Summary
Metabole competentie van in vitro systemen is een belangrijke voorwaarde voor de biotransformatie en dispositie van drugs en toxische stoffen. In dit protocol beschrijven we de toepassing van referentie- metabole probes fase I metabolisme in celkweken beoordelen.
Abstract
Xenobiotische metaboliserende enzymen spelen een sleutelrol bij de biotransformatie van geneesmiddelen en toxische stoffen door het toevoegen van functionele groepen die de oplosbaarheid verhogen en uitscheiding vergemakkelijken. In sommige gevallen deze structurele wijzigingen leiden tot de vorming van nieuwe giftige producten. Met het oog op het verminderen van dierproeven kunnen chemische risico's worden beoordeeld met behulp metabolisch competente cellen. De expressie van metabolische enzymen is echter niet stabiel in de tijd velen in vitro primaire kweek systemen en vaak gedeeltelijk of afwezig is in cellijnen. Daarom is de studie van geneesmiddelen, additieven en verontreinigingen metabolisme milieu in vitro idealiter uitgevoerd in celsystemen waarbij metabolische activiteit gekarakteriseerd. We leggen hier een aanpak om de activiteit van een klasse van metabolische enzymen (Human Fase I) in 2D cellijnen en primaire 3D culturen te meten met behulp van chemische sondes en hun stofwisselingsproducten kwantificeerbare door UPLC massaspectrometrie enluminometrie. De werkwijze kan worden toegepast om de metabole activiteit te testen in cellijnen en primaire cellen afkomstig uit verschillende weefsels.
Introduction
Xenobiotische metabolisme is het proces waarbij chemicaliën lichaamsvreemd worden gemodificeerd door de toevoeging van hydrofiele groepen en de conjugaten hun uitscheiding 1 te vergemakkelijken. Kenmerkend het metabolisme van xenobiotica Twee stappen met fase I voornamelijk bestaande uit een oxidatie onder toevoeging van een of meerdere hydroxylgroepen 1, 2. In fase II worden de hydroxylgroepen gebruikt als acceptoren voor een hydrofiel conjugaat zoals glucuronide of sulfaat groep 1, 2. Als een acceptor groep reeds op de moleculen, kan de conjugatiestap onafhankelijk van fase I metabolisme gebeuren. Elke reactie wordt uitgevoerd door een specifieke groep enzymen, bijvoorbeeld CYP (cytochroom P450), dat de hydroxylering katalyseren (figuur 1) en dealkylering van chemische substraten 3. Conjugation wordt gekatalyseerd door sulfotransferasen, UDP-glucuronosyltransferasen (figuur 1), glutathion-S-transferasen en N-acetyltransferases 4. Elk weefsel en orgaan een specifiek metabolisch enzym expressie profiel, de lever tot expressie meeste van deze eiwitten.
Figuur 1: Voorbeeld van fase I en fase II metabolisme van Cumarine. CYP2A6 / CYP2A13 katalyseren de 7-hydroxylering van cumarine. 7-hydroxycoumarine is geconjugeerd aan een glucuronidedeel van fase II-enzymen UGTs met UGT1A6 en UGT1A9 die de hoogste activiteit.
Inzicht in het metabolisme van xenobiotica is van cruciaal belang bij de evaluatie van de veiligheid van geneesmiddelen en voor de chemische risicobeoordeling om twee redenen: de reactiekinetiek zal bepalen hoe lang een geneesmiddel of chemische stof in het lichaam in een actieve of inactieve vorm b blijftefore uitscheiding; en de uitgangsverbinding kan een reactiever, onstabiele en giftige soorten worden gemodificeerd door metabolische enzymen. Dergelijke reacties ook bekend als "biologische activering" worden voornamelijk te wijten aan fase I CYP-enzymen, maar ook zeldzame gevallen van fase II conjugatie 5.
Op basis hiervan werd het vermogen van een in vitro model om het risico van een geneesmiddel of een chemische voorspellen is sterk afhankelijk van de metabole competentie van het celsysteem. Cellijnen afgeleid van zieke weefsels of transformatie van normale cellen verliezen vaak een deel, zo niet alle metabole enzymprofiel representatieve hun weefsel van oorsprong 6. Het handhaven van de normale metabole enzymprofiel lijkt beter primaire celkweken (althans op korte termijn kweken) en wordt verder verbeterd wanneer het weefsel gekweekt in een matrix waardoor het de 3D-structuur 1 te behouden. Daarom is de characterization van de metabole competentie van een in vitro celsysteem is een belangrijke eerste stap bij het geleiden van het beslissen welke celmodel is wenselijk chemische veiligheid evaluaties uit te voeren.
