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Migliorare la forza, il potere, la capacità aerobica muscolare e la tolleranza al glucosio attraverso la formazione a breve termine di resistenza progressiva tra le persone anziane

Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55518
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

Summary

L'effetto della formazione di resistenza a breve termine su persone anziane è stato studiato attraverso l'utilizzo simultaneo di diversi metodi. Rispetto ad un gruppo di controllo, sono stati osservati molti miglioramenti, tra cui la capacità aerobica muscolare, la tolleranza al glucosio, la forza, la potenza e la qualità muscolare ( cioè le proteine ​​coinvolte nella segnalazione delle cellule e nella composizione del tipo di fibra muscolare).

Abstract

Questo protocollo descrive l'uso contemporaneo di un ampio spettro di metodi per esaminare la capacità aerobica muscolare, la tolleranza al glucosio, la forza e il potere nelle persone anziane che eseguono una formazione a resistenza a breve termine (RET). La formazione di resistenza progressiva supervisionata per 1 h tre volte alla settimana su 8 settimane è stata eseguita da partecipanti RET (71 ± 1 anni, range 65-80). Rispetto ad un gruppo di controllo senza formazione, il RET ha mostrato miglioramenti sulle misure utilizzate per indicare la resistenza, la potenza, la tolleranza al glucosio e diversi parametri della capacità aerobica muscolare. La formazione di resistenza è stata eseguita in una palestra con solamente robuste attrezzature fitness. Un dinamometro isocinetico per la resistenza all'estensore del ginocchio ha permesso di misurare la concentricità, l'eccentricità e la resistenza statica, aumentata per il gruppo RET (8-12% dopo-prova). Il potere (velocità di sviluppo della forza, RFD) al 0-30 ms iniziali ha anche mostrato un aumento per il gruppo RET (52%). Una prova di tolleranza al glucosio con frequeLa misurazione del glucosio nel sangue ha mostrato miglioramenti solo per il gruppo RET in termini di valori di glucosio nel sangue dopo 2 h (14%) e l'area sotto la curva (21%). Anche il profilo lipidico del sangue è migliorato (8%). Dai campioni di biopsia muscolare preparati utilizzando istochemia, la quantità di fibra IIa aumentata e una tendenza verso una diminuzione di IIx nel gruppo RET rifletteva una variazione a un profilo più ossidativo in termini di composizione della fibra. Western blot (per determinare il contenuto proteico relativo alla segnalazione per la sintesi proteica muscolare) ha mostrato un aumento del 69% in sia Akt che mTOR nel gruppo RET; Questo ha anche mostrato un aumento delle proteine ​​mitocondriali per il complesso OXPHOS II e la citrato sintetico (entrambi al 30%) e per il complesso IV (90%), solo nel gruppo RET. Ci dimostriamo che questo tipo di formazione di resistenza progressiva offre diversi miglioramenti ( ad esempio, forza, potenza, capacità aerobica, tolleranza al glucosio e profilo lipidico al plasma).

Introduction

L'invecchiamento è associato ad una perdita di massa muscolare (sarcopenia), forza e potenza. La resistenza ridotta, e probabilmente ancor più importante, provoca l'immobilità, un aumento del rischio di lesioni e una minore qualità di vita. La formazione della resistenza è una strategia ben nota per contrastare la sarcopenia e la deteriorazione della funzione muscolare. Una stima della resistenza muscolare può essere ottenuta dal carico o dal numero di ripetizioni raggiunte. Tuttavia, questo studio ha ottenuto informazioni più dettagliate e precise sulla funzione muscolare usando un dinamometro isokinetico per raccogliere informazioni sulla coppia durante la contrazione isometrica, concentrica ed eccentrica, nonché sulla cinetica dello sviluppo della forza.

La capacità aerobica, sia a livello del corpo intero (VO 2max ) che nel muscolo scheletrico, è ridotta nelle persone anziane. La diminuzione della frequenza cardiaca con l'età spiega una gran parte della diminuzione di VO 2max 1 , ma diminuisce il musLa capacità ossidativa, in larga misura correlata all'attività fisica ridotta 2 , contribuisce. La funzione mitocondriale compromessa può anche essere coinvolta nello sviluppo della sarcopenia e della resistenza all'insulina 3 . La capacità aerobica muscolare è stata valutata in biopsie muscolari attraverso analisi biochimiche del contenuto di enzimi mitocondriali e complessi proteici situati sia nella matrice ( cioè nella citra sintetica) sia nella membrana mitocondriale interna. Inoltre, sono state utilizzate tecniche istochemiche per misurare l'effetto della formazione di resistenza sulla morfologia muscolare ( cioè composizione di fibra, sezione trasversale in fibra e densità capillare). Un metodo alternativo per valutare la capacità aerobica muscolare sarebbe quello di utilizzare spettroscopia a risonanza magnetica per misurare la velocità della resintensione di fosfato di creatina dopo l'esaurimento indotto dall'esercizio 4 . Questo metodo fornisce una stima della capacità aerobica muscolare in vivoMa non può discriminare tra disfunzione mitocondriale e disturbi circolatori. Inoltre, i costi elevati dell'apparecchiatura limitano l'uso di questa tecnica nella maggior parte dei laboratori. La capacità aerobica (VO 2max e densità mitocondriale) può essere migliorata con esercizio di resistenza sia nei giovani che negli anziani 5 , 6 . Tuttavia, l'effetto della formazione di resistenza su questi parametri è stato meno studiato, soprattutto nei soggetti anziani e i risultati sono in conflitto tra 7 , 8 , 9 , 10 .

Il diabete di tipo 2 è una malattia diffusa nella popolazione anziana. L'inattività fisica e l'obesità sono fattori importanti di stile di vita che spiegano l'aumento dell'incidenza del diabete di tipo 2. L'esercizio aerobico a bassa intensità è spesso consigliato a soggetti con ridotta tolleranza al glucosio. Tuttavia, è uncCome l'addestramento della forza negli anziani influenza la tolleranza al glucosio / sensibilità all'insulina 11 , 12 . Il modo più preciso per misurare la sensibilità all'insulina è quello di utilizzare la tecnica del mastice di glucosio, in cui il glucosio nel sangue è mantenuto costante mediante l'infusione di glucosio in condizioni di elevata insulina 13 . Gli svantaggi con questa tecnica sono che richiedono tempi e invasivi (cateterizzazione arteriosa) e richiedono speciali strutture di laboratorio. In questo studio è stato utilizzato il test orale di tolleranza al glucosio, che è comune nelle unità sanitarie. Questo metodo è adatto quando diversi soggetti devono essere studiati per un periodo di tempo limitato.

Il test e la sequenza temporale della procedura sperimentale possono essere riassunti come segue. Utilizzare tre giorni separati per il test prima e dopo un periodo di otto settimane, con la stessa disposizione e pianificazioni di tempo approssimative (≥24 ore tra ogni giorno, < Forte> Figura 1). Al primo giorno di prova, misurare: dati antropometrici, come ad esempio l'altezza, la massa corporea, la massa senza grassi (FFM) e la circonferenza della gamba superiore ( cioè 15 cm sopra le patelle apice in posizione supina rilassata); Capacità ciclo submaximale; E la forza muscolare del ginocchio, come descritto nei passaggi 4 e 5. Prenda una biopsia muscolare dalla coscia alla seconda prova giornata. Per ulteriori descrizioni, vedere la fase 6.1. Testate la tolleranza orale di glucosio (OGTT) nell'ultimo giorno di prova. Per ulteriori descrizioni, vedere la fase 7.1. Chiedere a tutti i partecipanti di evitare attività fisiche vigorose per 24 ore e di veloci durante la notte prima di ogni giorno di prova. Tuttavia, chiedere loro di evitare attività fisica carente per 48 ore prima della giornata di prova OGTT. Chiedi loro di seguire la loro normale attività fisica quotidiana e le abitudini alimentari. Si noti che l'intervento pre-e post-intervento, l'assunzione di cibo e il tipo di alimenti da parte di entrambi i gruppi erano invariati.

