Summary
루멘 대동맥 및 대동맥의 봉합 결 찰에 폴리우레탄 카 테 터 삽입 adventitial 바사 vasorum hypoperfusion 인해 만성 저 산소 증 유발. 이 문서에서는 AAA의 인 간에 있는 유사한 특성을 가진 복 부 대동맥 동맥 류 (AAA)의 소설 동물 모델을 설명합니다.
Abstract
Adventitial 바사 vasorum (VV) 산소와 대동맥 벽에 영양을 제공합니다. 대동맥 벽에서 hypoxia 확대 복 부 대동맥 동맥 류 (AAAs) 발생할 수 있습니다. 이 문서는 소개 하 고 대동맥 루멘 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰에 폴리우레탄 카 테 터 삽입의 조합으로 만든 adventitial VV hypoperfusion 통해 AAAs를 유도 하는 데 사용 하는 표준 프로토콜에 설명 합니다.
프로토콜 남성 쥐 음식과 물 광고 libitum제공 되는 300-400 g 무게의 사용을 포함. 복 부 중간 복 부 절 개를 가진 개복 술 후 대동맥의 각 질 제거는 혈관 주위 조직에서 혈액 흐름을 차단 수행 됩니다. 신장 동맥 분 지에 인접 한 작은 절 개를 포함 하는 Aortotomy를 수행 하 고 폴리우레탄 테 18 게이지 내재 바늘을 사용 하 여 삽입 됩니다. 절 개, 수리 후 카 테 터를 통해 대동맥의 단단한 결 찰 대동맥 혈액의 흐름을 방해 하지 않고 대동맥 벽을 통해 인접 방향에서 VV 혈액 흐름을 차단 합니다. 이 기술은 진보 대동맥 팽창으로 AAA를 유도할 수 있다.
이 모델의 가장 큰 장점은 VV hypoperfusion 조직 hypoxia과 인간의 AAA의 그들과 유사한 형태학 및 병 적인 특성을가지고 있는 infrarenal AAA, 개발 원인입니다.
Introduction
복 부 대동맥은 다음 세 계층으로 구성: 내부 혈관 벽 (intima), 중간 레이어 (미디어), 그리고 혈관 외벽 (adventitia), 이들의 adventitia 독특한 혈액 공급 시스템 바사 vasorum (VV)로 알려져 있다. 대동맥 조직 adventitial VV 관류 하 고 대동맥 혈액 흐름1에서 간단한 산소 보급을 통해 산소와 함께 공급 된다. 그러나, 지리적으로, 복 부 대동맥 대동맥의 다른 부분에서에 비해 VVs의 최소 배포가 하고있다. 2
이전 연구 보고 인간의 복 부 대동맥 동맥 류에서 조직 hypoxia에 두꺼운 intraluminal 혈전 (ILT)3(AAA) 벽. 또한, 관련 된 조직 hypoxia AAA 벽4에서 상당히 높은 비율로 arteriosclerotic 변경 aneurysmal 벽에 adventitial VV 가려진은 표시 되었습니다. 이러한 결과에 따라, AAA의 소설 설치류 모델 adventitial VV hypoperfusion5를 유도 하 여 만들었습니다. 이 모델에서 VV hypoperfusion 발생 조직 hypoxia 및 infrarenal AAA, 형태학 및 병 적인 특성 인간 AAA6의 그들과 유사 했다의 개발. 주요 사례 ILTs의 존재와 형성 adipocytes6, 그리고 파열7,8를 일으킬 가능성이의 축적 했다. 이 발견 이전 설치류 모델에서 드물게 관찰 되었습니다. 따라서이 모델 메커니즘 AAA 개발 및 파열에 대 한 책임의 깊은 이해에 크게 기여할 수 있습니다. 소개 하 고 adventitial VV hypoperfusion 통해 AAAs를 유도 하는 데 사용 하는 표준 프로토콜을 설명 하 고 수술 기법을 사용 하 여 대동맥 벽에 저 산소 증을 유발 하는 방법을 설명.
Protocol
동물 보호 및 실험 동물 관리에 대 한 지침을 따라야 하 마마 츠 대학 학교의 의학 동물 관리 위원회의 센터에서 수행 했다.