In dit artikel presenteren we een protocol om de activiteit en expressie van fase I CYP-enzymen in vitro profiel voorbeelden van de toepassing met een hepatische cellijn 7 en 3D primaire long- celculturen 8. CYP specifieke substraten, hun stofwisselingsproducten en remmer besturingselementen worden beschreven met massa spectrometry- en luminogene-kwantificering methoden. Omdat sommige CYP induceerbaar en constitutief anderen zullen voorbeelden worden gegeven voor de twee scenario.
Protocol
OPMERKING: De algemene werkstroom van de metabolische activiteit assay is uiteengezet in Figuur 2. Elke stap van deze workflow wordt vervolgens in detail beschreven in de volgende paragrafen. Gedetailleerde tabellen van de reagentia en apparatuur zijn in de tabel van Materialen.
Figuur 2: workflow voor Metabolic Probe Assay. De cellen worden uitgezet en gekweekt tot voldoende dichtheid. Een CYP inductie stap kan afhankelijk van de enzymactiviteit bepaald vereist. De sonde substraat en remmer wordt toegevoegd aan de celkweek. Na een incubatieperiode wordt het medium verzameld voor analyse en de cellen worden gelyseerd voor eiwit kwantificatie. Het mengsel wordt bewerkt voor analyse van het metabolische product van de probe substraat door massaspectrometrie of luminometrie.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
1. Cultuur van de Cel
Figuur 3: Light Transmission Micrografie van een lever cellijn Culture. De cellijn in dit protocol 5 beschreven kenmerkend onderscheid met een splitsing tussen 50% en cholangiocyten hepatocyten in kweek (100x). Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Gestoorde cellijn cultuur
OPMERKING: Een commercieel verkrijgbare lever cellijn werd gebruikt als een voorbeeld van metabolisch competente cellen. De cellijn werd afgeleid van een hepatocarcinoom veroorzaakt door virale infectie 7. Op confluentie deze cellijn differentieert in cholangiocyte- en hepatocyt-achtige cellen (figuur 3) en verdere details zijn te vinden in Guillouzo 7. De opname van 2% DMSO aan het kweekmedium steunt de differentiatie van de cellijn en expressie van een verscheidenheid van CYP.- Verwijder het cryogene flesjes met cellen van de vloeibare stikstof en plaats op droogijs vervoer. Breng de cryovial een waterbad voorverwarmd tot 37 ° C gedurende 1-2 min en de buitenkant van het flesje met 70% ethanol gesteriliseerd alvorens in een laminaire stroming kap.
- Tijdens de werkzaamheden onder steriele omstandigheden voorzichtig openen cryogene flacon om overtollig ontlasten en pipetteer de inhoud van de cryogene flacon in een 10 ml buis gevuld met 9 ml voorverwarmde Williams' E-medium bij 37 ° C.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 10 min bij 400 xg bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mLproprietary dooi medium voorverwarmd bij 37 ° C, aangevuld met glutamine of glutamine supplement (2 mM eindconcentratie) (Williams E + glutamine supplement + ontdooien toevoegingen).
- Aantal levensvatbare cellen met behulp van een 500 gl aliquot met een celteller of andere geschikte cel teltechniek.
- Zaad de cellen in een 24 putjes met collageen beklede plaat bij een dichtheid van 0,6 x 10 6 levensvatbare cellen / putje in een eindvolume van 0,5 ml medium ontdooien.
- Plaats de plaat (s) in een incubator bij 37 ° C met 5% / 95% CO2 / lucht en 100% relatieve vochtigheid.
- 24 uur na uitzetten van de cellen vervangen van het medium met 0,5 ml voorverwarmde onderhoud / metabolisme werkmedium (Williams E + glutamine supplement + metabolisme te vullen (dit medium bevat reeds DMSO)). Verander het medium om de twee dagen.
- Na een paar dagen kweken van de cellen vormen een sub-confluente trabeculaire structuur (figuur 3). De optimale metaboleActiviteit kenmerkend waargenomen tussen dag 7 en 10 en het laagst op dag 4.
Figuur 4: Dwarsdoorsnede van Alcian Blue Stained Airway cellen gekweekt op de Air-vloeistof Interface 8.