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Figura 1: Protocollo sperimentale. Diagramma schematico. Il tempo tra i tre pre- e post-test è stato simile per ogni soggetto ed è stato di almeno 24 ore. Ulteriori dettagli sono riportati nel testo. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio ha cercato di indagare l'effetto della formazione di resistenza a breve termine nelle persone anziane sulla capacità ossidativa del muscolo e sulla tolleranza al glucosio. Il secondo obiettivo era quello di esaminare l'effetto sulla forza, sul potere e sui miglioramenti qualitativi muscolari ( cioè le proteine ​​coinvolte nella segnalazione cellulare e nella composizione del tipo di fibra muscolare).

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Protocol

Il Comitato Regionale Etico di Stoccolma, Svezia, ha approvato la progettazione dell'inchiesta.

1. Materiale

  1. Reclutare donne relativamente sane e uomini 65-80 anni che hanno valori BMI compresi tra 20 e 30 kg · m -2 . Randomizzi in due gruppi. Assicurarsi che gli individui in entrambi i gruppi abbiano livelli relativamente bassi di attività fisica ( ossia moderata attività fisica quotidiana e nessun addestramento fisico regolare).
  2. Escludere gli utenti beta-bloccanti e quelli con malattia coronarica e gravi problemi neurologici o congiunti.
  3. Chiedere ai soggetti per il loro consenso scritto dopo aver informato loro del possibile disagio e rischi durante le prove e le sessioni di allenamento.
  4. Bilancia la formazione di resistenza (RET) e il controllo senza formazione (CON) in termini di età, sesso e BMI. Chiedere a un gruppo di eseguire RET sotto un allenatore per 1 ora tre volte alla settimana per otto settimane; L'altro gruppo servirà come controLs (CON).

2. Test e formazione

Nota: gli otto esercizi sono esercizi di allenamento standard: la seduta a gamba, la crisi addominale seduta, la schiena supina, l'estensione posteriore seduta, la pressa a spalla seduta, il canottamento seduto, l'estensione della gamba seduta (estensione del ginocchio) e la curvatura della gamba (ginocchio) ; Vedere la figura 8 nella sezione Risultati rappresentativi.

  1. Durante la prima sessione di allenamento, valutare la massima forza ad una ripetizione massima (1 RM) per ogni esercizio di allenamento.
    NOTA: Il modello 1 RM è comunemente usato e viene definito come il carico in cui il soggetto può sollevare o spingere la resistenza solo una volta ma non due volte.
    1. Prima dell'avvio, chiedere al partecipante di effettuare un breve riscaldamento (con poche prove iniziali a carichi pesanti molto bassi) dell'esercizio esaminato. Successivamente aumentare il carico fino a poco al di sotto del probabile 1 valore RM (più spesso il massimo di 3-4 aumenta loAnnunci). Registrare il carico massimo che il soggetto può eseguire solo una volta (= 1 RM).
    2. Misura 1 RM nelle otto esercitazioni di resistenza standard (vedere la figura 8 nella sezione Risultati rappresentativi). Chiedere ai soggetti di riposare per almeno 2-3 minuti tra ciascun esercizio fisso.
      NOTA: L'attrezzatura di allenamento a forza è stata utilizzata per tutti gli esercizi di allenamento, inclusi i test di ogni esercizio di allenamento.
  2. Chiedere a tutto il gruppo RET di eseguire 1 h di allenamento di resistenza sorvegliata tre volte alla settimana per otto settimane. Chiedere ai partecipanti di eseguire, dopo il riscaldamento, gli otto esercizi di formazione standard sopra menzionati. Dovrebbero ripetere un esercizio di 12 volte in ciascuna serie e eseguire tre serie di ogni esercizio. Lasciare riposare per 1 min tra ogni set e 2-3 minuti tra ciascun esercizio.
    1. Chiedere ai soggetti di eseguire ogni esercizio il più velocemente possibile durante la fase concentrica ( ossia la fase di accorciamento muscolare) e lentamente durante la faseFase eccentrica ( cioè, fase di allungamento muscolare).
      NOTA: I soggetti possono eseguire gli esercizi in qualsiasi ordine. Tuttavia, chiedere loro di iniziare e terminare con un esercizio di gamba e anche per cercare di eseguire gli otto esercizi nell'ordine presentato. Utilizzate le attrezzature di allenamento per tutte le otto esercitazioni.
    2. Durante ogni sessione di allenamento, chiedere ai partecipanti di eseguire tre serie a 75-80% di 1 RM per ogni esercizio. Aumenta il carico di circa il 5% della sessione dopo quando un partecipante può effettuare 12 ripetizioni in tutti e tre i set di un esercizio.

3. Prova ciclabile submaximale

Nota: eseguire il test ciclo submaximale sul primo giorno di prova (vedere Introduzione e Figura 1 ).

  1. Eseguire un test di ergometro a ciclo, compresi due livelli submaximali, ciascuno per 4 min 14 , 15 . Impostare la prima velocità di lavoro a bassa (30 W) e la seconda a 60-120 W, senza pausa tra i carichi dell'erogometro di ciclo.
    NOTA: Il primo carico è lo stesso per tutti i soggetti, ma il secondo ed ultimo livello submaximale dovrebbe essere di circa il 65-85% della frequenza cardiaca massima per ogni soggetto. Entrambi i carichi devono essere gli stessi prima e dopo il periodo di intervento di 8 settimane di allenamento.
    1. Stabilire il secondo livello di carico più elevato sui test di familiarizzazione effettuati prima delle prove, chiedendo come è fisicamente attivo la persona e avendo inizialmente il ciclo del soggetto per un breve periodo; Il test leader creerà un parere basato sulla frequenza cardiaca del soggetto in merito a quale carico submaximale finale è appropriato.
    2. Registrare la frequenza cardiaca media (HR) usando un monitor di frequenza cardiaca tramite un cinturone toracico durante l'ultimo minuto sulle basse e elevate tasse di lavoro, assumendo la media degli HR osservati alle 3:15, 3:30, 3:45 , E 4:00 min ad ogni tasso di lavoro.
    3. Utilizzare un dispositivo ergo-spirometrico per accertare la composizione del gas (O 2 e CO 2 cioè CO 2 / O 2 ) e quantificare i valori medi di RER durante l'ultimo minuto (da quattro misure ogni 15 secondi) a entrambi i carichi di frequenza.

4. Forza dell'estensore del ginocchio: la coppia di picco statica, eccentrica e concentrica e la velocità di sviluppo della forza

Nota: eseguire le misure della resistenza al ginocchio al giorno di prova 1 (vedere Introduzione e Figura 1 ).

