføre kemiske sikkerhedsvurderinger.
I denne afhandling præsenterer vi en protokol til at profilere aktiviteten og ekspressionen af fase I CYP-enzymer in vitro med eksempler på deres anvendelse med en hepatisk cellelinie 7 og 3D primære lunge cellekulturer 8. CYP specifikke substrater, deres metaboliske produkter og inhibitor kontroller er beskrevet sammen med masse spectrometry- og luminogent-baserede kvantificeringsmetoder. Da nogle CYP'er er inducerbare og andre er konstitutive, vil eksempler også blive givet til de to scenarier.
Protocol
BEMÆRK: overordnede arbejdsgang for den metaboliske aktivitet assayet er skitseret i figur 2. Hvert trin i denne arbejdsgang er efterfølgende detaljeret i de næste afsnit. Detaljerede tabeller af reagenser og udstyr er angivet i tabellen of Materials.
Figur 2: Arbejdsgang for det metaboliske Probe Assay. Cellerne podes og dyrkes til passende tæthed. En CYP induktion trin kan være påkrævet afhængigt af enzymaktiviteten analyseres. Sonden substrat og inhibitor tilsættes til cellekulturen. Efter en inkubationsperiode mediet opsamlet til analyse, og cellerne lyseres for protein kvantificering. Mediet behandles til analyse af det metaboliske produkt af proben substrat ved massespektrometri eller luminometri.annonce / 55.502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Cell Culture
Figur 3: Lys Transmission mikrografi af et Nedsat cellelinje Culture. Cellelinien beskrevet i denne protokol 5 typisk differentiere med en 50% split mellem cholangiocytes og hepatocytter i kultur (100x). Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Hepatisk cellelinie kultur
BEMÆRK: En kommercielt tilgængelig hepatisk cellelinie blev anvendt som et eksempel på metabolisk kompetente celler. Cellelinien blev afledt fra en leverkarcinom forårsaget af virusinfektion 7. Ved konfluens, denne cellelinie differentieres til cholangiocyte- og hepatocyt-lignende celler (figur 3), og yderligere detaljer kan findes i Guillouzo 7. Optagelse af 2% DMSO til dyrkningsmediet understøtter differentieringen af denne cellelinje og ekspression af en række CYP'er.- Fjern de kryogene hætteglas med celler fra den flydende nitrogen og placere på tøris til transport. Overfør cryovialet til et vandbad forvarmet til 37 ° C i 1-2 min, og sterilisere ydersiden af hætteglasset med 70% ethanol før anbringelse i en laminar strøm-hætte.
- Mens arbejder under sterile forhold, forsigtigt åbne kryogene hætteglas for at frigive eventuelt overtryk og pipette indholdet af den kryogene hætteglas i en 10 ml rør fyldt med 9 ml forvarmet Williams' E-medium ved 37 ° C.
- Centrifugeres opløsningen i 10 minutter ved 400 xg ved stuetemperatur, kasser supernatanten og resuspender cellerne i 5 mlproprietære tø medium forvarmet ved 37 ° C, suppleret med glutamin eller en glutamin supplement (2 mM slutkoncentration) (Williams' E + glutamin supplement + tø tillæg).
- Tælle levedygtige celler ved anvendelse af en 500 uL alikvot med en celletæller eller ethvert andet egnet celletælling teknik.
- Pode celler på en 24-brønd collagen-coatede plade med en tæthed på 0,6 x 10 6 levedygtige celler / brønd i et slutvolumen på 0,5 ml tø medium.
- Pladen (r) i en inkubator ved 37 ° C med en 5% / 95% CO2 / luft og 100% relativ fugtighed.
- 24 timer efter podning af cellerne, erstatte mediet med 0,5 ml forvarmet vedligeholdelse / metabolisme arbejdsmedium (Williams' E + glutamin supplement + metabolisme supplement (dette medium allerede indeholder DMSO)). Skift mediet hver anden dag.
- Efter et par dage i kultur af celler danner en sub-sammenflydende trabekulær struktur (figur 3). Den optimale metaboliskeaktivitet typisk observeret mellem dag 7 og 10 og er lavest på dag 4.
Figur 4: Tværsnit af alcianblåt Stained Airway celler dyrket i den luft-væske grænseflade 8.
