Summary
Compétence métabolique des systèmes in vitro est une condition essentielle pour la biotransformation et l' élimination des médicaments et produits toxiques. Dans ce protocole, nous décrivons l'application des sondes métaboliques de référence pour évaluer métabolisme de phase I dans les cultures cellulaires.
Abstract
enzymes métabolisant des xénobiotiques jouent un rôle clé dans la biotransformation de médicaments et de substances toxiques en ajoutant des groupes fonctionnels qui augmentent la solubilité et faciliter l'excrétion. À certaines occasions, ces modifications structurelles conduisent à la formation de nouveaux produits toxiques. Afin de réduire les tests sur les animaux, le risque chimique peut être évaluée en utilisant des cellules métaboliquement compétentes. L'expression des enzymes métaboliques, cependant, ne sont pas stables dans le temps dans de nombreux systèmes in vitro de culture primaire et est souvent partielle ou absente dans des lignées cellulaires. Par conséquent, l'étude des médicaments, des additifs et le métabolisme des polluants de l' environnement in vitro devrait idéalement être réalisée dans des systèmes cellulaires où l' activité métabolique a été caractérisée. Nous expliquons ici une approche pour mesurer l'activité d'une classe d'enzymes métaboliques (phase I humaine) dans des lignées cellulaires 2D et 3D cultures primaires utilisant des sondes chimiques et leurs produits métaboliques quantifiables par spectrométrie de masse et UPLCluminométrie. Le procédé peut être mis en oeuvre pour tester l'activité métabolique dans des lignées cellulaires et des cellules primaires dérivées d'une variété de tissus.
Introduction
Le métabolisme des xénobiotiques est le processus par lequel des produits chimiques étrangers au corps sont modifiés par l'ajout de groupes hydrophiles et conjugués pour faciliter leur excrétion 1. Typiquement , le métabolisme des xénobiotiques est un processus en deux étapes avec la première phase composée principalement d'une oxydation avec l'addition d'un ou plusieurs groupes hydroxyle, 1 2. Lors de la phase II, les groupes hydroxyle sont utilisés comme accepteurs pour un conjugué hydrophile tel que le glucuronide ou un groupement sulfate 1, 2. Si un groupe accepteur est déjà présent sur les molécules, l'étape de conjugaison peut se produire indépendamment du métabolisme de la phase I. Chaque réaction est réalisée par un groupe d'enzymes spécifiques, par exemple, CYP (cytochromes P450), qui catalysent l'hydroxylation (Figure 1) et la désalkylation de substrats chimiques 3. Conjugation est catalysée par des sulfotransférases, UDP-glucuronosyltransferases (figure 1), la glutathion-S-transférases et les N-acétyltransférases 4. Chaque tissu et organe auront un profil d'expression de l'enzyme métabolique spécifique, avec le foie exprimant la plupart de ces protéines.
Figure 1: Exemple de phase I et de métabolisme de la coumarine Phase II. CYP2A6 / CYP2A13 catalyser la 7-hydroxylation de la coumarine. 7-hydroxycoumarine est conjugué à un fragment glucuronide par des enzymes de phase II UGT, avec UGT1A6 et UGT1A9 montrant la plus forte activité.
Comprendre le métabolisme des xénobiotiques est essentiel dans l'évaluation de l'innocuité des médicaments et pour l'évaluation des risques chimiques pour deux raisons: la cinétique de réaction détermineront combien de temps un médicament ou chimique restent dans le corps sous une forme active ou inactive bexcrétion vant; et le composé d'origine peut être modifié pour une espèce plus réactive, instable et toxique par des enzymes métaboliques. De telles réactions aussi connu sous le nom « bioactivation » sont principalement motivés par la phase I CYP enzymes mais aussi plus rarement par la conjugaison de phase II 5.
Sur cette base, la capacité d'un modèle in vitro pour prédire avec précision le risque associé à un médicament ou d' un produit chimique est très dépendante de la compétence métabolique du système cellulaire. Les lignées cellulaires dérivées de tissus malades ou de la transformation de cellules normales perdent souvent partie sinon la totalité du représentant de profil d'enzyme métabolique de leur tissu d'origine 6. Le maintien du profil d'enzyme métabolique normal apparaît mieux dans les cultures de cellules primaires (au moins dans des cultures à court terme) et est encore améliorée si le tissu est mis en culture dans une matrice qui lui permet de conserver sa structure 3D 1. Par conséquent, l'omble chevalieracterization de la compétence d'un système métabolique cellulaire in vitro est une étape préliminaire importante pour guider la décision en ce qui concerne le modèle de la cellule est appropriée pour effectuer des évaluations de sécurité chimique.