Trilharen, slijm producerende en basale cellen zijn duidelijk zichtbaar. Schaal bar = 250 urn.
- Gedifferentieerde luchtwegepitheel culturen
Opmerking: Het protocol is getoond met een in de handel verkrijgbaar volledig gedifferentieerde primaire luchtwegepitheel gegroeid bij de lucht-vloeistof grensvlak op een inzetstuk 8 (figuur 4). Weefselkweek behoudt een mucocilliary fenotype en celpolariteit 8. Cellen kunnen nasale of bronchiale oorsprong zijn. Hier, gebruik dan de menselijke neus cellen. De cellen worden geleverd op een cultuur plaat formaat met 24inserts in de lucht-vloeistof grensvlak. Om het transport te vergemakkelijken en te voorkomen dat medium morsen de inzetstukken worden geleverd met het basale gedeelte ingebed in een agarose matrix gemengd kweekmedium.- Bij aflevering van de cellen, Steriliseer de platen die de inzetstukken 24 met een 70% ethanoloplossing voor het plaatsen in een schone laminaire stroming kap.
- Bereid een steriele plaat met 24 putjes door het toevoegen van voorverwarmd 700 pl eigen kweekmedium.
- Met steriele pincet overdracht van de cel inzetstukken aan de nieuwe plaat voorgeladen met medium door voorzichtig losmaken het inzetstuk uit de agarose matrix.
- Plaats de plaat (s) in een incubator bij 37 ° C met 5% / 95% CO2 / lucht en 100% relatieve vochtigheid.
- Elke 2 dagen de inserts dragen aan een nieuwe steriele 24-well plaat vooraf geladen met 700 ul warm proprietary luchtweg celkweekmedium.
- Beoordeel de integriteit van de luchtweg weefsel met behulp van werkwijzen, zoals trans-epitheliale weerstand (TEER) ofcilia verschilfrequentie (CBF) met gebruik van een microscoop uitgerust met een live video beeldvormingssysteem 9. De meting van TEER en CBF is beschreven in Kuehn 10.
2. CYP Activiteit Kwantificering in celkweken
Opmerking: In het algemeen kunnen oplosmiddelen zoals DMSO en methanol worden om voorraadoplossingen te bereiden op de verschillende metabolische probes en remmers in dit document. Het wordt echter aanbevolen om de uiteindelijke DMSO concentratie in het kweekmedium tot een minimum (1% of lager) gehouden worden, aangezien hoge concentraties metabolische enzymen kunnen remmen. Indien mogelijk, verdient het aanbeveling om fenolrood vrij en serumvrij medium tijdens de incubatie met metabole probes aangezien fenolrood kan interfereren met CYP en Fase II enzymactiviteit en serum component zoals albumine kan de beschikbaarheid probe te verlagen. Het is niet altijd mogelijk om zich strikt aan deze richtlijnen. Bijvoorbeeld, de luchtwegen celkweekmedium is eigendom van en bevat fenol rood. Proprietary hepatische cellijn metabolisme medium 7 bevat reeds DMSO dan 1% zoals nodig is voor de cellen aan de hepatocyt-achtige fenotype aannemen.
LET OP: Tot slot, hier is de term specifieke probe / inhibitor wordt gebruikt, maar deze terminologie dient te worden beschouwd met de nodige voorzichtigheid. Inderdaad, het is zeer zeldzaam voor een metabole probe een enzym exclusief substraat. De hier beschreven probes hebben echter een hoge affiniteit voor hun enzymdoel en daarom worden beschouwd als betrouwbare markers activiteit.
- Metabolische probes, inductoren en remmers
- Probes met massaspectrometrie gebaseerde werkwijzen
OPMERKING: De probes en inhibitoren in dit hoofdstuk beschreven zijn geschikt om de activiteit van CYP2As 11 testen, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16 en CYP2E1 17 door UPLC-massaspectrometrie. De sondes, inhibitoren en corresponderende CYP worden beschreven in Tabel 1 met overeenstemmende referenties aangeduid. Tabel 1 geeft eveneens de metaboliet met het CYP activiteit die wordt gekwantificeerd door middel van massaspectrometrie. alle werkzaamheden in weefselkweek en oplossingen voor gebruik in weefselkweek in een steriele weefselkweek kap te voeren. een voorraadoplossing in DMSO kan worden voorbereid op de sonde substraten.- Voor het experiment voor te bereiden twee reeksen cel inzetstukken en putjes, gebruikt een serie voor de remming experiment, de andere alleen de metabolische probe. Bereid een derde reeks van cellen als een medium blanco controle. Ze kunnen op afzonderlijke platen of op dezelfde platen met minimaal drie herhalingen. Een voorbeeld van de plaat laguitgevoerd is weergegeven in figuur 5.