  1. Prima delle registrazioni, chiedere al soggetto di eseguire un riscaldamento a ciclo per 8-10 minuti su un ergometro a livello submaximale (ossia circa il 65-85% della frequenza cardiaca massima).
  2. Chiedere all'oggetto di sedersi sul banco di un dinamometro isokinetico. Fissare il tronco del soggetto con cinghie sulle spalle e sui fianchi. Fissare saldamente la gamba del soggetto all'albero del dinamometro con due cinghie: uno sotto il ginocchio e uno appena sopraLa caviglia. Allineare l'asse del ginocchio con il centro di rotazione dell'albero del dinamometro.
  3. Quando il soggetto è protetto, valutare la massima forza ginocchio volontaria come la coppia di picco, con il soggetto seduto nel dinamometro isocinetico. Inizialmente consentire al soggetto di svolgere diverse prove per familiarizzare con l'apparecchiatura di resistenza al ginocchio (dinamometro isocinetico).
  4. Chiedere all'individuo di eseguire quattro estensioni massime volontarie eccentriche e concentriche a ginocchio (alternativamente), con la gamba destra con una velocità angolare costante di 30 deg / s. Impostare l'intervallo di movimento tra 90 ° e 15 ° (gamba dritta = 0 °).
    1. Nel compito eccentrico, chiedere al soggetto di resistere all'albero del dinamometro con sforzo massimo durante tutto il movimento dall'angolo del ginocchio 15 ° a 90 °. Nel compito concentrico, chiedere all'oggetto di premere la gamba inferiore dell'albero del dinamometro in un'estensione del ginocchio, il più difficile possibile per tutta la gamma di movimento.
  5. Lasciare riposare 4 minuti dopo le registrazioni dinamiche. Successivamente, valutare la coppia statica massima di contrazione volontaria (MVC) quattro volte ad un angolo di 65 ° di ginocchio. In ogni prova statica, chiedere ai soggetti, seduti nello stesso dinamometro, di scuotere il più velocemente e più duro possibile contro l'albero del dinamometro, che ora è fisso (a 65 °) e non può essere spostato.
  6. Per i segnali di coppia (forza), convertite i segnali di coppia analogici in digitale utilizzando una casella convertitore analogico-digitale collegata al dinamometro isocinetico.
    NOTA: Il convertitore modifica automaticamente i segnali analogici dal dinamometro ai segnali digitali, che successivamente vengono esportati automaticamente nel computer in cui vengono raccolti i dati.
    1. Impostare la frequenza di campionamento a 5 kHz nel programma di analisi software del computer. Memorizzare i segnali digitali sul computer per una successiva analisi del valore di forza con il programma di analisi software.
  7. Nell'analisi successiva, utilizzareIl valore più alto ottenuto da quattro prove per ogni soggetto nelle misurazioni eccentriche, concentriche e statiche. Nel programma software, fare clic sul valore più alto dei quattro trial e scrivere il valore di resistenza mostrato sullo schermo del computer.
    1. Registrare la coppia massima di picco nell'eccentrico e nelle registrazioni concentriche per ogni soggetto e il valore massimo di forza tra i quattro processi statici.
      NOTA: Il test dinamometrico isokinetico della resistenza all'estensore del ginocchio in posizione seduta ha una corretta affidabilità e validità 16 , 17 .
  8. Misurare il tasso di sviluppo della forza (coppia) durante 0-30 ms e 0-200 ms nel valore più alto trovato tra le prove statiche. Impostare il valore di zero al livello di 7,5 Nm per l'inizio della contrazione per la forza dell'estensore del ginocchio (tempo: 0 ms) 18 , 19 . Spostare il cursore (nel programma software per il muscoloAnalisi di forza) al valore "7,5 Nm" sulla scala y per ottenere la posizione per 0 ms.
    1. Per la valutazione pre-test, impostare il cursore sul valore 30 ms (dopo il tempo 0 ms). Scrivi il valore che mostra l'aumento in Nm a 30 ms ( cioè l'aumento di Nm da 7,5 Nm = 0 ms). Effettuare la stessa procedura per il valore post-test.
    2. Calcolare l'aumento percentuale del valore Nm post-prova (numeratore) rispetto al valore Nm pre-test (denominatore) nel periodo di 0-30 ms. Così, presentate l'aumento del RFD in percentuale dal pre-test al post-test. Eseguire le stesse analisi per l'intervallo di tempo di 0-200 ms.

5. Biopsia muscolare

Nota: eseguire una biopsia muscolare durante il giorno di prova 2 (vedere Introduzione e Figura 1 ).

  1. Prendi una biopsia muscolare dalla parte centrale del muscolo coscia laterale utilizzando un conchotomo 20 .
    1. Prima della biopsia, iniettare 1-2 mL di anestesia locale sottocutanea e nella fascia. Dopo un paio di minuti, effettuare un'incisione con un piccolo bisturi attraverso la pelle e la fascia, circa 1/3 della distanza dalla patella alla colonna vertebrale superiore anteriore. Estrae circa 100-150 mg di tessuto muscolare usando il conchotomo.
  2. Freeze campioni per istochemia in isopentane raffreddati al punto di congelamento in azoto liquido e conservarli a -80 ° C. Conservare un campione di 30-50 mg di tessuto muscolare.
  3. Rapidamente congelare i campioni per analisi proteica in azoto liquido e conservarli a -80 ° C. Conservare un campione di 30-50 mg di tessuto muscolare.

6. OGTT

Nota: eseguire OGTT (prova di tolleranza orale di glucosio) nel giorno di prova 3 (vedere Introduzione e Figura 1 ). Il tempo tra l'esercizio e l'OGTT deve superare 48 h e dovrebbe essere simile tra il pre e il post-test. Un OGTT orale a 2 ore viene utilizzato per indagare se frequenti campioni di sangue durante questo periodo mostrano livelli normali o aumentati, indicando il diabete o le condizioni di prediabete.

  1. Esegui la prova OGTT al mattino su soggetti che hanno digiunato durante la notte e non hanno fatto alcun esercizio fisico durante il giorno di prova o il giorno prima.
  2. Prendete i campioni di sangue (4 mL) dai pazienti supinati attraverso una cannula venosa nella vena antecubita 15 minuti prima e poco prima dell'assunzione di glucosio, seguita da 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'ingestione del glucosio ( 75 g di glucosio in una soluzione di 250 g / L).
  3. Centrifugare i campioni di sangue a 1.500 xg e 4 ° C per 10 minuti e memorizzare il plasma a -20 ° C per ulteriori analisi. Utilizzare i campioni per eseguire test standard di livello di glucosio (passo 7).
  4. Per il glucosio, l'insulina e il c-peptide, calcolare l'area sotto la curva (AUC) determinando l'intero tempo del glucosio sopra i livelli di glucosio basale. Utilizza i risultati OGTTPer calcolare la sensibilità dell'insulina per tutto il corpo utilizzando il metodo Matsuda 21 , come per l'equazione: 10 000 * √ [Basso di glucosio * Basalto dell'insulina] * (Glucosio medio * Insulina media ).

7. Analisi dei campioni di sangue

  1. Quantificare la concentrazione di glucosio nel plasma venoso con un analizzatore automatizzato. Impostare il livello di tolleranza al glucosio a valori di glucosio nel sangue> 7,8 mmol / L dopo 2 ore di OGTT 22 .
  2. Usare kit ELISA 22 per eseguire analisi plasmatiche di insulina e c-peptide. Utilizzare un lettore di piastre. Mettere le piastrine ELISA per insulina e c-peptide in un lettore di piastra (ognuna in un'occasione separata).
    NOTA: il lettore di piastre misura la quantità di insulina e la quantità di c-peptide misurando i campioni sulla piastra ad alcune assorbanze. I lipidi ematici TG, HDL, apolipoproteina A1 e apolipoproteina B sono stati analizzati con metodi standard aL'Ospedale Universitario di Karolinska, Stoccolma, in Svezia.