Dans cet article , nous présentons un protocole de profil de l'activité et de l' expression des enzymes de phase I CYP in vitro avec des exemples de leur application avec une lignée de cellules hépatiques et 7 des cultures de cellules pulmonaires primaires 3D 8. CYP substrats spécifiques, leurs produits métaboliques et l'inhibiteur de contrôle sont décrits avec spectrometry- de masse et des méthodes de quantification sur la base luminogène. Étant donné que certains CYP sont inductibles et d'autres sont constitutives, des exemples seront également donnés pour ces deux scénarios.
Protocol
REMARQUE: Le flux de travail général pour le dosage de l' activité métabolique est décrite dans la figure 2. Chaque étape de ce flux de travail est ensuite détaillée dans les prochains paragraphes. Des tableaux détaillés de réactifs et de l' équipement sont donnés dans la Table des Matières.
Figure 2: Flux de travail pour le dosage de la sonde métabolique. Les cellules sont ensemencées et cultivées à une densité adéquate. Une CYP étape d'induction peut être nécessaire en fonction de l'activité enzymatique dosées. Le substrat de la sonde et de l'inhibiteur est ajouté à la culture cellulaire. Après une période d'incubation, le milieu est collecté pour analyse et les cellules sont lysées pour la quantification des protéines. Le milieu est traité pour l'analyse du produit métabolique du substrat de sonde par spectrométrie de masse ou luminométrie.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg » target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
1. Culture cellulaire
Figure 3: Transmission de la lumière micrographie d'une culture lignée cellulaire hépatique. La lignée cellulaire décrite dans ce protocole 5 différencier typiquement avec 50% de clivage entre cholangiocytes et les hépatocytes en culture (100x). Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- La culture de lignée de cellules hépatiques
NOTE: Une lignée cellulaire hépatique disponible dans le commerce a été utilisé comme un exemple de cellules compétentes métaboliquement. La lignée cellulaire a été dérivé d'un hépatocarcinome provoquée par une infection virale 7. A la confluence, cette lignée cellulaire se différencie en cellules cholangiocyte- et de type hépatocytes (Figure 3) et d' autres détails peuvent être trouvés dans Guillouzo 7. L'inclusion de 2% de DMSO dans le milieu de la culture soutient la différenciation de cette lignée cellulaire et l'expression d'une variété de CYP.- Retirer les flacons cryogéniques avec des cellules de l'azote liquide et placer sur de la glace sèche pour le transport. Transférer le cryotube dans un bain d'eau préchauffé à 37 ° C pendant 1 à 2 min, et stériliser à l'extérieur du flacon avec 70% d'éthanol avant de le placer dans une hotte à flux laminaire.
- En travaillant dans des conditions stériles, ouvrir soigneusement le flacon cryogénique pour libérer toute surpression et la pipette le contenu de la fiole cryogénique dans un tube de 10 mL rempli de 9 ml de milieu E de Williams préchauffé à 37 ° C.
- Centrifuger la solution pendant 10 minutes à 400 xg à la température ambiante, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml demilieu de décongélation propriétaire pré-chauffé à 37 ° C, additionné de glutamine ou d'un supplément de glutamine (2 mM de concentration finale) (Williams E + supplément de glutamine + suppléments de dégel).
- Compter les cellules viables en utilisant une portion aliquote de 500 uL avec un compteur de cellules ou toute autre technique de comptage de cellules approprié.
- Ensemencer les cellules dans une plaque revêtue de collagène de 24 puits à une densité de 0,6 x 10 6 cellules viables / puits dans un volume final de 0,5 ml de milieu de décongélation.
- Placer la plaque (s) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% / 95% CO 2 / air et 100% d' humidité relative.
- 24 h après l'ensemencement des cellules, remplacer le milieu par 0,5 ml de milieu de travail de maintenance / métabolisme préchauffé (Williams E + supplément de glutamine + supplément de métabolisme (ce milieu contient déjà DMSO)). Changer le support tous les deux jours.
- Après quelques jours de culture , les cellules forment une structure trabéculaire sous-confluentes (Figure 3). Le métabolisme optimuml'activité est typiquement observée entre les jours 7 et 10 et est la plus faible au jour 4.
Figure 4: Coupe transversale de Alcian colorées en bleu cellules Airway Grown à l'interface liquide-air 8.