- Op de dag van het experiment, vervang dan de celcultuur medium met 450 ul van vers medium.
- Bereid in een steriele kap een 10 x concentratie van de volgende oplossingen via het celkweekmedium. Meng 10x CYP probe, 10x CYP remmer en 10x CYP remmer plus 10x probe.
OPMERKING: Master voorraadoplossingen remmer en probe kan worden bereid in 100% DMSO (bijv 1000x voorraden) en verder verdund in medium tot een 10x oplossing te verkrijgen om een uiteindelijke DMSO-concentratie van meer dan 1% van de celkweek te voorkomen . De uiteindelijke 1x concentraties die zijn gericht op de incubatie met de cellen worden getoond in tabel 1. - Filter de verschillende 10x probe-oplossing met een 0,2 urn spuitfilter.
- Voeg 50 ul van medium dat de CYP 10x remmer aan de reeks van cellen voorbereid voor de remming experiment en pre-incubeer gedurende 30 minuten.
- RVervang het medium van de cellen in de remming serie met 450 ul vers medium en voeg 50 ul medium dat zowel 10x CYP-remmer en 10x probe substraat.
- Naar de andere cellen 50 gl van het medium met de 10x probe substraat en voeg een equivalente hoeveelheid drager verdund in medium (bijvoorbeeld DMSO) aan de lege cel controles zoals getoond in figuur 5.
- Incubeer de cellen gedurende 0-5 minuten (tijdstip 0 achtergrondcontrole) en 16 uur in de celincubator.
LET OP: Deze incubatietijd werd met succes gebruikt met de cellen van de luchtwegen en lever cellijn; echter verse primaire hepatocyten een hoge metabolische competentie, in afwachting van de kwaliteit van het celpreparaat en genetische donor, waardoor kortere tijden (bijvoorbeeld 2-4 uur) is bruikbaar. Het is altijd aan te raden om een tijdsverloop experiment uit te voeren bij het testen van verschillende cellijnen of celtypen. - Na afloop van de incubatieperiode collect het medium in afzonderlijke gemerkte buizen voor het kwantificeren van de metaboliet met de probes. Freeze het medium voor toekomstige verwerking.
- Lyseren van de cellen voor eiwit kwantificatie.
OPMERKING: Elk standaard eiwit kwantificatie-kit en protocol geschikt voor deze stap. BCA is een geschikte optie. Deze stap is facultatief indien de cellen worden gebruikt in een andere assay.
- medium behandeling
OPMERKING: De vanuit het incubatiestadium medium bevat de ouder probe chemische en metabolieten daarvan. Om een specifieke CYP activiteit te meten alleen het product van de reactie gekatalyseerd door het CYP van belang moeten worden gekwantificeerd. Fase I metabolisme worden vaak verwerkt in combinatie met fase II metabolisme (conjugatie) en dus niet kan worden gedetecteerd als zodanig. Aldus teneinde de meest nauwkeurige kwantificering van CYP activiteit te verkrijgen, een deconjugerende stap is nodig om eventuele verwijderenFase II metabolisme modificatie. Aangezien conjugatie van fase I metabolieten gaat vaak glucuronidering en sulfatering wordt deconjugerende verkregen door behandeling van de monsters door glucuronidasen en sulfatasen 18. Glucuronidase en sulfatase activiteit is pH-afhankelijk met de hoogste glucuronidase activiteit bij pH 4,5-5,0 en sulfatase activiteit het hoogst bij pH 6,0-6,5 bereikt. Daarom is deze stap vereist aanpassing van de pH. Bij de hier beschreven methode, meten we de pH met behulp pH strips om praktische redenen, omdat de meeste pH meter probes niet passen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Commercieel verkrijgbare pH strips kunnen worden gevonden met een resolutie vanaf 0,3-0,2 pH eenheden.- Transfer 250 ul incubatiemedium een 1,5 ml microbuisjes en voeg 4-methylumbelliferon interne standaard voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 100 nM bereikt.
- De pH van het medium op 4,5-5,0 door toevoeging van 1 M HCl. Voeg 1 pl HCl per keer en controleer pHpipetteren 2 ul van medium op een pH strip. Bereiken van een pH van 5,0 zou typisch niet meer dan 5-10 pl 1 M HCl nodig.