8. Analisi dei campioni muscolari

  1. immunoblotting
    1. Innanzitutto congelare il campione muscolare in un liofilizzatore ad una pressione inferiore a 10 -1 mbar per 12 h. Disseccarlo in modo che sia privo di sangue e tessuto connettivo utilizzando un ago e una pinza sotto un microscopio leggero. Conservarlo a -80 ° C.
      NOTA: Una quantità adeguata di muscoli è compresa tra 1 e 5 mg di peso secco, ma il protocollo può essere regolato a meno di 1 mg, fino a singole fibre. A causa della bassa quantità di tessuto muscolare presente in una biopsia, i valori di quel partecipante RET non sono stati utilizzati per l'immunoblotting.
    2. Omogeneizzare i campioni muscolari Con un fascio di mini bead in tampone ghiaccio-freddo (80 μL / mg) composto da 2 mM di acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES), 1 mM acido etilendiammintetraoacetico (EDTA), 5 mM etilene glicol-bis (Β-aminoetil etere) -N, N, N ', N'-tetraacet(EGTA), 10 mM MgCl2, 50 mM ß-glicerofosfato, 1% TritonX-100, 1 mM Na 3 VO 4 , 2 mM dithiothreitolo, 20 μg / ml leupeptina, 50 μg / ml aprotinina, Cocktail e 40 μg / μL di PMSF (fenilmetilsolfonilfluoruro).
      1. Mettere una scoop di branelli di ossido di zirconio da 0,5 mm in ogni tubo con il muscolo. Aggiungere tampone e omogeneizzare per 2 x 1 min alla fase di velocità 7-8 (qui il massimo è 10) e 4 ° C.
    3. Centrifugare l'omogenato per 10 min a 10.000 x g. Trasferire il rimanente supernatante in nuovi tubi e scartare il pellet contenente le proteine ​​strutturali.
    4. Determinare spettrofotometricamente la concentrazione proteica nel surnatante con un kit disponibile in commercio utilizzando un lettore di piastre a 660 nm 23 .
      1. Successivamente diluire i campioni con tampone di campione di 2x Laemmli e tampone omogeneizzante (1: 1) ad una concentrazione proteica finale di 1,5 μg /# 181; L. Scaldare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine. Conservare i campioni diluiti a -20 ° C prima dell'analisi.
    5. Per l'elettroforesi con gel nativo-poliacrilammide (PAGE), caricare 30 μg di proteine ​​da ciascun campione in gel di gradiente prefabbricato a 18 pozzetti (4-20% acrilammide) e eseguire elettroforesi a 300 V per 30 minuti in ghiaccio.
    6. Equilibrare il gel in tampone di trasferimento (25 mM Tris base, 192 mM glicina e 10% metanolo) per 30 minuti a 4 ° C. Trasferire le proteine ​​in membrane di polivinilidene fluorurate con pori di 0,2 μm a una corrente costante di 300 mA per 3 ore a 4 ° C.
    7. Per confermare il carico e il trasferimento uguali, macchiare le membrane con una macchia proteica totale 24 . Per ogni proteina bersaglio caricare tutti i campioni di ogni soggetto sullo stesso gel e eseguire tutti i gel contemporaneamente.
    8. Bloccare la membrana per 1 h a temperatura ambiente in soluzione tris-tampone (20 mM Tris-base, 192 mM NaCl, TBS, pH 7,6) contenente5% di latte non grasso.
    9. Incubare le membrane durante la notte con anticorpi primari (vedi Elenco materiali) diluiti in TBS contenenti latte non grasso del 2,5% e completati con 0,1% di Tween-20 (TBS-TM).
    10. Dopo l'incubazione primaria di anticorpi, lavare le membrane (2 x 1 min più 3 x 5 min) con TBS-TM e incubare con anticorpi secondari (vedi Elenco Materiali) coniugati con perossidasi di rafano per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare di nuovo con TBS-TM (2 x 1 min e 3 x 10 min) e sottoporre nuovamente a quattro lavaggi supplementari di 5 min con TBS.
    11. Applicare 6-12 ml di substrato chemiluminescente alla membrana per 5 min. Posizionare la membrana tra due fogli di plastica trasparenti. Posizionare le membrane di fronte a una fotocamera CCD che blocca la luce esterna. Prendere le esposizioni seriali usando un filtro della fotocamera chemiluminescente.
      1. Utilizzare il programma software per acquisire 10 esposizioni per 2 minuti o fino a quando i segnali sono saturi. Utilizzare un'impostazione standard, sia per le impostazioni del filtro ottico tO acquisire la chemiluminescenza, oltre che per le impostazioni delle lenti.
    12. Utilizzare la massima esposizione che non porta alla saturazione e contrassegnare i contorni della banda. Quantificare le bande come intensità x mm 2 usando lo stesso software. Sottrai il rumore di fondo dall'intensità della banda. Presentare i risultati relativi alla macchia proteica totale e esprimerlo come cambiamento percentuale rispetto alla linea di base.
  2. istochimica
    NOTA: La tecnica dell'istochemia qui di seguito è basata sui metodi descritti in una pubblicazione precedente 25 .
    1. Per istochemia, tagliare le sezioni trasversali di serie (10 μm) a -20 ° C utilizzando un criostato. Montare le sezioni trasversali su vetrate conservate in una cuvetta di vetro e asciugare le fettine di biopsia a temperatura ambiente.
    2. Preparare soluzioni tampone per ogni livello di pH per la preincubazione a pH 4,3, 4,6 e 10,3 per la colorazione ATPasi 26 . Per visualizzare i capillari, staNelle sezioni trasversali utilizzando il metodo di amilasi-PAS 27 .
    3. Calibrare un misuratore di pH versando soluzioni di calibrazione in bicchieri di taratura etichettati. Premere il pulsante appropriato per selezionare il pH dal menu principale.
      1. Sciacquare la sonda con acqua deionizzata e posizionare la sonda nel primo becher di calibrazione. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella membrana. Misurare la prima soluzione di calibrazione e presentare la soluzione di calibrazione successiva (il display chiede la soluzione successiva).
      2. Sciacquare la sonda con acqua deionizzata e posizionarla nel secondo bicchiere di calibrazione. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella membrana. Misurare una seconda soluzione di calibrazione e procedere alla successiva soluzione di calibrazione.
      3. Sciacquare la sonda con acqua deionizzata e collocarla in un terzo recipiente di calibrazione. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella membrana. Misurare la terza soluzione di calibrazione.
        NOTA: quando è la calibrazioneBuono, il display mostrerà brevemente, "Buffer tre riga OK" e quindi tornerà al menu principale.
    4. Utilizzare i tamponi come segue per la colorazione di ATPasi.
      1. Per preparare una soluzione a pH 10,3, utilizzare due soluzioni diverse: (A) 4.506 g di glicina, 4.8 g di CaCl2, 3.51 g di NaCl e 600 ml di dH2O e (B) 2.176 g di NaOH e di 540 ml Di dH 2 O. Conservare le soluzioni in una stanza fredda o in un frigorifero. Usarli entro un mese.
      2. Per preparare soluzioni a pH 4.3 e 4.6, eseguire "preincubazione acido". Preparare l'acido per la preincubazione utilizzando: 6,47 g di Na acetato, 3,7 g di KCl e 500 ml di dH 2 O. Successivamente preparare 1% CaCl2 sciogliendo 2,5 g di esso in 250 ml di dH2O. Preparare 2 % Di CoCl 2 sciogliendo 5 g in 250 mL di dH 2 O.
      3. Conservare e utilizzare queste soluzioni come sopra indicato. Infine, preparare 0,2% di solfuro di ammonio perMescolando 800 μl di 20% (NH 4 ) 2 S in 40 ml di dH 2 O. Preparare questi ultimi freschi.
    5. Preparare soluzioni a determinati valori di pH come segue. Dopo la calibrazione del pH-meter, rimuovere le cuvette e i cloruri di calcio e cobalto dal frigorifero e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente prima della colorazione.
      1. Per pH 10,3 , aggiungere circa 25 ml di soluzione A ad un piccolo bicchiere di vetro (circa 70 ml). Misurare il pH. Continuare ad aggiungere la soluzione B fino a raggiungere il pH richiesto di 10,37. Se la colorazione è troppo scura, aumentare il pH. Se è troppo luminoso, ridurre il pH.
      2. Per il pH 4.6 , aggiungere circa 25 ml di "preincubazione acido" ad un piccolo bicchiere di vetro. Misurare il pH. Ridurre il pH utilizzando 5 M di acido acetico . Se l'immagine della macchia è troppo scura, cercare di schiarire con un pH aumentato. Se è troppo luminoso, scurire con un pH ridotto. Se la colorazione non aiuta, prova un altro pH: 4,8 instEad di 4.6.
      3. Per il pH 4.3 , fare lo stesso come per il 4.6, ma aggiungere più acido acetico. Diminuire il pH se la macchia è troppo luminosa e aumentare il pH se è troppo scuro per le fibre da specificare.
      4. Preparare la soluzione ATP come segue. Ponderate 0,017 g di ATP per cuvetta (10 ml), quindi 0,051 g per 3 cuvette o 0,068 g per 4 cuvette. Prendete 30 mL (per 3 cuvette, 10 mL / cuvetta) di soluzione a pH 10.3 (utilizzare un vetro di scala a cilindro) e metterlo in un bicchiere di vetro con ATP pesato.
        1. Mescolare accuratamente e misurare il pH. Ridurre il pH usando HCl concentrato finché il pH raggiunge esattamente 9,40.
      5. Per l'incubazione a vari valori di pH, procedere come segue. Posizionare la soluzione 10.3 in una cuvetta e incubarla in un bagno d'acqua a 37 ° C per 9 min. Mettere la soluzione 4.3 in un'altra cuvetta e incubarla a temperatura ambiente per 5 min. Inserire la soluzione 4.6 nell'ultima cuvetta e incubare a RT per 1 minuto.
      6. Seguendo il pH preferitoProcedura di incubazione, applicare il contenuto di ciascuna cuvetta come segue. Lavare 15 volte con dH 2 O. Aggiungere la soluzione ATP (0,170 g di ATP / 100 ml di H 2 O) al campione di biopsia. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min. Lavare 15 volte con dH 2 O.
      7. Aggiungere la soluzione CaCl2 (1 g di CaCl 2/100 mL di H 2 O) al campione di biopsia nelle cuvette. Incubare a RT per 3 min. Lavare 15 volte con dH 2 O. Aggiungere la soluzione di CoCl2 (2 g di CoCl 2/100 mL di H 2 O) al campione di biopsia nelle cuvette. Incubare a RT per 3 min. Lavare 15 volte con dH 2 O.
      8. Metterlo in soluzione (NH 4 ) 2 S per 30 s e lavare rapidamente 15 volte sotto il cofano. Incollare la biopsia fette sul vetro scorrevole. Per evitare le bolle, spremere le biopsie, ma non troppo duro.
    6. Selezionare una regione della sezione trasversale senza manufatti o tagli longitudinali della fibra. Analizza sotto un liGht microscopio con software.
    7. Valutare l'area di sezione trasversale (CSA), i capillari e la classificazione del tipo di fibra (tipo I, IIA o IIX) attraverso l'analisi dell'immagine computerizzata da una media di almeno 150-200 fibre per biopsia. Da un quadro microscopico delle fibre muscolari nelle sezioni trasversali, assicurarsi che i tre tipi di fibre muscolari (tipo I, IIA e IIX) presentino varie sfumature di bianco a grigio a nero, a seconda della colorazione pH ( cioè, 4.34, 4.65 e 10.37).
    8. Inizia con la marcatura di alcune fibre di tipo I. Successivamente, il programma registra automaticamente le altre fibre di tipo I. Controllare che tutte le fibre di tipo I siano contrassegnate correttamente. Per contrassegnare una determinata fibra, fare clic sul pulsante "Vector". Utilizzare il cursore per misurare l'area per ciascuna fibra muscolare selezionata individualmente.
    9. Dopo l'analisi delle fibre di tipo I continuare la stessa procedura per il tipo IIA e il tipo IIX. La media ± SEM per ogni tipo di fibra muscolare ( cioè tipo I, IIA e IIX) dovrebbero essere calcolati per quanto riguarda la quantità di fibre e la CSA per i gruppi RET e CON.
      Nota: La sezione trasversale (CSA), i capillari e la classificazione del tipo di fibre (tipo I, IIA e IIx) sono state valutate da una media di 163 ± 9 fibre per biopsia.