Ciliées, la production de mucus et les cellules basales sont clairement visibles. Barre d'échelle = 250 um.
- Différentiées cultures de l' épithélium des voies respiratoires
NOTE: Le protocole est représentée par un épithélium des voies respiratoires primaires totalement différenciées disponible dans le commerce cultivées à l'interface air-liquide sur un insert 8 (Figure 4). La culture de tissu conserve un phénotype mucociliaire et la polarité de la cellule 8. Les cellules peuvent être d'origine nasale ou bronchique. Ici, utiliser des cellules nasales humaines. Les cellules sont livrées sur un format de plaque de culture avec 24insère à l'interface air-liquide. Pour faciliter le transport et éviter tout déversement moyen les inserts sont livrés avec la section de base dans une matrice d'agarose mélangé avec un milieu de culture.- Lors de la livraison des cellules, stériliser les plaques contenant les inserts 24 avec une solution d'éthanol à 70% avant de le placer dans une hotte à flux laminaire propre.
- Préparer une plaque à 24 puits stérile en ajoutant préchauffé à 700 ul de milieu de culture exclusive.
- Utilisation de pinces stériles transférer les inserts cellulaires pour la nouvelle plaque pré-chargée avec un milieu en délogeant doucement l'insert de la matrice d'agarose.
- Placer la plaque (s) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% / 95% CO 2 / air et 100% d' humidité relative.
- Tous les 2 jours transférer les inserts à une nouvelle stérile plaque de 24 puits pré-chargé avec 700 ul chaud milieu de culture cellulaire des voies aériennes propriétaire.
- Évaluer l'intégrité du tissu des voies respiratoires en utilisant des méthodes telles que la résistance trans-épithéliale (TEER), oufréquence de battement des cils (CBF) en utilisant un microscope équipé d'un système d'imagerie vidéo en direct 9. La mesure de la TEER et CBF est décrite dans Kuehn 10.
2. CYP Activité Quantification dans les cultures cellulaires
NOTE: En règle générale, les solvants tels que le DMSO et le méthanol peuvent être utilisés pour préparer des solutions mères pour les différentes sondes métaboliques et les inhibiteurs présentés dans le présent document. Toutefois, il est recommandé de maintenir la concentration finale de DMSO dans le milieu de culture à un minimum (1% ou moins) étant donné que des concentrations élevées peuvent inhiber les enzymes métaboliques. Lorsque cela est possible, il est également recommandé d'utiliser un milieu exempt de rouge de phénol libre et du sérum au cours de l'incubation avec des sondes métaboliques depuis le rouge de phénol peut interférer avec les CYP et l'activité de l'enzyme de phase II et le composant de sérum telles que l'albumine peut réduire la disponibilité de la sonde. Il est pas toujours possible de respecter strictement ces des lignes directrices. Par exemple, le milieu de culture cellulaire des voies aériennes est propriétaire et contient le rouge de phénol. Milieu de métabolisme propriétaire de la lignée cellulaire hépatique 7 contient déjà plus de 1% de DMSO comme il est requis pour les cellules à adopter le phénotype d'hépatocytes-like.
NOTE: Enfin, ici, la sonde spécifique terme / inhibiteur est utilisé , mais cette terminologie doit être considérée avec prudence. En effet, il est très rare pour une sonde métabolique soit une enzyme substrat exclusive. Les sondes décrites ici, cependant, ont une forte affinité pour leur cible enzymatique et sont donc considérés comme des marqueurs fiables de l'activité.
- Sondes métaboliques, inducteurs et inhibiteurs
- Les sondes en utilisant des méthodes à base de spectrométrie de masse
REMARQUE: Les sondes et les inhibiteurs décrits dans cette section sont appropriées pour tester l'activité de CYP2As 11, 12 CYP1A2,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16 et CYP2E1 17 par spectrométrie UPLC-masse. Les sondes, les inhibiteurs et correspondant CYP sont décrits dans le tableau 1 avec les références correspondantes. Le tableau 1 indique également le produit métabolique du CYP activité qui est quantifiée par spectrométrie de masse. tous les travaux impliquant la culture des tissus et des solutions pour une utilisation dans la culture de tissu doit être réalisée dans une hotte de culture tissulaire stérile. une solution mère peut être préparée dans le DMSO pour tous les substrats de sonde.- Avant l'expérience de préparer deux séries d'inserts cellulaires ou dans les puits, en utilisant une série pour l'expérience d'inhibition, l'autre pour la sonde métabolique uniquement. Préparer une troisième série de cellules en tant que témoin à blanc moyen. Ils peuvent être sur des plaques séparées ou dans les mêmes plaques avec un minimum de trois répétitions. Un exemple de la plaque étaitout est présenté sur la figure 5.