Cilierede, slim producerende og basale celler er klart synlige. Skala bar = 250 um.
- Differentierede luftvejsepitelet kulturer
BEMÆRK: Protokollen er vist med et kommercielt tilgængeligt fuldt differentieret primær luftvejsepithel dyrket ved luft-væske-grænsefladen på en indsats 8 (figur 4). Vævskulturen bevarer en mucocilliær fænotype og cellepolaritet 8. Celler kan være af nasal eller bronkial oprindelse. Her, brug humane nasale celler. Cellerne leveres på en dyrkningsplade format med 24indsætter ved luft-væske-grænsefladen. For at lette transport og undgå medium spild indsatserne leveres med den basale sektion indlejret i en agarosematrix blandet med dyrkningsmedium.- Ved levering af cellerne, sterilisere pladerne indeholdende 24 skær med en 70% ethanolopløsning før anbringelse i et rent laminar flow hætte.
- Forberede en steril 24-brønds plade ved tilsætning af forvarmet 700 pi proprietære dyrkningsmedium.
- Anvendelse af sterile pincetter overføre celleindsatsene til den nye plade pre-loaded med mediet ved forsigtigt at omplacere indsatsen fra agarosematrix.
- Pladen (r) i en inkubator ved 37 ° C med en 5% / 95% CO2 / luft og 100% relativ fugtighed.
- Hver 2 dage overføre indsatserne til en ny steril 24-brønds plade pre-loaded med 700 pi varm proprietære luftvej celledyrkningsmedium.
- Vurdere integriteten af luftvejsvæv anvendelse af fremgangsmåder, såsom trans-epitel modstand (TEER), ellercilier slog frekvens (CBF) ved hjælp af et mikroskop udstyret med et live video imaging system 9. Målingen af TEER og CBF er beskrevet i Kuehn 10.
2. CYP Aktivitet Kvantificering i cellekulturer
BEMÆRK: Som en generel regel kan opløsningsmidler, såsom DMSO og methanol anvendes til fremstilling af stamopløsninger til de forskellige metaboliske prober og inhibitorer præsenteret i dette papir. Det anbefales dog, at holde den endelige DMSO-koncentration i dyrkningsmediet på et minimum (1% eller lavere), da høje koncentrationer kan inhibere metaboliske enzymer. Når det er muligt, anbefales det også at anvende phenolrødtfrit og serumfrit medium under inkubationen med metaboliske prober siden phenolrødt kan forstyrre CYP'er og fase II-enzymaktivitet og serum komponent såsom albumin kan nedsætte sonden tilgængelighed. Det er ikke altid muligt at strengt til disse retningslinier. For eksempel luftvejene celledyrkningsmediet er beskyttede og indeholder phenolrødt. Proprietære hepatisk cellelinie metabolisme medium 7 indeholder allerede DMSO over 1%, som det er påkrævet for cellerne at vedtage hepatocyt-lignende fænotype.
BEMÆRK: Endelig, her er udtrykket specifik probe / inhibitor anvendes, men denne terminologi må betragtes med forsigtighed. Faktisk er det meget sjældent, at en metabolisk probe til være et enzym eksklusiv substrat. De her beskrevne prober imidlertid har en høj affinitet for deres enzym mål og derfor betragtes som pålidelige markører for aktivitet.
- Metaboliske sonder, inducerer, og inhibitorer
- Prober under anvendelse af massespektrometri baserede metoder
BEMÆRK: Proberne og inhibitorer beskrevet i dette afsnit, er egnede til at teste aktiviteten af CYP2As 11, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, og CYP2E1 17 ved UPLC-massespektrometri. Proberne, inhibitorer og tilsvarende CYP er beskrevet i tabel 1 med tilsvarende henvisninger. Tabel 1 viser også det metaboliske produkt af CYP aktivitet, som kvantificeres ved massespektrometri. Alt arbejde, der involverer vævskultur og opløsninger til brug i vævskultur skal udføres i en steril vævskultur hætte. en stamopløsning kan fremstilles i DMSO for alle probesubstrater.- Før forsøget forberede to serier af celleindsatsene eller brønde, bruge en serie til inhibering eksperiment, den anden for kun den metaboliske probe. Forbered en tredje række celler som medium blank kontrol. De kan være på separate plader eller i de samme plader med et minimum af tre gentagelser. Et eksempel på plade låud er vist i figur 5.