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Representative Results

Materiale

Nello studio, 21 donne e uomini relativamente sani, 65-80 anni e con valori BMI compresi tra 20 e 30 kg · m -2, hanno partecipato e sono stati randomizzati in due gruppi. Gli individui in entrambi i gruppi avevano livelli di attività fisica relativamente bassi ( cioè un moderato livello di attività fisica quotidiana e nessuna formazione regolare). Un gruppo (n = 12, 6 donne e 6 uomini) ha eseguito RET sotto un allenatore per 1 ora tre volte alla settimana per otto settimane e l'altro gruppo ha servito come controlli (n = 10, 5 donne e 5 uomini). I gruppi RET e CON sono stati equilibrati in termini di età, sesso e BMI ( Tabella 1 ). Altri soggetti sono stati reclutati al gruppo RET per compensare gli abbandoni; Sono stati anticipati più nel gruppo RET nel gruppo CON.

</ Td> RET (n = 12) CON (n = 9)
Pre Inviare Pre Inviare
Età (anni) 71.4 ± 1.1 72.0 ± 1.4
BMI 24,6 ± 0,8 24,9 ± 0,8 23.2 ± 0.8 23.2 ± 0.8
Peso (kg) 70,4 ± 2,9 71.1 ± 2.8 67,4 ± 3,9 67,6 ± 3,9
FFM (kg) 51.0 ± 2.3 52,4 ± 2,1 ** 47.6 ± 4.1 48.6 ± 4.3
Le cosce sono trasversaliA (cm²) 188.9 ± 9 200 ± 8 *** † 155 ± 12 154 ± 11
Fibra Area trasversale (cm²) Tipo I 5452 ± 393 5567 ± 362 4889 ± 323 4807 ± 354
Tipo IIa 4230 ± 610 # 4484 ± 434 # 4114 ± 535 # 3971 ± 494 #
Tipo Iix 3678 ± 634 # 3554 ± 552 # 3392 ± 889 # 2913 ± 427 #

Tabella 1: Caratteristiche dei partecipanti. RET, allenamento di resistenza alla resistenza; CON, controllo; BMI, massa corporea index; FFM, massa senza grassi. I valori sono da 12 (RET) e 9 (CON) soggetti, ad eccezione dell'area trasversale in fibra (RET, n = 10, CON, n = 7) e sono presentati come media ± SEM. **, p <0.01 rispetto al pre; ***, p <0,001 rispetto al pre; †, p <0,05 versus CON post; †††, p <0,001 contro CON post; #, P <0,05 rispetto al tipo I. Questa tabella è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28

Sono stati esclusi gli utenti beta-blocker e quelli con malattia coronarica e gravi problemi neurologici o congiunti. Alla base, alcuni soggetti hanno avuto: pressione alta (2 in ciascun gruppo); Depressione (1 per ogni gruppo); E farmaci per la dislipidemia (2 in RET e 1 in CON), ipotireosi (1 in RET), una fase precoce della malattia di Parkinson (RET). Il farmaco è stato preso sporadicamente per asma (1 in RET) e problemi reumatici (1 in CON). Una persona aveva un pacemakeR (CON).

Un soggetto RET ha interrotto l'allenamento dopo 6 settimane a causa del dolore alla schiena, ma era ancora incluso nello studio. Un soggetto iniziale di CON è stato escluso a causa di problemi al ginocchio durante la pre-prova della resistenza. Quelli con asma e pacemaker sono stati esclusi dal test ciclo.

I soggetti hanno dato il loro consenso scritto dopo essere stati informati di possibili disagi e rischi durante le prove e le sessioni di allenamento.

I dati sono presentati come mezzi ± SEM. Le differenze tra RET e CON sono state testate per significato statistico con misure ripetitive bidirezionali ANOVA utilizzando un programma statistico. Quando sono stati mostrati importanti effetti o interazioni significative, sono state individuate differenze con analisi post-hoc (Fisher LSD). La significatività statistica è stata accettata a p <0,05.

Figura 2A ). Il dinamometro ha anche mostrato la velocità di sviluppo della forza (RFD), con un aumento del 52% (al 0-30 ms iniziali) per il gruppo RET ( Figura 2B ). Per il gruppo CON, la forza concentrica è stata ridotta durante il periodo di intervento. Il carico di addestramento per RET è migliorato del 19-72% per gli esercizi di addestramento eseguiti.

figura 2
Figura 2: Risultati della misura della resistenza. L'effetto della resistenza ex(CONC) e ( B ) velocità di sviluppo della forza (RFD) durante 0-30 ms e 0- 200 ms di estensione statica del ginocchio. I valori sono da 12 (RET) e 9 (CON) soggetti e sono presentati come variazione percentuale rispetto ai valori basali (media ± SEM). *, P <0,05 rispetto a pre; **, p <0.01 rispetto al pre; ***, p <0.001 rispetto a pre. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dai campioni di biopsia muscolare, l'istochemia ha indicato che la quantità di fibra di tipo IIa è aumentata e vi è stata una tendenza ad una diminuzione di IIx per il gruppo RET. Pertanto, il gruppo RET ha mostrato una modifica aPiù profilo ossidativo in termini di composizione in fibra ( Figura 3 ). Si noti che le sezioni trasversali affidabili non potevano essere ottenute dalle biopsie di quattro soggetti (due da ciascun gruppo) ei risultati di questi soggetti sono stati esclusi.