- Le jour de l'expérience, remplacer le milieu de culture cellulaire avec 450 ul de milieu frais.
- Préparer dans une hotte stérile, une concentration 10 fois des solutions suivantes en utilisant le milieu de culture cellulaire. Mélanger la sonde de 10x CYP, 10x inhibiteur de CYP et l'inhibiteur de CYP 10x 10x ainsi que sonde.
NOTE: les solutions mères de maîtrise de l' inhibiteur et la sonde peuvent être préparées dans 100% de DMSO (par exemple, 1000 X stocks) et en outre dilué dans du milieu pour obtenir une solution 10x pour éviter une concentration finale en DMSO de plus de 1% de la culture cellulaire . Les concentrations finales 1x qui sont destinées à l'incubation avec les cellules sont présentés dans le tableau 1. - Filtrer la solution de sonde différente 10x avec un filtre à seringue de 0,2 um.
- Ajouter 50 ul de milieu contenant l'inhibiteur de CYP 10x à la série de cellules préparées pour l'essai d'inhibition et de pré-incuber pendant 30 min.
- REPlacez le moyen de cellules dans la série d'inhibition avec 450 ul de milieu frais et ajouter 50 ul de milieu contenant à la fois 10x inhibiteur de CYP et le substrat de sonde 10x.
- Ajouter les autres cellules 50 pl de milieu avec le substrat de sonde 10x et ajouter une quantité équivalente de véhicule dilué dans du milieu (par exemple, DMSO) aux commandes de cellule vide , comme indiqué sur la figure 5.
- Incuber les cellules pendant 0-5 min (temps 0, le contrôle d'arrière-plan) et 16 h dans l'incubateur de cellules.
NOTE: Ce temps d'incubation a été utilisé avec succès avec les cellules des voies respiratoires et la lignée cellulaire hépatique; Cependant hépatocytes primaires fraîches ont une haute compétence métabolique, en attendant la qualité de la préparation cellulaire et la constitution génétique du donneur, donc des temps plus courts (par exemple, 2-4 h) pourrait convenir. Il est toujours recommandé d'effectuer une expérience au cours du temps lors du test de différentes lignées cellulaires ou des types de cellules. - A la fin de la période d'incubation, collect le milieu dans des tubes marqués séparés pour la quantification du produit métabolique des sondes. Geler le moyen pour un traitement ultérieur.
- Lyser les cellules pour la quantification des protéines.
NOTE: Tout kit de quantification de protéine standard et le protocole est adapté à cette étape. BCA est une option appropriée. Cette étape est facultative si les cellules doivent être utilisées dans un autre essai.
- traitement moyen
NOTE: Le milieu recueilli à partir du stade d'incubation contient le produit chimique de la sonde mère ainsi que ses produits métaboliques. Pour mesurer une activité spécifique CYP seulement le produit de la réaction catalysée par le CYP d'intérêt doit être quantifié. le métabolisme des produits du métabolisme de phase I sont souvent traitées en tandem avec la phase II (conjugaison) et ne peuvent donc pas être détectées en tant que tel. Ainsi, afin d'obtenir la quantification plus précise d'une activité de CYP, une étape de deconjugation est nécessaire pour enlever toutmodification du métabolisme de phase II. Depuis la conjugaison de métabolites de phase I implique souvent glucuronidation ou sulfatation, deconjugation est obtenue par traitement des échantillons par glucuronidases et sulfatases 18. Glucuronidase et l'activité de sulfatase est dépendante du pH avec une activité glucuronidase la plus élevée étant réalisée à un pH de 4,5-5,0 et l'activité sulfatase étant le plus élevé à un pH de 6,0-6,5. Par conséquent, cette étape nécessite l'ajustement du pH. Dans la méthode décrite ici, on mesure le pH en utilisant des bandes de pH pour des raisons pratiques, car la plupart des sondes de pH mètre ne rentrent pas dans un tube de 1,5 ml. On peut trouver des bandes pH disponibles dans le commerce avec une résolution aussi faible que 0,3 à 0,2 unités de pH.- Transférer 250 pl de milieu d'incubation dans un microtube de 1,5 ml et ajouter une solution interne magasin standard 4-méthylumbelliférone pour atteindre une concentration finale de 100 nM.