- På dagen for eksperimentet erstatte cellekulturmediet med 450 pi frisk medium.
- Fremstilles på steril hætte en 10x koncentration af følgende opløsninger under anvendelse celledyrkningsmediet. Bland 10x CYP probe, 10x CYP inhibitor og 10x CYP inhibitor plus 10x probe.
BEMÆRK: Master stamopløsninger af inhibitor og proben kan fremstilles i 100% DMSO (fx 1.000 x beholdninger) og yderligere fortyndet i medier til opnåelse af en 10x opløsning for at undgå en slutkoncentration DMSO i overstiger 1% med cellekulturen . De endelige 1x koncentrationer, der er rettet til inkubation med cellerne er vist i tabel 1. - Foretage forskellige 10x sonde opløsning med et 0,2 um sprøjtefilter.
- Der tilsættes 50 pi medium indeholdende 10x CYP inhibitor til rækken af celler fremstillet til inhibering eksperiment og præ-inkuberes i 30 min.
- RELæg mediet af celler til inhibering serie med 450 pi frisk medium og tilsættes 50 pi medium indeholdende både 10x CYP inhibitoren og 10x probesubstrat.
- Tilføje til de andre celler 50 pi medium med 10x probesubstrat og tilføj en ækvivalent mængde vehikel fortyndet i medium (for eksempel DMSO) til de datoer cellekontroller som vist i figur 5.
- Inkubere cellerne til 0 - 5 min (tid 0, baggrundskontrol) og 16 timer i cellen inkubator.
BEMÆRK: Denne inkubationstid blev anvendt med succes med luftvejsceller og hepatisk cellelinie; dog friske primære hepatocytter har en høj metabolisk kompetence, indtil kvaliteten af præparatet celle og genetiske sammensætning af donor, dermed kortere tider (for eksempel 2-4 timer) kan være egnede. Det anbefales altid at udføre en tidsforløbeksperiment ved prøvning forskellige cellelinjer eller celletyper. - Ved slutningen af inkubationsperioden, Collect mediet i separate mærkede rør til kvantificering af det metaboliske produkt af proberne. Frys mediet til fremtidig behandling.
- Lyserer cellerne for protein kvantificering.
BEMÆRK: Alle standard protein kvantificering kit og protokol er egnet til dette trin. BCA er en passende indstilling. Dette trin er valgfrit, hvis cellerne skal anvendes i et andet assay.
- Medium behandling
BEMÆRK: indsamlet fra inkubationen stadium mediet indeholder den forælder probe kemiske samt dets metaboliske produkter. At måle en specifik CYP-aktivitet kun produktet af reaktionen katalyseret af CYP af interesse skal kvantificeres. Fase I stofskifteprodukter behandles ofte i tandem med fase II metabolisme (konjugation) og kan derfor ikke detekteres som sådan. Således for at opnå den mest nøjagtige kvantificering af en CYP-aktivitet, er en dekonjugering trin kræves for at fjerne enhverFase II metabolisme modifikation. Eftersom konjugering af fase I-metabolitter indebærer ofte glucuronidering eller sulfatering, er dekonjugering opnås ved behandling af prøverne ved glucuronidaser og sulfataser 18. Glucuronidase og sulfataseaktivitet er pH-afhængig med højeste glucuronidaseaktivitet opnås ved pH 4,5-5,0 og sulfataseaktivitet er størst ved pH 6,0-6,5. Derfor kræver dette trin pH-justering. I den her beskrevne fremgangsmåde, vi pH måles under anvendelse af pH-strips af praktiske grunde, da de fleste pH-meter prober ikke passer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kommercielt tilgængelige pH-strimler kan findes med en opløsning så lav som 0,3 til 0,2 pH-enheder.- Overfør 250 pi inkubationsmedium til et 1,5 ml mikrorør og tilsæt 4-methylumbelliferon intern standard stamopløsning til en slutkoncentration på 100 nM.