- Voeg 150 eenheden (1,8 uL een 85.000 eenheid / ml voorraadoplossing) van β-glucuronidase / arylsulfatase van Helix pomatia en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de reactie door toevoeging van 250 pi koude methanol (-20 ° C). Bewaar monsters bij -20 ° C of proces verder.
- Damp het oplosmiddel met behulp van een vacuüm centrifuge bij 45 ° C. Reconstitueren de monsters met 500 ul van een 30% acetonitril: wateroplossing. De monsters zijn klaar voor massaspectrometrie analyse en kan bij -20 ° C in amberkleurige glazen flesjes bewaard.
- Massaspectrometrie kwantificering
LET OP: Alle UPLC en massaspectrometer instellingen worden gedetailleerd beschreven in de speciale Aanvullende tabel 1. Voor een kwantitatieve analyse, vaststelling van een ijkkromme vereist. de Caliijking curve wordt verkregen door een bekende verdunningsreeks van de verbinding te kwantificeren. In dit geval werden de kalibreringskrommen die meer dan 10 verschillende concentraties (tabel 2), ten minste 6 waarvan mag niet meer dan 20% van het lineaire traject 19. Laagste detectieniveau wordt bepaald als de laagste concentratie die een signaal groter dan of gelijk aan het gemiddelde achtergrondsignaal 3x geeft. Het laagste kwantificering wordt bepaald als het monster laagste concentratie die een signaal groter of gelijk is aan 10x het gemiddelde achtergrondsignaal beide worden bepaald over ten minste 3 onafhankelijke proeven met monsters in drievoud geeft.- Bereid een seriële verdunning van een synthetische metaboliet in het weefsel cultuurmedium volgens Tabel 2, zoals de interne standaard. Een eindvolume van 250 pl per standaardverdunning voldoende.
- Damp het seriële verdunningen van standaard zoals beschreven in step 2.1.2.4 en resuspendeer in een volume van 30% acetonitril: water gelijk aan het volume van media voorafgaande verdamping (bijvoorbeeld 250 pl 30% acetonitril: water als het uitgangsmateriaal standaardoplossing werd 250 ul medium).
- Voeg 250 ul van elke seriële verdunning standaard UPLC een amber glazen flesje voor injectie in de UPLC-MS autosampler.
- Voeg de proefmonsters (250 pl) aan UPLC flesjes amber en plaats ze in de UPLC autosampler.
- Randomize alle flesjes.
OPMERKING: De massaspectrometer configuratie gebruikten we een hybride triple quadrupool / lineaire ion trap massaspectrometer gekoppeld aan een UPLC beschreven in de aanvullende tabel 1. Andere platforms zouden verschillende software en configuratie hebben, maar zou vergelijkbaar zijn stappen om de kwantificering uit te voeren volgen. - Voer het UPLC-MS met de instellingen vermeld in Tabel 1 Aanvullende afhankelijk van de specifieke probe te kwantificeren.
- Gebruikde "te kwantificeren - Bouw Kwantificering methode" tool in massaspectrometer kwantificeringshulpmiddelen (Table of Materials) om de kalibratiecurve van de verworven synthetische standaard en de interne standaard te genereren.
- Met de "Kwantificering Wizard" naar de monsterbatch en monsters te kwantificeren en uitvoeren van de "Kwantificering Method" selecteert. De massaspectrometer kwantificering software een spreadsheet de kwantificering waarden van de gewenste verbinding in elk testmonster.
- Probes met behulp van luminescentie gebaseerde methoden
OPMERKING: luminogene sondes om een scala van CYP activiteiten te meten zijn in de handel verkrijgbaar; echter niet alle geschikt zijn voor celgebaseerde proeven. Hier wordt een protocol voorgesteld om de activiteit van CYP1A1 / CYP1B1 meten. CYP1A1 / 1B1 werd geselecteerd om te illustreren hoe de activiteit van induceerbare CYP testen en een voorbeeld van hoe luminogene probes kan worden gebruikt als alter geveninheems in massaspectrometrie gebaseerde methoden. Tabel 3 vat de concentratie en incubatietijd gebruikten we de cellen luchtwegen en hepatische cellijn; Echter, die zou moeten worden aangepast voor andere celtypen. Luminogene andere probes zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden gebruikt als substraten voor verschillende CYP.- Bereid voldoende cellen met een niet-geïnduceerde controle, een geïnduceerde test en een geïnduceerde + remmer testen omvatten. Een voorbeeld van een plaatindeling wordt getoond in figuur 5B.