- Ajuster le pH du milieu à 4,5-5,0 par addition de 1 M HCl. Ajouter 1 pi de HCl à un moment et vérifier le pHpar pipetage 2 uL de milieu sur une bande de pH. Atteindre un pH de 5,0 serait typiquement ne nécessitent pas plus de 5-10 pi de 1 M HCl.
- Ajouter 150 unités (1,8 pi d'une unité 85000 / ml de bouillon) de β-glucuronidase / arylsulfatase de Helix pomatia et incuber pendant 1 h à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 250 uL de methanol froid (-20 ° C). Stocker les échantillons à -20 ° C ou plus.
- On évapore le solvant en utilisant une centrifugeuse sous vide à 45 ° C. Reconstituer les échantillons avec 500 pi d'un 30% d'acétonitrile: solution aqueuse. Les échantillons sont prêts pour l'analyse par spectrométrie de masse et peuvent être conservés à -20 ° C dans des flacons en verre ambré.
- Quantification basée sur la spectrométrie de masse
REMARQUE: Tous les paramètres UPLC et spectromètre de masse sont détaillés dans le tableau dédié supplémentaire 1. Pour une analyse quantitative, l'établissement d'une courbe d'étalonnage est nécessaire. le calicourbe de bration est obtenue en exécutant une gamme de dilution connue du composé à quantifier. Dans ce cas, les courbes d'étalonnage ont été générées en 10 concentrations différentes (tableau 2), au moins six de ce qui devrait être de 20% de la plage linéaire 19. Le plus bas niveau de détection est déterminée comme la concentration la plus faible qui donne un signal plus grand que, ou égal à 3 fois le signal de fond moyen. Le niveau le plus bas de quantification est déterminée comme étant l'échantillon de concentration la plus faible qui donne un signal supérieur ou égal à 10 fois le signal de fond moyenne qui sont toutes deux déterminées sur au moins 3 passages indépendants avec des échantillons en triple.- Préparer une dilution en série d'un métabolite synthétique dans le milieu de culture de tissu selon le tableau 2, y compris l'étalon interne. Un volume final de 250 pi par dilution standard est suffisante.
- S'évaporer les dilutions en série de la norme comme décrit dans step 2.1.2.4 et remettre en suspension dans un volume de 30% d' acétonitrile: eau équivalent au volume de support avant évaporation (par exemple, 250 ul de 30% d' acétonitrile: eau si la solution étalon de départ était de 250 ul de milieu).
- Ajouter 250 pi de chaque norme de dilution en série à un flacon en verre ambré UPLC pour injection dans le passeur d'échantillons UPLC-MS.
- Ajouter les échantillons d'essai (250 pi) à ambre flacons UPLC et les placer dans le passeur d'échantillons UPLC.
- Randomisez tous les flacons.
REMARQUE: La configuration du spectromètre de masse , nous avons utilisé est un spectromètre de masse à piège à ions quadripolaire / linéaire triple hybride couplé à un UPLC détaillé dans le tableau 1 supplémentaire. D'autres plates-formes seraient différents logiciels et la configuration, mais suivraient des mesures similaires pour effectuer la quantification. - Exécuter le UPLC-MS en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 1 supplémentaire en fonction de la sonde spécifique à quantifier.
- Utilisationle « quantifier - Construction Méthode de quantification » outil dans des outils de quantification de spectromètre de masse (Table des Matières) afin de générer la courbe d'étalonnage à partir de la norme synthétique acquis et étalon interne.
- Utiliser le « Quantification Assistant » pour sélectionner le lot d'échantillons et des échantillons à quantifier et à exécuter la « méthode de quantification ». Le logiciel de quantification de spectromètre de masse affiche une feuille de calcul avec les valeurs de quantification du composé cible dans chaque échantillon de test.
- Les sondes en utilisant des méthodes à base de Luminescence
REMARQUE: sondes pour mesurer luminogènes une gamme d'activités CYP sont disponibles dans le commerce; Cependant, tous ne sont pas appropriés pour des essais à base de cellules. Ici, un protocole est présenté pour mesurer l'activité des CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 a été choisi pour illustrer la façon de doser l'activité de CYP inductibles et pour donner un exemple de la façon dont les sondes luminogène peut être utilisé comme un alternatif de méthodes basées sur la spectrométrie de masse. Le tableau 3 résume les temps d'incubation et de concentrations , nous avons utilisé des cellules des voies respiratoires et la lignée de cellules hépatiques; Cependant, ceux qui pourraient être adaptées pour d'autres types de cellules. D'autres sondes luminogènes sont disponibles dans le commerce et peuvent être utilisés comme substrats pour une variété de CYP.- Préparer suffisamment de cellules pour inclure un contrôle non induit, un test induit, et un inhibiteur induit + test. Un exemple d'une disposition de la plaque est représentée sur la figure 5B.