Figura 3
Figura 3: Risultati della composizione del tipo di fibra muscolare. L'effetto della formazione di resistenza alla resistenza ( A , RET) o del periodo di controllo ( B , CON). I valori sono da 10 (RET) e 7 (CON) soggetti e sono presentati come media ± SEM. (*), P = 0,068 rispetto al pre; **, p <0.01 rispetto al pre; †, p <0,05 versus CON post. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Per favore cliCk qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Inoltre, le analisi di blot western per la determinazione del contenuto proteico relative alla segnalazione della sintesi proteica muscolare hanno mostrato un aumento del 69% sia per Akt che mTOR (target di mammella rapamicina) tra il gruppo RET ( Figura 4A e Figura 5 ). Anche le analisi di blot western hanno dimostrato, tra le proteine ​​mitocondriali, un aumento di circa il 30% sia per il complesso OXPHOS II che per la citrato sintetico e del 90% per il complesso IV del gruppo RET ( Figura 4B e Figura 5 ). Gli anticorpi primari utilizzati erano mTOR, Akt e OXPHOS. L'anticorpo anti-coniglio o anti-mouse è stato utilizzato come l'anticorpo secondario. Le bande proteiche per il complesso OXPHOS I non erano chiaramente visibili, e questi dati sono stati scartati.

Figura 4 Figura 4: Risultati della proteina muscolare. L'effetto della formazione di resistenza alla resistenza (RET) o di un periodo di controllo (CON) sui cambiamenti nel contenuto muscolare delle proteine ​​Akt e mTOR ( A ) e delle proteine ​​mitocondriali ( B ). Akt, proteina chinasi B; MTOR, bersaglio mammifero di rapamicina; CS, citrato sintetico. I valori sono i mezzi ± SEM da 11 (RET) e 9 (CON). *, P <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001 rispetto al basale. †, p <0,05; ††, p <0,01; †††, p <0,001 rispetto al post CON. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 = "/ Files / ftp_upload / 55518 / 55518fig5.jpg" />
Figura 5: Immagini Western blot. La proteina muscolare misurata prima e dopo otto settimane di intervento. Immagini rappresentative da un soggetto rispettivamente nei gruppi RET e CON. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Solo il gruppo RET ha mostrato una maggiore capacità aerobica nel test di ciclo (post-versus pre-test). All'intensità submaximale più alta, la frequenza cardiaca (HR) ha mostrato una forte tendenza a diminuire nel RET e nell'allungamento del gruppo CON ( Figura 6A ). Inoltre, RER (rapporto di scambio respiratorio = CO 2 / O 2 ) è stato significativamente ridotto solo per il gruppo RET (Lass = "xfig"> Figura 6B).

Figura 6
Figura 6: Dati respiratori cardio. Formazione di esercizi pre-e post-resistenza (RET) o periodo di controllo (CON). ( A ) HR, frequenza cardiaca e ( B ) RER, rapporto di scambio respiratorio durante un ciclo di steady state di intensità bassa (30 W) e alta (60-120 W). I valori sono da 11 (RET) e 8 (CON) soggetti (due soggetti sono stati esclusi a causa di asma e l'uso di un pacemaker) e sono presentati come la media ± SEM. (*) P = 0,056 (RET) e p = 0,068 (CON) rispetto al pre; * P <0,05 rispetto al pre. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati del gruppo RET dal test di tolleranza al glucosio hanno mostrato una migliore glicemia, sia nei valori di sangue dopo 2 h (14%) sia per la zona sotto la soglia Curva (21%, figura 7A ).

Figura 7
Figura 7: Glucosi nel plasma durante l'OGTT. Il test è stato eseguito (RET, A ) o un periodo di controllo (CON, B ) pre- (●) e post- (○). AUC glucosio , area sotto la curva per il glucosio plasmatico. I valori sono da 12 (RET) e 9 (CON) soggetti e sono presentati come media (glucosio plasmatico) e media ± SEM ( glucosio AUC ) . * P <0,05 rispetto al pre. Questa cifra è stata modificata da Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Sport . 2016: 26, 764-73. 28Rce.jove.com/files/ftp_upload/55518/55518fig7large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il profilo lipidico nel sangue è migliorato per il gruppo RET, con una diminuzione dell'appolipoproteina B (8%). Per CON, è stato riscontrato un aumento (10%). Inoltre, la massa grassa (FFM) è aumentata del 3% e la sezione trasversale della coscia (CSA) del 7% per il gruppo RET ( Tabella 1 ). I miglioramenti valutati dopo il breve periodo di allenamento progressivo della resistenza alla funzionalità mitocondriale, la capacità aerobica, la tolleranza al glucosio, la forza muscolare e il potere sono effetti di salute molto desiderabili in una popolazione anziana.

Le otto esercitazioni di forza sono mostrate in Figura 8 . Ogni attività di formazione è stata eseguita 12 volte in ciascuno di tre set in ogni sessione di allenamento 3 volte a settimana per otto settimane.


Figura 8: Gli otto esercizi di allenamento. Gli esercizi sono stati eseguiti al 75-80% di 1 RM, 12 volte / set, con tre set / esercizio e sessione di allenamento. Gli esercizi sono stati: "pressioni a gamba" e "scricchiolii addominali" ( A ), "stampa a torace" e "estensioni posteriori" ( B ), "stampa a spalla" e "canottaggio seduto" ( C ) Gambe arricciate "( D ). Qui sono riportati i movimenti delle esercitazioni di forza. Nella crunch addominale seduta, il tronco deve essere spostato dalla posizione verticale fino alla flessione del tronco di 60 °. In estensione posteriore seduta, il tronco, da una posizione seduta quasi in posizione verticale, viene spostato all'indietro in una posizione orizzontale di tronco di posizione. Sia gli esercizi seduti, le gambe e la gamba estensioNs, sono state eseguite con le gambe in 90 ° di flessione del ginocchio e terminano poco prima che le gambe siano state raddrizzate (vicino alle 0 ° nelle ginocchia). Gambe riccioli (in posizione predisposta) dove fatti da gambe quasi raddrizzate a circa 100 ° di flessione del ginocchio. Sia gli esercizi seduti, la pressa e la spalla sono stati eseguiti con flessione di gomito a 90 °, proprio prima che i bracci siano stati raddrizzati (vicino a 0 °). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo studio sono state utilizzate numerose tecniche per studiare gli effetti della formazione a resistenza progressiva a breve termine sulla funzione muscolare / morfologica dei soggetti anziani, capacità aerobica e tolleranza al glucosio. Il risultato principale è stato che, rispetto ad un gruppo di controllo, si sono verificati molti miglioramenti nella capacità aerobica muscolare, nella tolleranza al glucosio, nella forza, nella potenza e nella qualità muscolare ( cioè nella proteina coinvolta nella segnalazione cellulare e nella composizione della fibra muscolare). Un aumento è stato per esempio visto per: statica, eccentrica e concentrica massima forza di estensione del ginocchio (8-12%); I carichi di addestramento (19-72%), il tasso massimo di sviluppo della forza (RFD) al primo 0-30 ms (52%); Diverse proteine ​​mitocondriali (30-90%); Le proteine ​​Akt e mTor, coinvolte nella sintesi proteica muscolare (entrambi 69%).