- Om CYP1A1 / 1B1 induceren Incubeer de cellen met een uiteindelijke concentratie van 10 nM TCDD in medium gedurende 72 uur (kortere 24-48 uur kunnen ook geschikt zijn).
LET OP: TCDD kankerverwekkend en teratogeen. Draag adequate beschermende uitrusting, herziening van de leverancier MSDS vel en het uitvoeren van een risicobeoordeling voor gebruik. - Na deze periode, verwijder het medium, spoel de putten met PBS 3 keer, en voeg wat vers medium.
- Prior aan het incuberen van de cellen met de luminogene reporter probe, pre-incubeer de aangewezen subset van geïnduceerde cellen gedurende 30 minuten met een eindconcentratie van 10 uM CYP1A1 / 1B1 inhibitor, α-naftoflavon, in medium.
- Voeg de luminogene probe LUC-CEE (luciferine 6'-chloorethyl ether) bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM tot de niet-geïnduceerde geïnduceerde en geïnduceerde cellen + remmer.
- Incubeer gedurende 4 uur in een celkweek incubator. Na afloop van de incubatietijd verzamelen van het medium voor het kwantificeren van de luminogene probe.
- Breng 25 pl kweekmedium een witte ondoorzichtige plaat met 96 putjes en voeg 25 ul van de fabrikant luciferine detectiereagens. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Lees de plaat onmiddellijk met een luminometer.
- Spoel de cellen met PBS en lyseren op totaal eiwit kwantificering.
Opmerking: Deze stap is optioneel als levende cellen worden bewaard voor toekomstige experimenten. ikt is echter belangrijk op te merken dat induceerders zoals TCDD toxisch zijn en zullen de cellen beschadigen.
- Probes met massaspectrometrie gebaseerde werkwijzen
Tabel 1: Lijst van Metabolic Probes, Producten en Remmers met hun overeenkomstig enzym. Molecuulgewicht en aanbevolen concentraties gebruikt bij de luchtweg en levercellen zijn ook aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorgestelde 24 putjes plaatindeling een CYP assay. (A) De aanbevolen lay-out voor CYP constitutief tot expressie omvat een reeks van putten voor de blanco mediumDe metabole probe en de metabole probe plus remmer. Deze lay-out kan worden vermenigvuldigd met het aantal tijdstippen die worden getest. (B) voorbeeld layout voor induceerbare CYP omvat een reeks goed voor een medium spatie, een metabole probe alleen controle geïnduceerde cellen (bijvoorbeeld met TCDD) geïncubeerd met de probes en geïncubeerd met de probes en een remmer.
Tabel 2: Verdunning van synthetische normen voor de ijkkrommen en Respectieve LOD en LOQ. De verdunningsreeks gebruikt kan variëren afhankelijk van de massaspectrometrie platform en gevoeligheid. Hier gebruikten we een hybride triple quadrupool / lineaire ion trap massaspectrometer gekoppeld aan een UPLC. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Tabel 3: luminogene Probe, induceerder evenals remmer van CYP1A1 / 1B1 Assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Voorbeelden van metabolische activiteit gemeten voor twee paren CYP (CYP1A1 / 1B1 en CYP2A6 / 2A13) in de luchtweg celcultures van drie verschillende donoren (luchtweg M360, M370, M417) en de hepatische cellijn (Hep lijn) getoond in figuur 6 20.
CYP activiteit gemeten door luminometrie
Figuur 6A toont de relatieve luminescentie geproduceerd door CYP1A1 / 1B1 O-dealkyleringsactiviteit van Luc-CEE (luciferine 6'-chloorethylether) in de luchtwegen cellen (3 donoren) en levercellen met en zonder inductie TCDD. CYP1A1 / 1B1 zeer induceerbaar enzymen en worden meestal niet tot expressie op constitutieve niveau in de meeste weefsels. Zoals te zien is in figuur 6A, is er geen luminogene signaal gedetecteerd wanneer de cellen niet worden geïnduceerd. Wanneer beide celtypen gepreïncubeerd met TCDD, een sterke CYP1A1 / 1B1 inductor, een merked luminogene signaal wordt waargenomen vergeleken met de controlegroep (figuur 6A). Dit betekent dat de Luc-CEE sonde leidende gemetaboliseerd om de vrijlating van de luciferine rest die vervolgens wordt gekwantificeerd. De algehele werking van de TCDD behandelde hepatische cellijn lager dan de luchtweg cellen, zelfs na een totale proteïne normalisatie. Dit is niet ongebruikelijk omdat cellijnen zijn vaak minder metabolisch actief zijn dan primaire cellen. Toevoeging van α-naftoflavon een duidelijk remmend effect op CYP1A1 / 1B1 activiteit in alle celtypes die CYP-afhankelijkheid van Luc-CEE metabolisme bevestigt verder.