- Pour induire CYP1A1 / 1B1, incuber les cellules avec une concentration finale de 10 nM TCDD dans un milieu pendant une période de 72 h (de courtes périodes de 24 à 48 h peut également convenir).
ATTENTION: TCDD est un agent cancérigène et tératogène. Porter un équipement de protection adéquat, consultez la fiche signalétique du fournisseur et d'effectuer une évaluation des risques avant utilisation. - Après cette période, éliminer le milieu, rincer les puits avec du PBS 3 fois, et ajouter un peu de milieu frais.
- Prior à l'incubation des cellules avec la sonde rapporteuse luminogène, pré-incuber le sous-ensemble désigné de cellules induites pendant 30 minutes avec une concentration finale de 10 uM CYP1A1 / inhibiteur 1B1, α-naphtoflavone, dans un milieu.
- Ajouter la sonde luminogène LUC-CEE (luciférine éther 6'-chloroéthyl) à une concentration finale de 50 uM à la non-induites, induites et induites par des cellules + inhibiteur.
- 4 h Incuber dans un incubateur de culture cellulaire. A la fin de la période d'incubation recueillir le moyen pour la quantification de la sonde luminogène.
- Transfert 25 pi de milieu de culture à un blanc opaque plaque 96 puits et ajouter 25 pi de réactif de détection de luciférine fourni par le fabricant. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Lire la plaque immédiatement à l'aide d'un luminomètre.
- Rincer les cellules avec du PBS et lyser pour la quantification des protéines totales.
REMARQUE: Cette étape est facultative si les cellules vivantes sont conservées pour des expériences futures. jet est toutefois important de noter que Inducteurs tels que TCDD sont toxiques et peuvent endommager les cellules.
- Les sondes en utilisant des méthodes à base de spectrométrie de masse
Tableau 1: Liste des sondes métaboliques, les produits et les inhibiteurs de l' enzyme avec leur correspondant. poids moléculaire et les concentrations recommandées utilisées avec les voies aériennes et les cellules hépatiques sont également indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Suggestion 24 puits Mise en plaque pour effectuer un dosage CYP. (A) La mise en page recommandée pour CYP constitutivement exprimées comprend une série de puits pour le support vierge, La sonde métabolique, et la sonde métabolique inhibiteur de plus. Cette disposition peut être multipliée par le nombre de points de temps qui sont mis à l'essai. (B) La mise en page par exemple pour CYP inductibles comprend une série de puits pour un flan moyen, une sonde de contrôle métabolique uniquement, les cellules induites (par exemple, avec TCDD) mis en incubation avec les sondes et mises en incubation avec les sondes et un inhibiteur.
Tableau 2: Dilution des normes synthétiques utilisées pour les courbes d'étalonnage et LOD et LOQ respectifs. La gamme de dilution à utiliser peut varier en fonction de la plate-forme de la spectrométrie de masse et de sensibilité. Ici, nous avons utilisé un spectromètre de masse à piège à ions quadripolaire / linéaire triple hybride lié à un UPLC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
Tableau 3: Sonde luminogènes, et Inhibiteur pour Inducer CYP1A1 / 1B1 dosage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Representative Results
Des exemples de l' activité métabolique mesurées pour deux paires de CYP (CYP1A1 / 1B1 et CYP2A6 / 2A13) dans les cultures de cellules des voies respiratoires provenant de trois donneurs différents (voies aériennes M360, M370, M417) et la lignée cellulaire hépatique (ligne Hep) sont représentés sur la figure 6 20.