1. 모델을 만들기 위한 수술
참고: 10 구슬 소독 기에 수술 도구를 배치 s preoperatively. 멸 균 글러브를 사용 하 여 intraoperatively.
- 사용 남성 쥐 300-400 g.를 무게 쥐 음식에 대 한 액세스를 허용 하 고 광고 libitum 물.
- 는 Isoflurane 흡입 (2.0-3.0 mL/L)와 쥐 anesthetize. 발가락 핀치에 의해 적절 한 anesthetization를 확인 하십시오.
- 전기 면도기, 복 부에 머리를 면도 하 고 알코올과 povidone-요오드 솔루션으로 복 부를 문질러.
- 작업 테이블에서 부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 수 의사 연 고를 사용 하 여 쥐에 ' 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 s 눈.
- 는 개복 술 복 부 정중 선 복 부 절 개를가 위를 사용 하 여 수행 합니다. 분명 수술 필드 확보, 팩 복 부 내용 복 부 구멍 안에 상처 견인을 사용 하 여 멸 균 거 즈와.
- 대동맥 혈관 주위 조직에서 분리 하려면 부드럽게를 선택 하 고는 retroperitoneum 대동맥 벽을 노출 하 고 벗 겨 지 다 infrarenal 대동맥에서 분기 왼쪽된 신장 정 맥의 수준에서 후 공간에 핀셋으로 눈물은 혈관 주위 조직 ( 그림 1A).
- 블록 혈액을 5-0 실크 문자열 복 부 대동맥에서 분기 혈관 대동맥 루멘 좁은 하지 않는 대동맥에서 지점에서 공급 하는 Ligate.
- 대동맥 혈액 흐름을 차단 하는 혈관 클립 바로 아래 신장 동맥 및 대동맥의 분기 바로 위에 배치.
참고: 클립의 크기는 혈액의 흐름을 완전히 차단 하 대동맥 직경 보다 큰 이어야 합니다. 임시 5-0 실크 문자열 합자 만으로는 또한 클립 대신 혈액 흐름을 차단. - 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하려면 대동맥 클립, 신장 동맥 분 지에 인접 한에서 distally 마이크로 시저 5mm를 사용 하 여 앞쪽 대동맥 벽을 잘라 대동맥 벽의 표면에 점 출혈을 만드는 비슷합니다.
- 폴리우레탄 카 테 터 삽입 (0.55 m m, 내경 외경 0.37 m m)를 물으로 대동맥에서 혈액을 씻어 절 개를 통해 얕게 바늘 내재 24 게이지를 사용 하 여. 폴리우레탄 테에 물으로 채워진 1 mL 주사기를 관리 하 고 물으로 대동맥에 나머지 혈액을 멀리 세척. 관개, 후 대동맥에서 카 테 터 제거.
- 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하기 전에 (1.20 m m, 내경 외경 0.94 m m) 18-게이지 내재 바늘을 사용 하 여 잘라 폴리우레탄 테 길이가 10 mm ( 그림 1B).
1.9 단계에서 만든 절 개에서 대동맥 루멘으로 폴리우레탄 카 테 터의
- 삽입 잘라 조각. 완전히 10 m m 카 테 터 대동맥 루멘으로 놓고 절 개 위치에 맞게 카 테 터의 중간점 위치 (즉, 카 테 터와 절 개를 커버).
- 8-0 monofilament 문자열 ( 그림 1C)을 사용 하 여 중단 봉합 절 개를 복구.
- 선 5-0 실크 문자열 및 폴리우레탄 테 ( 그림 1D)의 조합을 사용 하 여 복 부 대동맥.
참고: 대동맥 루멘 내재 카 테 터에 의해 유지 수 있습니다. 카 테 터 위치 이후 방지 하기 위해 단단히 대동맥 선 외과 의사 ' s 매듭은 것이 좋습니다 때 묶는 매듭, 두 배 overhand 매듭 형성의 첫 번째 던지기는 여분의 트위스트를 추가 하 고 추가 차례 더 많은 마찰을 제공 하 고 완화 하는 것을 줄일 수 있습니다. - 결 찰, 후 대동맥 분기점에서 혈관 클립을 제거 한 다음, 제거를 antegrade 혈액 흐름을 복원 하는 신장 동맥 아래 혈관 클립. 심한 대동맥 맥 동 확인.