Le persone anziane possono avere difficoltà con la salute sostenuta durante un simile progetto. Si deve essere consapevoli del rischio di varie lesioni dovute ai testLa formazione e la formazione tra gli anziani non addestrati. Una persona nel gruppo RET alla fine del periodo di allenamento ha avuto una ricaduta di problemi di schiena precedente. Tuttavia, nessuna lesione o disagio che si verificava durante il progetto di formazione rimase per un tempo prolungato dopo la fine dell'inchiesta tra i vecchi partecipanti. A volte può essere fatto modifiche riguardo a quando, quanto e quanto intensamente si dovrebbe fare la formazione. Per quanto riguarda il regime di allenamento della forza, è preferibile che l'allenatore registri il carico ottenuto per ogni esercizio di allenamento e soggetto in ogni sessione di allenamento in modo che una corretta progressione possa essere seguita durante tutto il periodo. Durante la misurazione della forza con il dinamometro isocinetico, è importante evitare qualsiasi errore nella procedura di misura in modo che i soggetti anziani non perdano la loro massima prestazione durante i loro studi. Per questo motivo è utile avere riscaldamenti. Utilizzare 8-10 minuti di ergometro a ciclo a livelli submaximal prima della misurazione della forzaS, seguito da prove iniziali come una procedura di familiarizzazione nel dinamometro per le registrazioni di forza del ginocchio. Inoltre, è bene eseguire quattro registrazioni durante le registrazioni di ogni tipo di contrazione della forza muscolare; Può essere selezionato il valore più alto trovato. È anche di grande valore per esaminare la modifica della valutazione della forza in relazione alla velocità quando si raggiunge il potere del parametro di prova. In particolare, l'aumento del potere è un fattore importante per migliorare la salute tra le persone anziane. Per quanto riguarda la biopsia, i soggetti sono chiamati ad evitare l'aspirina o altri agenti anti-coagulazione prima e dopo la biopsia. Per quanto riguarda la determinazione dell'area della fibra muscolare in biopsie duplicate dalla stessa gamba per tipo I, tipo 2A e tipo 2B, gli errori riportati sono rispettivamente di circa 10, 15 e 15%, rispettivamente 29 . Questo deve essere considerato quando si valuta l'analisi da una biopsia muscolare.

Le limitazioni comprendono preoccupazioni riguardo a Occidente bsacco; Il metodo non fornisce alcuna informazione sulla localizzazione proteica e dipende fortemente dalla specificità e dalla qualità dell'anticorpo (un problema importante). L'analisi a più fasi aumenta il rischio di errori e aggrava la risoluzione dei problemi. Tuttavia, ci sono diversi vantaggi di Western blotting: è relativamente poco costoso e veloce; Dà un'alta produzione di dati in relazione alla quantità di tessuto richiesto; Si acquisisce informazioni sull'espressione di proteine ​​e sulla dimensione delle proteine; E, infine, il coefficiente di variazione è generalmente inferiore al 5%. Il periodo di formazione della forza è stato solo otto settimane e non sono state prese misure di follow-up successive con queste persone anziane. I test di tolleranza al glucosio basati sulla bevuta di glucosio (OGTT) non sono considerati appropriati come quando il glucosio viene iniettato direttamente nel sangue. Tuttavia, il metodo utilizzato con OGTT è più economico, più facile da amministrare ed è ampiamente utilizzato nella clinica. Per quanto riguarda le misure di resistenza con il dinamometro isokinetico, Sono stati studiati solo i muscoli che hanno contribuito alla forza dell'estensore al ginocchio, e non gli altri gruppi muscolari del corpo maggiore.

Oltre alla resistenza migliorata, la formazione di resistenza ha anche migliorato la tolleranza al glucosio e la capacità ossidativa del muscolo. Ci sono stati grossi aumenti nel carico di addestramento per ogni esercizio eseguito (19-72%), dimostrando che la formazione di resistenza ha permesso di migliorare notevolmente la forza complessiva. Le misurazioni con un dinamometro isocinetico hanno fornito informazioni più dettagliate sulla funzionalità dell'estensore del ginocchio. La coppia durante la contrazione statica, eccentrica e concentrica è aumentata dell'8-12%. Inoltre, la resistenza alla resistenza ha determinato un notevole aumento (52%) nella velocità di sviluppo della forza (RFD) durante la fase iniziale di contrazione (0-30 ms), mentre era invariata tra 0-200 ms. Il protocollo di addestramento è stato ben tollerato e, contrariamente alle nostre aspettative, non ci sono abbandoni nel gruppo RET.

Risultato della formazione di resistenzaD in ipertrofia, misurata come aumenti della FFM, della circonferenza della coscia e della sezione trasversale della coscia. La CSA dei diversi tipi di fibre muscolari non è stata significativamente cambiata dopo il RET, ma c'è stato un cambiamento nella composizione di fibre tipo dal tipo IIx al tipo IIa. Poiché le fibre di tipo IIa sono più grandi delle fibre di tipo IIx, ciò ha contribuito alla massa muscolare aumentata. Nel gruppo RET, ciò indica che la sintesi proteica è stata migliorata. Il percorso di segnalazione molecolare sottostante per la sintesi proteica comporta l'attivazione di Akt e mTOR. La gente anziana ha meno proteina mTOR nel muscolo 30 , che può limitare la sintesi proteica. Un interessante romanzo è l'aumento dei livelli proteici di mTOR e Akt nel gruppo RET. L'aumento osservato in mTOR qui può contrastare qualsiasi possibile resistenza anabolica e contribuire ad aumentare la sintesi proteica.

VO 2max o, più correttamente, VO 2peak , è spesso valutato come il massimo VO 2 misurato durante un test in cui il tasso di lavoro è aumentato gradualmente fino all'esaurimento. Tuttavia, nei soggetti invecchiati e fragili, è difficile utilizzare esercizi esaurienti. Un problema è che non è raro che gli anziani hanno una malattia cardiovascolare latente che, durante un esaurimento esercizio fisico, porta ad un aumento del rischio di infarto. Un altro problema più tecnico è che la riduzione della forza muscolare piuttosto che una limitazione cardiorespiratoria può limitare il tasso di lavoro durante l'esercizio incrementale. L'interpretazione dei dati, in queste condizioni, sarà più complicata. Un metodo alternativo, utilizzato in questo studio, è quello di misurare HR e RER ad un tasso di lavoro fisso pre- e post-intervento. I risultati hanno mostrato che l'HR tendeva a diminuire nel RET ma aumentare nel gruppo CON. Ciò suggerisce che la formazione di resistenza migliora la capacità di esercizio di VO 2max e di resistenza. Questi risultati si combinano con i risultati in alcuni 9 ,"Xref"> 31, ma non tutti i 32 studi precedenti. Inoltre, parecchi risultati di questo studio dimostrano che la capacità aerobica muscolare migliora ( cioè con cambiamenti in una composizione di fibre più ossidativa e aumenti di una serie di proteine ​​mitocondriali). Anche se è ben noto che l'esercizio di resistenza migliora la capacità aerobica muscolare negli anziani, gli studi sulla formazione di resistenza forniscono una visione più contraddittoria 8 , 9 , 10 , 33 . Le differenze nello stato di addestramento iniziale e nei programmi di formazione possono spiegare i diversi risultati in diversi studi. I risultati presenti mostrano un forte aumento di alcune proteine ​​mitocondriali dopo solo otto settimane di formazione (i periodi di intervento precedenti sono stati> 12 settimane) dimostrano che la formazione di resistenza può essere una strategia efficace per migliorare la capacità ossidativa muscolare.

Nonostante il breve intervento, è stata osservata una migliore tolleranza al glucosio nel gruppo RET, come dimostrato dalla riduzione del glucosio AUC e del GLU 120 min . Anche se l'obesità e l'inattività fisica sono fattori associati ad un aumento del rischio di insulino-resistenza e diabete di tipo 2, i meccanismi molecolari rimangono oscuri. La composizione corporea alterata con aumento della massa muscolare contribuirà probabilmente alla migliore tolleranza al glucosio nel gruppo RET. Inoltre è stato ipotizzato che la resistenza all'insulina sia legata a uno stile di vita sedentario, con eccesso di lipidi che porta alla lipotossicità, alla disfunzione mitocondriale e allo stress ossidativo3. Il presente studio mostra che la formazione di resistenza produce un forte aumento delle proteine ​​ossidative mitocondriali. Noi ipotizziamo che l'aumento della capacità ossidativa muscolare è un fattore che spiega l'aumento della tolleranza al glucosio.