Activité CYP mesurée par luminométrie
La figure 6A montre la luminescence par rapport produit par le CYP1A1 / 1B1 activité O-désalkylation de Luc-CEE (luciférine éther 6'-chloroéthyl) dans les cellules des voies respiratoires (3 donneurs) et des cellules hépatiques avec ou sans induction TCDD. CYP1A1 / 1B1 sont des enzymes très inductibles et ne sont généralement pas exprimé à un niveau constitutif dans la plupart des tissus. Comme on peut le voir sur la figure 6A, aucun signal luminescent est détectée lorsque les cellules ne sont pas induits. Lorsque les deux types de cellules sont pré-incubées avec TCDD, un puissant inducteur du CYP1A1 / 1B1, une marquele signal ED est détectée par rapport au témoin (figure 6A). Ceci indique que la sonde Luc-CEE a été métabolisé conduisant à la libération de la fraction de la luciférine, qui est quantifié par la suite. Dans l'ensemble de l'activité de la lignée cellulaire hépatique traitée TCDD est plus faible que pour les cellules des voies respiratoires, même après la normalisation des protéines totales. Ce n'est pas rare puisque les lignées cellulaires ont tendance à être moins actives que les cellules métaboliquement primaires. L'addition d'α-naphtoflavone a un effet inhibiteur net sur l'activité CYP1A1 / de 1B1 dans tous les types cellulaires qui confirme en outre l'CYP-dépendance du métabolisme Luc-CEE.
Quantification des métabolites du CYP450 en utilisant UPLC-MS
La figure 6B illustre la quantification de l' activité de la CYP2A6 / 2A13 dans les cellules des voies respiratoires de 3 donneurs (Airway M343, M345, M347) et des cellules hépatiques (ligne Hep) après incubation avec de la coumarine en présence et en absence de l'INHIbitor 8-méthoxypsoralène. Les données sont normalisées pour la protéine totale. Dans le contrôle d'incubation de coumarine 0 min, on ne détecte 7-hydroxycoumarine (Figure 6B). CYP2A6 / 2A13 sont exprimés de manière constitutive dans certains tissus et donc après 16 h d'incubation avec la formation de la coumarine de la 7-hydroxycoumarine est détectée dans les différents types de cellules testées, même sans induction. Lorsque 8-méthoxypsoralène, un inhibiteur de la CYP2A est ajouté (Figure 6B), la formation de la 7-hydroxycoumarine est considérablement réduit.
Il convient de noter que, en présence de l'inhibiteur de CYP, il est normal de détecter encore une activité résiduelle d'inhibition est rarement complète et que d'autres CYP pourrait également être en mesure de reconnaître le substrat, mais le traiter beaucoup moins efficace. On peut aussi observer que l'activité métabolique enregistrée peut être différente entre les bailleurs de fonds lors de l'utilisation des cellules primaires comme il est visible CYP2A6 dans les cellules des voies respiratoires(Figure 6B). Cela devrait l'activité CYP est responsable au génotype de chaque donneur et polymorphismes.
Figure 6: Dosage de l' activité de résultats pour l' activité CYP1A1 / 1B1 (A) et l' activité de la CYP2A6 / 2A13 (B) dans la lignée de cellules hépatiques et en trois voies aériennes donneurs de téléphone mobile (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE activité de désalkylation est disponible avec et sans induction de CYP1A1 / 1B1 par TCDD. α-naphtoflavone a été utilisé comme inhibiteur de CYP1A1 / de 1B1. L'activité est exprimée en unités de luminescence relatives (RLU) normalisée par la durée d'incubation en minutes (min) et de la protéine totale (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ne nécessitent pas l' induction car ils sont exprimés constitutivement. Coumarine activité 7-hydroxylation en protéines pmol / min / mg est représenté à différents points de temps avec ou sans l'inhibiteur de 8-methoxypsorAlen. Tous les résultats sont présentés comme une valeur moyenne de trois mesures indépendantes avec des écarts types de la moyenne. Ce chiffre a été modifié de Baxter 20.
Tableau supplémentaire 1: UPLC et Spectromètre de masse Paramètres. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
À l' heure actuelle, de nombreux systèmes de test toxicologiques standardisés utilisent des bactéries Engineered, des lignées cellulaires ou des cellules embryonnaires qui ne sont pas représentatives du métabolisme humain normal 1. Cela peut conduire à des prévisions inexactes de l'activité potentielle toxique d'un produit chimique ou de la médecine. Innovante dans les modèles in vitro, tels que des cultures de cellules 3D et organes sur une puce, sont en cours d' élaboration dans le but de mieux reproduire la morphologie normale et l' activité métabolique des tissus humains 21, 22, 23. compétence métabolique est un critère qui peut être utilisé pour déchiffrer les modèles sont mieux adaptés pour une évaluation toxicologique et des études biotransformation des médicaments.