- Indstil pH af mediet til 4,5-5,0 ved tilsætning af 1 M HCI. Tilsæt 1 pi HCI ad gangen og kontrollere pHved pipettering 2 pi medium på en pH-strimmel. Nå en pH på 5,0 vil typisk kræver ikke mere end 5-10 pi 1 M HCI.
- Tilsæt 150 enheder (1,8 uL af en 85.000 enhed / ml stamopløsning) af β-glucuronidase / arylsulfatase fra Helix pomatia og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Reaktionen standses ved tilsætning af 250 pi kold methanol (-20 ° C). Opbevare prøverne ved -20 ° C eller proces yderligere.
- Opløsningsmidlet afdampes ved anvendelse af en vakuum-centrifuge ved 45 ° C. Rekonstituer prøverne med 500 pi af en 30% acetonitril: vand-opløsning. Prøverne er klar til massespektrometrianalyse og kan opbevares ved -20 ° C i ravfarvet hætteglas.
- Massespektrometri baseret kvantificering
BEMÆRK: Alle UPLC og masse spektrometer indstillinger er nærmere beskrevet i den dedikerede Supplerende tabel 1. Til en kvantitativ analyse, oprettelse af en kalibreringskurve er påkrævet. den caliBration dannes ved at løbe en kendt fortyndinger af forbindelsen, der skal kvantificeres. I dette tilfælde blev kalibreringskurverne genereret over 10 forskellige koncentrationer (tabel 2), mindst 6 af som bør være inden for 20% af det lineære område 19. Laveste niveau af påvisning bestemmes som den laveste koncentration, som giver et signal er større end eller lig med 3 x den gennemsnitlige baggrundssignal. Det laveste niveau af kvantificering bestemmes som prøven af laveste koncentration, som giver et signal større eller lig med 10 x den gennemsnitlige baggrundssignal begge er bestemt over mindst 3 uafhængige kørsler med tredobbelte prøver.- Forberede en seriefortynding af en syntetisk metabolit i vævskulturmediet ifølge tabel 2, herunder den interne standard. En endelig volumen på 250 pi pr standard fortynding er tilstrækkelig.
- Fordampe de serielle fortyndinger af standard som beskrevet i step 2.1.2.4 og resuspender i et volumen på 30% acetonitril: vand svarende til volumen af medier før fordampning (fx 250 pi 30% acetonitril: vand, hvis udgangs standard opløsningen var 250 pi medium).
- Tilsæt 250 pi af hver seriefortynding standard til en ravgul UPLC hætteglas til injektion i UPLC-MS autosampler.
- Tilføje testprøverne (250 pi) til ravfarvet UPLC hætteglas og placere dem i UPLC autosampleren.
- Tilfældig alle hætteglassene.
BEMÆRK: massespektrometer konfiguration vi bruges er en hybrid tripel kvadrupol / lineær ion trap massespektrometer koblet til en UPLC detaljeret i Supplemental tabel 1. Andre platforme ville have forskellige software og konfiguration, men ville følge lignende trin for at udføre kvantificering. - Kør UPLC-MS ved anvendelse af de indstillinger, der er beskrevet i Supplemental tabel 1 afhængigt af den specifikke probe at kvantificere.
- Brugden "kvantitering - Byg Kvantificering metode" værktøj i massespektrometer kvantificeringsteknikker værktøjer (tabel of Materials) for at generere kalibreringskurven fra den erhvervede syntetisk standard og intern standard.
- Brug "Kvantificering Wizard" for at vælge prøven parti og prøver at kvantificere og udføre "Kvantificering Method". Massespektrometeret kvantificering softwaren en regneark med kvantificeringsfremgangsmåder værdier af målforbindelsen i hver testprøve.
- Prober under anvendelse Luminescens baserede metoder
BEMÆRK: luminogent sonder til at måle en række CYP aktiviteter er kommercielt tilgængelige; dog ikke alle er egnede til cellebaserede assays. Her, er en protokol præsenteres at måle aktiviteten af CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 blev udvalgt til at illustrere, hvordan at analysere aktiviteten af inducerbare CYP'er og at give et eksempel på, hvordan luminogent prober kan anvendes som en alternative for massespektrometribaseret metoder. Tabel 3 opsummerer den koncentrationer og inkubationstid vi anvendes til luftvejsceller og den hepatiske cellelinie; Men de, måske skal tilpasses til andre celletyper. Andre luminogene prober er kommercielt tilgængelige og kan anvendes som substrater for en række CYP'er.- Forbered tilstrækkeligt med celler til at omfatte en ikke-induceret kontrol, en induceret test, og en induceret + inhibitor test. Et eksempel på en plade layout er vist i figur 5B.