Kwantificering van CYP450 metabolieten gebruik UPLC-MS
Figuur 6B illustreert de kwantificering van CYP2A6 / 2A13-activiteit in cellen van de luchtwegen 3 donors (Airway M343, M345, M347) en levercellen (Hep lijn) na incubatie met coumarine bij aanwezigheid en afwezigheid van het inhiBITOR 8-methoxypsoraleen. De gegevens worden genormaliseerd op totaal eiwit. In het coumarine 0 min incubatie control, geen 7-hydroxycoumarine gedetecteerd (Figuur 6B). CYP2A6 / 2A13 wordt constitutief tot expressie in bepaalde weefsels en derhalve na 16 uur incubatie met cumarine vorming van 7-hydroxycoumarine wordt gedetecteerd in verschillende celtypes getest, zelfs zonder inductie. Wanneer 8-methoxypsoraleen is een CYP2A-remmer toegevoegd (figuur 6B), wordt de vorming van 7-hydroxycoumarine aanzienlijk verminderd.
Opgemerkt dient te worden dat in de aanwezigheid van de CYP-remmer, is het normaal om nog op te sporen enkele resterende activiteit als remming is zelden compleet en aangezien andere CYP misschien ook in staat zijn om de ondergrond te herkennen, maar het verwerken van het veel minder efficiënt. Ook kan worden opgemerkt dat de opgenomen metabole activiteit tussen verschillende donoren kunnen bij het gebruik van primaire cellen is toegankelijk voor CYP2A6 in de luchtwegen cellen(Figuur 6B). Dit zal naar verwachting als CYP activiteit is onderhevig aan genotype en polymorfismen van elke donor.
Figuur 6: Activity Assay Resultaat CYP1A1 / 1B1 activiteit (A) en CYP2A6 / 2A13 activiteit (B) in de lever cellijn en drie Airway celdonoren (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkyleringsactiviteit weergegeven met en zonder inductie van CYP1A1 / 1B1 van TCDD. α-naftoflavon werd als CYP1A1 / 1B1 remmer. Activiteit wordt uitgedrukt als relatieve luminescentie-eenheden (RLU) genormaliseerd door incubatie tijd in minuten (min) en totaal eiwit (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 geen inductie nodig omdat ze constitutief tot expressie worden gebracht. Cumarine 7-hydroxylering activiteit in pmol / min / mg eiwit wordt getoond op verschillende tijdstippen met en zonder inhibitor 8-methoxypsoralen. Alle resultaten worden weergegeven als een gemiddelde van drie onafhankelijke metingen met standaardafwijkingen van het gemiddelde. Dit cijfer werd gewijzigd van 20 Baxter.
Aanvullende Tabel 1: UPLC and Mass Spectrometer instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Momenteel zijn veel gestandaardiseerde toxicologische testsystemen gebruiken gemanipuleerde bacteriën, cellijnen, of embryonale cellen die niet representatief zijn voor de normale menselijke stofwisseling 1. Dit kan leiden tot onnauwkeurige voorspellingen van de mogelijke toxische activiteit van een chemische stof of geneesmiddel. Innovatieve in vitro modellen, zoals 3D celculturen en organen op een chip, ontwikkeld in een poging om betere repliceren normale morfologie en metabolische activiteit van menselijke weefsels 21, 22, 23. Metabole competentie is een criterium dat kan worden gebruikt om te ontcijferen welke modellen zijn het best geschikt voor toxicologische evaluatie en geneesmiddelbiotransformatie studies.