Le protocole que nous avons décrit dans le présent document est conçu pour mesurer l'activité des enzymes CYP en utilisant des cellules vivantes. Il est flexible et peut être utilisé pour les systèmes cellulaires différents cultur 2D ou 3Des et offre la possibilité d'utiliser un Probe- ou luminogène une approche basée sur la spectrométrie de masse. Les deux méthodes sont assez sensibles pour détecter des quantités de nanogrammes de matériaux et ne nécessitent qu'un petit nombre de cellules cultivées dans un format multipuits. Ils peuvent également être appliqués à sphéroïde ou des cellules cultivées dans des matrices complexes. Le choix du substrat de sonde est évidemment un élément critique du protocole. La spécificité du dosage repose sur la sonde étant sélective de l'enzyme CYP et une autre couche d'assurance peut être obtenue par l'utilisation d'un inhibiteur de CYP sélective. Les substrats et inhibiteurs mentionnés dans le présent document ne sont que quelques exemples, mais d'autres se trouvent dans la littérature.
Il est important de considérer plusieurs temps d'incubation lorsque vous travaillez avec un nouveau type de cellule à la suite de l'activité de CYP négative pourrait être due à l'enzyme exprimée à un faible niveau. L'ajout d'un type cellulaire qui peut être utilisé comme témoin positif est conseillé de veiller à ce qu'unrésultat négatif est pas lié à un problème technique et d'aider avec des procédures de dépannage. cellules hépatiques primaires sont métaboliquement compétentes et peuvent être utilisés comme contrôle, par exemple les hépatocytes primaires en suspension sont très faciles à utiliser, mais leur viabilité est limitée dans le temps. Des lignées de cellules hépatiques sont des alternatives possibles qui sont relativement faciles à utiliser comme décrit dans ce protocole, mais certains sont mieux que d' autres en termes d'activité métabolique 6, 21.
Étant donné que le test est non destructive, à moins que la protéine totale est quantifiée, il est possible de suivre l'activité de CYP au fil du temps dans les études longitudinales 20. Ceci est un point important parce que certaines cellules auront variables activité CYP au fil du temps dans la culture. Un résultat négatif peut être associé à l'absence de confluence, des progrès avec la différenciation ou dédifférenciation in vitro. Dans ce cas, l'approche est semi-quantitative puisque les données ne sont pas normalisée par la quantité totale de protéine dans chaque culture cellulaire. Il est pas toujours possible ou recommandé de réutiliser le tissu après avoir mesuré l'activité de CYP que l'exposition à des sondes, des inhibiteurs ou inducteurs peuvent avoir un effet toxique sur le tissu comme est le cas pour la TCDD.
Les fractions cellulaires tels que les microsomes pourraient également être utilisées pour caractériser l'activité de CYP d'un type cellulaire donné. Microsomes préparatifs, cependant, nécessitent beaucoup de matériel cellulaire, l'ajout de cofacteurs adéquates et un tampon pour assurer que les enzymes restent actives. L'utilisation de cellules vivantes élimine l'étape délicate de préparation de microsomes et de travail qui tamponne et cofacteurs fonctionnent le mieux.
Comme recommandation générale, il est recommandé de caractériser le profil d'expression de CYP dans des cultures de cellules pour vérifier qu'il correspond à l'activité enzymatique. Ce niveau supplémentaire de vérification est recommandée étant donné que les sondes métaboliques ne sont pas Enticompter spécifique à un seul CYP et lui donne une confiance accrue que l'activité métabolique mesurée est compensée par l'expression de l'enzyme correspondante. Depuis CYP sont des protéines membranaires , ils sont relativement difficiles à préparer western blots, donc a été l'approche privilégiée RT-PCR quantitative au profil de ces enzymes 20.
Il est important de noter que ce protocole décrit une méthode pour tester l'activité enzymatique CYP qui ne représente qu'une famille d'enzymes métaboliques, certes importante. La flexibilité d'une approche par spectrométrie de masse permet le développement de méthodes d'acquisition pour d'autres transformations métaboliques de substrats de sonde. Cependant, celles-ci doivent être mis au point un à la fois et il y a actuellement moins de sondes spécifiques connues et des inhibiteurs sélectifs pour d'autres familles d'enzymes métaboliques. Cet écart doit être adressée à permettre une évaluation complète de la compétence métabolique in vitro systè cellulaireMme.
Disclosures
AB et EM étaient des employés de British American Tobacco au moment où ce manuscrit a été écrit. Les travaux décrits dans ce manuscrit a été financé par British American Tobacco, et les frais de publication de cette vidéo article a été payé par British American Tobacco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
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