- For at inducere CYP1A1 / 1B1, inkubere cellerne med en slutkoncentration på 10 nM TCDD i medium i en periode på 72 timer (kortere perioder på 24 til 48 timer kan også være egnede).
ADVARSEL: TCDD er kræftfremkaldende og teratogent. Bær passende beskyttelsesudstyr, gennemgå leverandørens MSDS ark og foretage en risikovurdering før brug. - Efter denne periode, fjernes mediet, skylles brøndene med PBS 3 gange, og tilføje nogle frisk medium.
- prior at inkubation af cellerne med det luminogene reporterproben, præ-inkubere den udpegede delmængde af inducerede celler i 30 minutter med en endelig koncentration på 10 uM CYP1A1 / 1B1-inhibitor, α-naphthoflavon, i medium.
- Tilføje det luminogene probe LUC-CEE (Luciferin 6'-chlorethyl ether) ved en slutkoncentration på 50 uM til de ikke-inducerede, inducerede og inducerede + inhibitor-celler.
- Inkuber i 4 timer i en celledyrkningsinkubator. Ved slutningen af inkuberingstiden indsamle medium til kvantificering af det luminogene probe.
- Transfer 25 pi dyrkningsmedium til en hvid plade med uigennemsigtig 96 og tilsættes 25 pi luciferin påvisningsreagens leveret af producenten. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Aflæs pladen straks anvendelse af et luminometer.
- Skyl cellerne med PBS og lysere for totalt protein kvantificering.
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, hvis levende celler bevares til fremtidige eksperimenter. jegt er vigtigt at bemærke dog at inducere såsom TCDD er giftige og vil beskadige cellerne.
- Prober under anvendelse af massespektrometri baserede metoder
Tabel 1: Liste over metaboliske Probes, Produkter, og hæmmere med deres tilsvarende enzym. Molekylvægt og anbefalede koncentrationer anvendt med luftpassagen og leverceller er også angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Foreslået 24 brønde Plate Layout udføres en CYP assay. (A) Den anbefalede layout for CYP'er konstitutivt udtrykte indbefatter en række brønde for blindprøven mediumDen metaboliske probe og den metaboliske probe plus inhibitor. Dette layout kan ganges med antallet af tidspunkter, der bliver testet. (B) eksempel layout til inducerbare CYP'er Den indbefatter en række godt for et medium tom, en metabolisk probe kun kontrol, inducerede celler (fx med TCDD) inkuberet med proberne og inkuberet med proberne og en inhibitor.
Tabel 2: Fortynding af syntetiske standarder, der anvendes til kalibreringskurverne og respektive bestemmelsesgrænseværdier og LOQs. Fortyndingsområdet at bruge kan variere baseret på den massespektrometri platform og følsomhed. Her anvendte vi en hybrid tripel kvadrupol / lineær ion trap massespektrometer koblet til en UPLC. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Tabel 3: luminogent Probe, inducer og hæmmer for CYP1A1 / 1B1-analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Eksempler på metabolisk aktivitet målt for to par CYP'er (CYP1A1 / 1B1 og CYP2A6 / 2A13) i luftvejene cellekulturer fra tre forskellige donorer (luftvejs M360, M370, M417) og den hepatiske cellelinie (Hep linie) er vist i figur 6 20.