De techniek die we in dit document zijn beschreven is ontworpen om de activiteit van CYP-enzymen met levende cellen te meten. Het is flexibel en kan worden gebruikt voor verschillende mobiele systemen in 2D of 3D cultures en biedt de mogelijkheid om ofwel een luminogene probe- of een massa-spectrometrie gebaseerde aanpak te gebruiken. Beide methoden zijn gevoelig genoeg om nanogram hoeveelheden materiaal te detecteren en vereisen slechts een klein aantal cellen gekweekt in een multi-well formaat. Ze kunnen ook worden toegepast op bolvormige of cellen gekweekt in complexe matrices. De keuze van het substraat probe is natuurlijk een cruciaal element van het protocol. De specificiteit van de assay berust op de sonde selectief de CYP enzym en een andere laag van zekerheid kan worden verkregen door toepassing van een selectieve remmer van CYP. De substraten en in dit document vermeld remmers zijn slechts een paar voorbeelden, maar anderen kan worden gevonden in de literatuur.
Het is belangrijk om meerdere incubatietijden overwegen bij het werken met een nieuw celtype als negatief gevolg CYP activiteit kan worden veroorzaakt door het enzym tot expressie wordt gebracht op een laag niveau. De toevoeging van een celtype dat kan worden toegepast als een positieve controle is het raadzaam om tegen eennegatief resultaat is niet gekoppeld aan een technisch probleem en om te helpen met het oplossen van problemen. Primaire levercellen metabolisch bekwaam en kan worden gebruikt als controle, bijvoorbeeld primaire hepatocyten in suspensie zijn zeer makkelijk te gebruiken maar hun levensvatbaarheid in de tijd beperkt. Hepatische cellijnen zijn mogelijke alternatieven die relatief eenvoudig te gebruiken zoals beschreven in dit protocol, maar sommige zijn beter dan andere wat betreft metabole activiteit 6, 21.
Aangezien de bepaling is niet destructief, tenzij totaal eiwit gekwantificeerd, kan men de CYP activiteit in de tijd volgen longitudinale studies 20. Dit is een belangrijk punt, omdat sommige cellen variabele CYP activiteit zal hebben na verloop van tijd in de cultuur. Een negatief resultaat zou kunnen houden met het gebrek aan confluentie voortgang van de differentiatie of dedifferentiatie in vitro. In dat geval is de benadering semi-quantitative aangezien de gegevens niet wordt genormaliseerd door de totale hoeveelheid eiwit in elke cel cultuur. Het is niet altijd mogelijk of aanbevolen om het weefsel opnieuw na meting van de CYP activiteit blootstelling aan probes, remmers of induceerders kan een toxisch effect op het weefsel zoals het geval is voor TCDD.
Celfracties zoals microsomen kan ook worden gebruikt om CYP activiteit van een bepaald celtype te karakteriseren. Microsoompreparaten vereisen echter veel celmateriaal, de toevoeging van geschikte cofactoren en buffer zodat de enzymen actief blijven. Met behulp van levende cellen elimineert de lastige microsoomoplossing voorbereiding stap en uit te werken, die buffers en co-factoren het beste werken.
Als algemene aanbeveling is een praktische tip om het expressieprofiel van CYPs te karakteriseren in celkweken te controleren of deze overeenkomt met de enzymatische activiteit. Deze extra niveau van controle verdient aanbeveling, gezien het feit dat de metabole probes niet Entirekenen specifiek voor één CYP en geeft beter het vertrouwen dat de gemeten metabole activiteit gelijk is aan de overeenkomstige enzym expressie. Aangezien CYP membraaneiwitten zijn ze relatief moeilijk te bereiden op Western blots derhalve kwantitatieve RT-PCR is de beste methode om deze enzymen 20 profiel zijn.
Het is belangrijk op te merken dat dit protocol beschrijft een werkwijze voor het testen CYP enzymactiviteit dat slechts vertegenwoordigt een familie van metabolische enzymen, zij het een belangrijke. De flexibiliteit van een massaspectrometrie benadering maakt de ontwikkeling van verkrijging werkwijzen voor andere metabolische transformaties van testsubstraten. Echter, die zijn ontwikkeld worden een voor een tijd en er zijn minder bekende specifieke probes en selectieve inhibitoren voor andere metabolische enzymen families. Die kloof moet worden gericht aan zorgen voor een uitgebreide beoordeling van het metabool competentie van in vitro cel systeMevr.
Disclosures
AB en EM waren medewerkers van British American Tobacco op het moment dat dit manuscript werd geschreven. Het werk in dit manuscript beschreven werd gefinancierd door British American Tobacco, en de daaraan verbonden kosten voor deze video-artikel werd betaald door British American Tobacco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E.
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