- 두 레이어, 복 막 및 다른 레이어, 4-0 폴 리 프로필 렌 봉합에 복 부 절 개를 닫습니다. 단단히 protruded 오르간을 방지 하기 위해 절 개를 봉합.
- 복 부 절 개에 국 소 lidocaine을 적용합니다. 식을 반환 될 때까지 난방 패드에 쥐를 놓습니다. 두지 마십시오 쥐 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 그것은 완전히 복구 될 때까지 작업을 다른 쥐의 회사를 겪고 있다 쥐를 반환 하지 않습니다.
- 작업 후 쥐 밀접 하 게 모니터링합니다. 쥐 조 난 또는 몸 체중 감소의 흔적을 보여줍니다 하는 경우 멸 균 식 염 수 (1.0-2.0 mL) bolus를 피하 주사.
- Postoperatively, 초음파 echogram에 확대 대동맥의 시간-과정 개발을 관찰합니다. 설명 5 복 부 대동맥의 외부 가장자리에 가장자리 안쪽에서 최대 직경 측정.
2. 수확, 고정, 및 Elastica 반 Gieson (EVG) 얼룩
- 28 일 postoperatively, sodium pentobarbital 관리 ≥ 100 mg/kg는 쥐를 안락사를 intraperitoneally.
- 자르면 쥐 ' s 복 부 구멍 ventrally. 메스를 사용 하 여 초기 절 개를 확인 합니다. 가 위를 사용 하 여 동맥 류를 수확 하 고 수확된 aortas 24-48 헤에 대 한 중립으로 버퍼링 하는 10% 포 르 말린에 장소
참고: 외과 의사는 동맥을 노출 하는 경우 대동맥과 다른 장기에 부상을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다. 높은 복 부 기관, AAA 형성을 나타내는 관찰 한다. 그림 2는 vivo에서 이미지와 비보 전 이미지; AAAs의 견본이 파열 되지. - EVG 얼룩 9
- 솔루션 준비
- 준비 Verhoeff ' 주어진된 순서에 따라 다음을 혼합 하 여 s hematoxylin: 알콜 되며 20 mL, 10% 제 2 철 염화 8.0 mL, 그리고 Lugol ' s 요오드 8 mL. 각 추가 사이 솔루션을 믹스. 이 솔루션을 필요에 따라 신선한 준비 될 수 있다.
- 준비 반 Gieson ' s 솔루션 1% 산 fuchsin 혼합 하 여 1 mL 및 포화 picric 산 45 mL. 고 서 서 하룻밤 잘 수 있습니다. 이 솔루션은 2 주 동안 안정.
- 준비 차별화 솔루션 (2% 제 2 철 염화 물) 10% FeCl 3 10 mL 40 ml에서를 혼합 하 여 증류수. 이 솔루션을 필요에 따라 신선한 준비 있습니다.
- 5.0 g 나트륨 thiosulfate 증류수 100 mL 물에 용 해 하 여 준비 5% 포. 이 솔루션은 1 년 동안 안정.
- 얼룩 절차
참고: 자세한 내용은 참조 하십시오 참조 9.- Verhoeff에는 aortas를 배치 하는 10 분을 위해 간단히, 증류수에 수확된 aortas의 고정된 파라핀 섹션 화 ' s 되며 물과 차별화 솔루션 (2% FeCl 3)에서 10-30 배 수영 25 분 세척에 대 한. 린스 물에. 1 분 씻어 물에 대 한 5% 포에 놓습니다. 반 Gieson에서 ' 5 분에 대 한 s 솔루션
- Dehydrate 다음에서 알코올에 순서: 75%, 90%, 95%, 100%, 그리고 100% 알코올 30 s 각. 그런 다음, 선택을 취소 5 분, 크 실 렌에 두 번 합니다. 수 지 장착 매체 coverslip에.
참고: 탄성 섬유 표시 검정; 블루 블랙 핵: 즐 블루ck; 콜라겐: 빨강; 그리고 다른 조직 요소: 노란색.