Le indagini con follow-up più lunghe sono desirIn grado di mostrare se e per quanto tempo gli effetti sulla salute persistono in termini di migliorata capacità aerobica muscolare, forza, potenza, glucosio e valori lipidici. Inoltre, è utile determinare la dose sufficiente di addestramento alla forza normale tra le persone anziane. Le applicazioni future sono anche misure di forza nei principali gruppi muscolari diversi dagli estensori del ginocchio. Si possono anche fare diverse altre analisi dettagliate all'interno delle cellule muscolari riguardanti varie proteine ​​e funzioni all'interno e senza i mitocondri.

È importante avere un giorno tra ogni giorno di prova senza attività fisica vigorosa o prolungata, lo stesso giorno o il giorno prima delle prove, in quanto ciò può influenzare l'esito delle valutazioni. Esempi di passi critici relativi all'istochemia e alla colorazione di ATPasi per la composizione del tipo di fibre includono la garanzia che il pezzo dalla biopsia sia trattato con isopentano poco dopo la biopsia e che l'isopentano sia al limiteT in modo che la biopsia non venga distrutta. Inoltre, il pezzo di biopsia deve essere "allungato o installato", in modo che le fibre puntino nella stessa direzione, prima del trattamento con isopentane. Durante la colorazione, il pH e la temperatura del laboratorio devono essere ottimali (e questo è difficile da prevedere). Tuttavia, questo è l'unico modo per garantire i tipi di fibre e l'area della fibra. Inoltre, il metodo è veloce, mostrando i risultati entro due giorni e la tecnica è relativamente poco costosa, senza necessità di prodotti chimici o dispositivi costosi.

Il distinto miglioramento della capacità aerobica muscolare dopo la formazione di forza sfida la visione che l'esercizio di resistenza è il modo preferito di esercizio. Tuttavia, nelle persone anziane con bassa VO 2max e forza muscolare, l'esercizio di resistenza deve essere eseguito a basse intensità. Uno degli stimoli principali della biogenesi mitocondriale è lo stress muscolare energetico 34 . Forza di formazione induÈ un stress energetico locale importante, mentre questo è meno evidente durante l'esercizio di resistenza a bassa intensità. Noi ipotizziamo che nelle persone anziane, la formazione di forza è più efficiente dell'esercizio di resistenza per aumentare la capacità aerobica muscolare. Inoltre, considerando i miglioramenti in alcuni parametri relativi alla salute e l'elevata conformità, la formazione di forza può essere raccomandata per gli anziani.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori sono grati a Andrée Nienkerk, Dennis Peyron e Sebastian Skjöld per la supervisione delle sessioni di formazione e di numerosi test; Ai soggetti partecipanti; A Tim Crosfield per la revisione linguistica; E al sostegno economico della Scuola svedese di sport e salute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Western blot
Pierce 660 nm Protein Assay Kit Thermo Scientific, Rockford, IL, USA 22662
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate  Thermo Scientific 34096
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific 78429
Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46430
Pierce Reversible Protein Stain Kit for PVDF Membranes Thermo Scientific 24585
10 st - 4–20% Criterion TGX Gel, 18 well, 30 µL Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA 567-1094
Immun-Blot PVDF Membrane  Bio-Rad 162-0177
Precision Plus Protein Dual Color Standards  Bio-Rad 161-0374
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737
10x Tris/Glycine Bio-Rad 161-0771
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 161-0710
Tween 20 Bio-Rad P1379-250ML
Band analysis with Quantity One version 4.6.3.software Bio-Rad
1% phosphatase inhibitor coctail Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA
Antibodies
mTOR (1:1,000) Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA 2983
Akt (1:1,000) Cell Signaling, Danvers 9272
Secondary anti-rabbit and anti-mouse HRP-linked (1:10,000) Cell Signaling, Danvers
Citrate synthase (CS) (1:1,000) Gene tex, San Antonio, California, USA
OXPHOS (1:1,000) Abcam, Cambridge, UK
Equipment - Analysis of muscle samples
Bullet Blender 1.5 for homogenizing Next Advance, New York, USA
Plate reader Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland
Histochemistry
Mayer hematoxylin HistoLab, Västra Frölunda, Sweden  1820
Oil Red o Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA 00625-25y
NaCl Sigma-Aldrich 793566-2.5 kg
Cobalt Chloride Sigma-Aldrich 60818-50G
Amylase Sigma-Aldrich A6255-25MG
ATP Sigma-Aldrich A2383-5G
Glycine VWR-chemicals / VWR-international, Spånga, Sweden 101196X
Calcium Chloride VWR-chemicals / VWR-international 22328.262
Iso-pentane VWR-chemicals / VWR-international 24872.298
Etanol 96% VWR-chemicals / VWR-international 20905.296
NaOH MERCK, Stockholm, Sweden 1.06498.1000
Na acetate MERCK 1.06268.1000
KCl MERCK 1.04936.1000
Ammonium Sulphide MERCK U1507042828
Acetic acid 100% MERCK 1.00063.2511
Schiffs´ Reagent MERCK 1.09033.0500
Periodic acid MERCK 1.00524.0025
Chloroform MERCK 1.02445.1000
pH-meter LANGE HACH LANGE GMBH, Dusseldorf, Germany
Light microscope Olympus BH-2, Olympus, Tokyo, Japan
Cryostat  Leica CM1950 Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Leica software Leica Qwin V3 Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, camera setup Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden 
Software program Quantift One - 4.6 (version 4.6.3; Bio Rad) Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden 
Oral glucos tolerance test, OGTT
Glukos APL 75 g APL, Stockholm, Sweden 323,188
Automated analyser Biosen 5140 EKF Diagnostics, Barleben, Germany
Insulin and C-peptide in plasma kit ELISA Mercodia AB, Uppsala Sweden 10-1132-01, 10-1134-01
Plate reader Tecan infinite F200 pro, Männedorf, Switzerland
Further equipment
Measures of fat-free mass FFM-Tanita T5896, Tanita, Tokyo, Japan
Strength training equipment for all training exercises Cybex International Inc., Medway, Massachusetts, USA 
Cycle ergometer  Monark Ergometer 893E, Monark Exercises, Varberg, Sweden 
Heart rate monitor RS800, Polar Polar Electro OY, Kampele, Finland
Oxycin-Pro - automatic ergo-spirometric device Erich Jaeger GmbH, Hoechberg, Germany
Isokinetic dynamometer, Isomed 2000, knee muscle strength D&R Ferstl GmbH, Henau, Germany
CED 1401 data acquisition system and Signal software Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK
Software for muscle strength analysis, Spike 2, version 7 Signal Hound, LA Center, WA, USA
Statistica software for statistical analyses Statistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, USA
Muscle biopsy equipment
Weil Blakesley conchotome Wisex, Mölndal, Sweden
Local anesthesia  Carbocain, 20 mL, 20 mg/mL; Astra Zeneca, Södertälje, Sweden 169,367
Surgical Blade Feather Safety Razor CO, LTD, Osaka, Japan  11048030

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References

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Chimica Numero 125 Esercizio resistenza alla resistenza resistenza mitocondri mTOR capacità aerobica sensibilità all'insulina tolleranza al glucosio.
Migliorare la forza, il potere, la capacità aerobica muscolare e la tolleranza al glucosio attraverso la formazione a breve termine di resistenza progressiva tra le persone anziane
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Andersson, E. A., Frank, P., Pontén, M., Ekblom, B., Ekblom, M., Moberg, M., Sahlin, K. Improving Strength, Power, Muscle Aerobic Capacity, and Glucose Tolerance through Short-term Progressive Strength Training Among Elderly People. J. Vis. Exp. (125), e55518, doi:10.3791/55518 (2017).

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