CYP-aktivitet målt ved luminometri
Figur 6A viser den relative luminescens produceres af CYP1A1 / 1B1 O-dealkylering aktivitet af Luc-CEE (Luciferin 6'-chlorethyl ether) i luftvejsceller (3 donorer) og leverceller med og uden TCDD induktion. CYP1A1 / 1B1 er meget inducerbare enzymer og er typisk ikke udtrykkes på en konstitutiv niveau i de fleste væv. Som det kan ses i figur 6A, er der ikke luminogent signal detekteres, når cellerne ikke induceres. Når begge celletyper er præinkuberet med TCDD, en stærk CYP1A1 / 1B1 inducer, et mærkeed luminogent signal detekteres sammenlignet med kontrollen (figur 6A). Dette indikerer, at Luc-CEE-proben er blevet metaboliseret førende til frigivelse af luciferin-del, er kvantificeret efterfølgende. Samlet aktiviteten fra TCDD behandlede hepatisk cellelinie er lavere end for de luftvejsceller, selv efter total protein normalisering. Dette er ikke usædvanligt, eftersom cellelinier tendens til at være mindre metabolisk aktive end primære celler. Tilsætning af α-naphthoflavon har en klar inhibitorisk virkning på CYP1A1 / 1B1-aktivitet i alle celletyper, som yderligere bekræfter CYP-afhængighed af Luc-CEE metabolisme.
Kvantificering af CYP450 metabolitter anvendelse UPLC-MS
Figur 6B illustrerer kvantificeringen af CYP2A6 / 2A13 aktivitet i luftvejsceller fra 3 donorer (Airway M343, M345, M347) og leverceller (Hep linie) efter inkubering med coumarin i nærvær og fravær af inhiBitor 8-methoxypsoralen. Dataene normaliseres for totalt protein. I 0 min cumarin inkubation kontrol, der ikke registreres 7-hydroxycoumarin (figur 6B). CYP2A6 / 2A13 udtrykkes konstitutivt i visse væv og derfor efter 16 timers inkubering med coumarin dannelse af 7-hydroxycoumarin er påvist i de forskellige testede celletyper, selv uden induktion. Når 8-methoxypsoralen tilsættes et CYP2A inhibitor (figur 6B), er dannelsen af 7-hydroxycoumarin betydeligt reduceret.
Det skal bemærkes, at i nærværelse af CYP inhibitor, er det normalt at stadig finde nogen resterende aktivitet som inhibering er sjældent fuldstændig og da andre CYP'er også kunne være i stand til at genkende substratet, men behandle det langt mindre effektivt. Det kan også bemærkes, at de registrerede metabolisk aktivitet kan være forskellig mellem donorerne ved brug primære celler, som det er synligt for CYP2A6 i luftvejsceller(Figur 6B). Dette forventes som CYP-aktivitet er ansvarlig for hver donor genotype og polymorfier.
Figur 6: aktivitetsassay Resultat for CYP1A1 / 1B1 Activity (A) og CYP2A6 / 2A13 aktivitet (B) i Nedsat Cell Line og i tredje Airway Cell Donorer (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkylering aktivitet er vist med og uden induktion af CYP1A1 / 1B1 af TCDD. α-naphthoflavon blev anvendt som CYP1A1 / 1B1 inhibitor. Aktivitet udtrykkes som relative luminescensenheder (RLU) normaliseret ved inkubation i minutter (min) og totalt protein (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ikke kræver induktion som de udtrykkes konstitutivt. Coumarin 7-hydroxyleringsaktivitet i pmol / min / mg proteiner er vist ved forskellige tidspunkter med og uden inhibitoren 8-methoxypsoralen. Alle resultater er præsenteret som en middelværdi af tre uafhængige målinger med standardafvigelser af middelværdien. Dette tal blev modificeret fra Baxter 20.
Supplerende Tabel 1: UPLC og massespektrometer indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I øjeblikket er mange standardiserede toksikologiske testsystemer bruge gensplejsede bakterier, cellelinjer, eller embryonale celler, som ikke er repræsentative for den normale menneskelige stofskifte 1. Dette kan føre til unøjagtige forudsigelser af den potentielle toksiske aktivitet af en kemisk eller medicin. Innovative in vitro modeller, såsom 3D-cellekulturer og organ på en chip, der udvikles i et forsøg på bedre at replikere den normale morfologi og metabolisk aktivitet af humane væv 21, 22, 23. Metabolisk kompetence er et kriterium, der kan anvendes til at dechifrere hvilke modeller er bedst egnet til toksikologiske undersøgelser vurdering og lægemiddel biotransformation.