- 솔루션 준비
Representative Results
기술된 요원 기술 쥐에 폴리우레탄 카 테 터 삽입 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰의 조합을 사용 하 여 만성 대동맥 hypoxia 유발 동맥의 새로운 동물 모델을 만듭니다. 쥐 프로토콜 섹션에 설명 된 절차 후 안락사 28 일 있었다. aortas 수확 되었고 동맥 류 형성을 시각화 하기 위해 몇 군데. 그림 2 는 방 추상 AAA의 개발. Ex vivo에서 대동맥의 위쪽과 아래쪽 끝 팽창 없이 정상적인 직경이 있다. 대동맥 직경 transabdominal 초음파 (그림 3)를 사용 하 여 측정 되었다. 지름은 일반적으로 프로시저; 후에 대략 14 일에 최대 크기에 도달 그 후, 그것은 그대로 또는 약간 증가. 그림 4 는 EVG 얼룩 후 최대 직경에는 동맥의 histopathological 이미지를 보여준다. (동맥)의 28 일에 조직 이미지 날 0에 비해 탄성 섬유의 저명한 저하를 보였다.
복 부 대동맥 동맥 류 (AAA)를 유도 하기 위해 그림 1: 수술 절차.
(A) infrarenal 대동맥 주변 조직에서 피부 박피입니다. (10 m m 긴 컷 B)는 폴리우레탄 카 테 터 대동맥에 작은 절 개를 통해 삽입 됩니다. (C) 절 개는 8-0 monofilament 봉합으로 복구 되 고 혈액의 흐름이 복원 됩니다. (D)는 대동맥은 삽입 된 카 테 터에 5-0 비단 봉합으로 출혈. 눈금 막대 = 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 수술 후 대표 결과입니다.
방 추상 복 부 대동맥 동맥 류 수술 후 하루 28 보여주는 개발에 거시적인 전망. retroperitoneum의 높은 마진 (깨진된 선; 왼쪽) 동맥의 외부 가장자리에 해당합니다. Ex vivo에서 대동맥의 위쪽과 아래쪽 끝 (오른쪽) 정상입니다. 눈금 막대 = 3 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 최대 대동맥 직경 transabdominal 초음파를 사용 하 여 측정
대동맥 직경은이 쥐 모델에서 꾸준히 증가 했다. 대동맥 직경은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다 (n = 12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 얼룩 Elastica 밴 Gieson와 aneurysmal 조직의 대표 이미지.
EVG 퇴행 성 탄력 있는 lamina에서 보여주는 미디어와 intraluminal 혈전의 형성 절차 후 28 일 (오른쪽) 얼룩과 조직학 평가. 대동맥 미디어에 탄성 섬유 조각화 및 대동맥 adventitia에 스파스 콜라겐 섬유는 28 일에 관찰 된다. 0 (왼쪽) 프로시저가 전에 이다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
생리 적인 조건 하에서 대동맥 벽의 내부 레이어는 외부와 중간 레이어는 영양 VV, adventitia에서 중간 VV1에 침투 하는 반면 luminal 혈액 흐름에서 확산에 의해 영양는 있습니다. VV 혈 복 부 대동맥 벽에는 다음 세 가지 방향/영역에서 발생 한 수 있습니다: (1) 대동맥 벽, 대동맥 벽, 및 (3) 혈관 주위 조직10(2) 원심 방향 통해 인접 방향. 이전에, 인간의 조직의 조직학 분석 중요 한 협 착 또는 폐색 복 부 대동맥 벽에 VV 혈액 흐름 감소4수 제안 AAA 벽에 VV의 식별. 그것은 infrarenal AAA 폴리우레탄 카 테 터 삽입 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰의 조합에 기인 했다이 프로토콜에서 매우 중요 한 포인트. 신중 하 게 조직 계층을 벗 겨 지 다, 외과 원활 하 게 대동맥에 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하 고 단단히 hypoperfusion adventitial VV 및 동맥 류 형성으로 인해 만성 저 산소 증을 대동맥 선 해야 합니다. 이러한 기술을 사용 하 여, 대동맥 벽에 혈액의 흐름을 따라서 감소 하 고, 그리고 로컬 hypoxic 환경 유발 됩니다. 혈액 흐름 감소와 hypoxia 유발 동맥 형성 나타냅니다 VV 혈 복 부 대동맥 벽으로 AAA 형성의 병 인에는 역할을 한다.
특히, 대동맥 동맥 모델 다음 조건을 충족 해야 합니다: 기준선, tunica 매체의 퇴보와 대동맥 벽의 염증에 비해 혈관 직경에 1.5-fold 증가. 가장 인기 있는 동물 모델 유도 하는 염증 성 반응을 CaCl211, elastase12, angiotensin II13등 물질을 사용 하 여 건설 되었습니다. 이 모델 수 높은 재현성을가지고 하 고 분명히 병 적인 변화를 일으킬 그들은 일반적으로 연구에서 사용 된. 우리의 모델에서 우리는 사용 하 여 초음파에서 7 일 마다 절차 (그림 3) 후 날 28까지 절차를 수행 하기 전에 대동맥 직경 평가. 결과 대동맥 직경 적당히 증가 28 일 동안, 직경에 있는이 변화는 이전 설치류 모델에서 유사한 나타내는 보여주었다. 혈관 형태의 총 관찰 표시 부드러운 방 추상 모양 (그림 2). 28 일에 우리는 쥐를 희생 하 고 복구 된 대동맥 조직의 histopathological 분석을 수행. 찢 어과 tunica 매체와 adventitia의 탄성과 콜라겐 섬유의 실종 (그림 4) 관찰 되었다. 또한, 염증 세포, 대 식 세포, 등 tunica 매체 tunica adventitia에서 참석 했다.
현재, AAAs 사용할 수 있는 치료 옵션에 외과 혈관 내 수술 텐트 접목, AAA 파열14환자의 30-50%의 사망률으로 제한 됩니다. 그러나, 약 AAAs 치료 임상 사용을 위해 승인 되었습니다. 병 적인 결과 인간과 AAA 연구에 사용 되는 설립된 동물 모델 사이에서 불일치는 논쟁이 있다. 인간의 AAA 및 AAA 모델 동물 간의 병 인 유사성 약리 치료의 발전을 위해 필수적입니다. 설치류 모델의 효과 관한 우리의 쥐 모델은 형태학 상으로 인간 intraluminal 혈전5 와 지질8점에서 비슷합니다. 또한,이 연구에서 쥐의 약 20%가 AAA 파열 졌고 절차 후 28 일 이내에 사망 했다. 대동맥 동맥 류 파열은이 질병에 대 한 가장 중요 한 이벤트, 파열 설립 실험 AAA 모델, 공통 이며 메커니즘은 아직 해명 하지 했습니다. 따라서,이 모델은 대동맥 직경의 팽창과는 동맥의 파열의 메커니즘을 이해 하는 데 유용 합니다.
이 모델의 창조는 어떤 수술 절차에 대 한 필요 합니다. 따라서, 연구자는이 모델의 한계는이 모델을 만드는 연습 해야 합니다. 미래에, 우리는 우리가 줄일 수 있습니다 혈액 흐름 점차 VV 벽을 두껍게 하 여 자발적인 대동맥 동맥에서 발생 한 설치류 모델을 만드는 고 싶습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에 대 한 과학적 연구 (B) (20291958) N.U.;에 보조금에 의해 지원 되었다 젊은 과학자를 위한 연구비 뉴질랜드를 (A) (25713024)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat | Japan SLC.Inc | Slc:SD rat | Sprague–Dawley ratTM |
| povidone-iodine solution | Libatape Pharmaceutical Co., Ltd. | 4987335 111457 | |
| 5-0 silk string | Akiyama Medical MFG. CO.,LTD | JIS No.1 | |
| vascular clips | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | C-42-S-2 | |
| polyurethane catheter (24-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 24G | Supercath Z4VTM, 24-gauge indwelling needle |
| polyurethane catheter (18-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 18G | Supercath Z3VTM, 18-gauge indwelling needle |
| 8-0 monofilament string | Ethicon Suture | c-42-S-2 | PROLENE Polypropylene Suture, Repair the incision with the suture |
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