Protokollen vi har skitseret i dette papir er designet til at måle aktiviteten af CYP-enzymer ved hjælp af levende celler. Den er fleksibel og kan anvendes til forskellige cellesystemer i 2D- eller 3D-cultures og giver mulighed for at bruge enten en luminogent probe- eller en massespektrometri-baseret tilgang. Begge metoder er følsomme nok til at opdage nanogram mængder af materialer og kræver kun et lille antal celler dyrket i et flere brønde format. De kan også anvendes til sfæroid eller celler dyrket i komplekse matricer. Udvælgelsen af sonden substratet er tydeligvis et kritisk element af protokollen. Specificiteten af assayet beror på proben være selektiv for CYP-enzym og et andet lag af sikkerhed kan opnås ved anvendelse af en selektiv CYP inhibitor. De substrater og inhibitorer, der er anført i dette papir er blot et par eksempler, men andre kan findes i litteraturen.
Det er vigtigt at overveje flere inkuberingstider når man arbejder med en ny celletype som en negativ CYP aktivitet resultat kunne skyldes enzymet, der udtrykkes på et lavt niveau. Tilsætningen af en celletype, der kan anvendes som en positiv kontrol er tilrådeligt at sikre, at ennegativt resultat er ikke knyttet til et teknisk spørgsmål og til at hjælpe med enhver fejlfinding. Primære leverceller er metabolisk kompetente og kan bruges som kontrol, for eksempel primære hepatocytter i suspension er meget nemme at bruge, men deres levedygtighed er begrænset i tid. Hepatiske cellelinier er mulige alternativer, som er relativt let at bruge som beskrevet i denne protokol, men nogle er bedre end andre, hvad angår metaboliske aktivitet 6, 21.
Da assayet er ikke-destruktiv, medmindre totalt protein kvantificeres, er det muligt at følge CYP-aktivitet over tid i længdesnitsundersøgelser 20. Dette er et vigtigt punkt, fordi nogle celler vil have variabel CYP-aktivitet over tid i kulturen. Et negativt resultat kan være forbundet med manglen på konfluens fremskridt med differentieringen eller dedifferentiering in vitro. I så fald, tilgangen er semi-quantitative da data ikke normaliseres ved den totale mængde af protein i hver celle kultur. Det er ikke altid muligt eller anbefalet at genbruge vævet efter måling af CYP-aktivitet som eksponering for prober, hæmmere eller induktorer kan have en toksisk virkning på væv som det er tilfældet for TCDD.
Cellefraktioner, såsom mikrosomer kunne også anvendes til at karakterisere CYP-aktivitet af en given celletype. Mikrosomekstrakter præparater kræver imidlertid en masse cellemateriale, tilsætning af tilstrækkelige cofaktorer og buffer for at sikre, at enzymerne forbliver aktive. Ved hjælp af levende celler eliminerer tricky mikrosom forberedelse trin og arbejder ud som buffere og cofaktorer fungerer bedst.
Som en generel anbefaling, er det en god praksis for yderligere at karakterisere ekspressionsprofilen af CYP'er i cellekulturer at kontrollere, at det passer til den enzymatiske aktivitet. Denne ekstra niveau af kontrol er anbefales, da de metaboliske sonder ikke er Entipåberåbe specifik for en enkelt CYP og det giver øget tillid til, at den målte metaboliske aktivitet modsvares af det tilsvarende enzym-ekspression. Da CYP'er er membranproteiner de er relativt vanskelige at fremstille til western blots, derfor kvantitativ RT-PCR har været den foretrukne metode til at profilere disse enzymer 20.
Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol beskriver en fremgangsmåde til assay CYP enzymaktivitet, som kun repræsenterer en familie af metaboliske enzymer, omend vigtig. Fleksibiliteten i et massespektrometri metode tillader udviklingen af erhvervelse metoder til andre metaboliske omdannelser af probesubstrater. Men de skal udvikles en ad gangen, og der er i øjeblikket færre kendte specifikke prober og selektive inhibitorer for andre metaboliske enzymer familier. Denne kløft bør behandles for at muliggøre en samlet vurdering af den metaboliske kompetence in vitro celle systeFrk.
Disclosures
AB og EM var ansat i British American Tobacco på det tidspunkt dette manuskript blev skrevet. Beskrevet i dette manuskript arbejde blev finansieret af British American Tobacco, og offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af British American Tobacco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E.
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
