Summary
Diese Studie beschreibt die erfolgreiche Generierung von ein neues Tiermodell für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), indem man immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon.
Abstract
Chronischer obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) zeichnet sich durch anhaltende Luftstrom Einschränkung und Lunge parenchymatösen Zerstörung. Es hat eine sehr hohe Inzidenz in alternden Bevölkerung. Die aktuellen konventionellen Therapien für COPD Fokus hauptsächlich auf Symptom-modifizierende Drogen; die Entwicklung neuer Therapien ist daher dringend erforderlich. Qualifizierte Tiermodellen der COPD könnte dazu beitragen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu charakterisieren und eignet sich für neue Drogen-Screening. Aktuelle Modelle der COPD, wie Lipopolysaccharid (LPS) oder die Schweine Pankreas Elastase (PSA)-induzierte Emphysem Modell generieren COPD-ähnliche Läsionen in der Lunge und Atemwege aber nicht sonst ähneln die Pathogenese der menschlichen COPD. Eine Zigarette zu rauchen (CS)-induzierte Modell bleibt eines der beliebtesten, weil es nicht nur COPD-ähnliche Läsionen in den Atemwegen simuliert, aber es basiert auch auf einer der wichtigsten gefährlichen Stoffen, die COPD in den Menschen verursacht. Allerdings beschränken die zeitraubende und arbeitsintensive Aspekte des Modells CS-induzierte drastisch ihre Anwendung in der neuen Wirkstoff-Screening. In dieser Studie erzielten wir erfolgreich ein neues Modell der COPD, indem man Mäuse zu hohen Niveaus des Ozons. Dieses Modell zeigt die folgenden: 1) erzwungene exspiratorischen Volumen 25, 50 und 75/gezwungen Vitalkapazität verringert (FEV25/FVC, FEV50/FVC und FEV75/FVC), unter Angabe der Verschlechterung der Lungenfunktion; (2) erweiterten Lungen-Alveolen mit Lungen-Parenchym Zerstörung; (3) reduziert Müdigkeit Zeit und Distanz; und 4) Entzündung erhöht. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Ozon Exposition (OE) Modell ein zuverlässiger Tiermodell das ähnlich wie beim Menschen ist ist, weil Ozon Überbelichtung ist eines der ätiologischen Faktoren der COPD. Darüber hinaus dauerte es nur ca. 6-8 Wochen, basierend auf unsere bisherige Arbeit, um eine OE-Modell zu erstellen, es erfordert 3-12 Monate induzieren das Zigarettenrauch Modell, darauf hinweist, dass die OE-Modell eine gute Wahl für COPD Forschung werden könnte.
Introduction
Es wurde geschätzt, dass COPD, Emphysem und chronische Bronchitis, darunter möglicherweise die dritte Todesursache in der Welt im Jahr 20201,2. Das mögliche Auftreten von COPD in einer Bevölkerung über 40 Jahre alt wird voraussichtlich 12,7 % bei Männern und Frauen innerhalb der nächsten 40 Jahre38,3 %. Keine Medikamente sind derzeit für die progressive Verschlechterung der COPD Patienten4rückgängig zu machen. Zuverlässige Tiermodellen der COPD nicht nur fordern die Nachahmung des pathologischen Prozesses Erkrankung aber auch benötigen eine kurze Generation. Aktuelle COPD-Modelle, einschließlich der LPS oder ein PSA-induzierte Modell induzieren können Emphysem-ähnliche Symptome5,6. Eine einzige Verwaltung oder eine Woche lang Herausforderung von LPS oder PSA auf Mäuse oder Ratten führt zu deutlichen Neutrophilie im alvéolaire Lavage Fluid (BALF), Erhöhungen Pro-inflammatorischen Mediatoren (z. B. TNF-α und IL-1β) in BALF oder Serum, produziert die Lunge Parenchym Zerstörung erweiterten Lufträume und Grenzen Luftstrom5,6,7,8,9,10. Jedoch LPS oder PSA sind keine Ursachen der menschlichen COPD und somit nicht zu imitieren den pathologischen Prozess11. Ein CS-induzierte Modell produziert eine persistente Luftstrom Einschränkung, Lungen-Parenchym Zerstörung und funktionelle Übung Kapazität verringert. Eine traditionelle CS-Protokoll erfordert jedoch mindestens 3 Monate um eine COPD Modell12,13,14,15zu generieren. Daher ist es wichtig, eine neue, effizientere Tiermodell zu generieren, die die zwei Anforderungen erfüllt.
Vor kurzem neben Rauchen, Luftverschmutzung und berufsbedingte Exposition häufiger Ursachen der COPD16,17,18geworden. Ozon, als eines der wichtigsten Schadstoffe (obwohl nicht Hauptbestandteil der Luftverschmutzung), kann direkt mit der Atemwege reagieren und schädigen das Lungengewebe von Kindern und Jugendlichen Erwachsenen19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, sowie andere Stimulatoren wie LPS, PSA und CS, engagieren sich in eine Reihe von biochemischen Wege der pulmonale oxidativen Stress und DNA-Schäden und Zusammenhängen für die Initiierung und Förderung von COPD26,27. Ein weiterer Faktor ist, dass die Symptome der COPD-Patienten verschlechtert sich nach Ozon, darauf hinweist, dass Ozon Lunge Funktion18,28,29stören kann ausgesetzt werden. Aus diesem Grund generiert wir ein neues Modell der COPD durch immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon für 7 Wochen aussetzen; Dies führte zu Luftstrom Mängel und parenchymatösen Lungenschäden ähnlich denen von früheren Untersuchungen30,31,32. Wir erweitern das OE-Protokoll zu weiblichen Mäusen in dieser Studie und erfolgreich reproduziert das Emphysem beobachtet bei männlichen Mäusen in unserem vorherigen Studien30,31,32. Da COPD-Mortalität bei Männern zurückgegangen aber erhöht bei Frauen in vielen Ländern33, eine COPD-Modell bei den Weibchen notwendig ist, um die Mechanismen zu studieren und therapeutischen Methoden für weibliche COPD-Patienten zu entwickeln. Die Anwendbarkeit des OE-Modells für alle Geschlechter unterstützt weitere seine Verwendung als ein COPD-Modell.
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Protocol
Hinweis: die OE-Modell generiert und in bereits berichtet Forschung 30 , 31 , 32 verwendet wurde. Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University.
1. Mäuse
- Haus Erreger frei, 7 bis 9 Woche alten weiblichen BALB/c Mäusen in einzelnen belüftete Käfige in ein Tier Anlage unter kontrollierten Temperatur (20 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40-60 %). Bieten Sie eine leichte 12 h und 12 h-dunkel-Zyklus in der Anlage. Nahrung und Wasser Ad Libitum.
2. Ozon oder Luft Exposition
- erzeugen Ozon mit einem elektrischen Generator in einer Abdichtung (z.B. Plexiglas) Acryl-Box. Schlag die Luft aus der Box mit einem kleinen Gebläse durch eine Entlüftungsleitung, der auf der innen- und Außenseite der Box verbunden ist. Überwachung der Konzentration des Ozons in der Box mit einem Ozon-Sonde. Warten, bis die Konzentration von Ozon im Feld 2,5 Teile pro erreicht million (ppm).
Hinweis: Die Ozon-Sonde kann der Ozon-Generator automatisch wechseln, ein- oder ausschalten und pflegen das Ozon-Niveau im Feld bei 2,5 ppm. - Statt die Mäuse in das Feld, wenn die Ozon 2,5 ppm erreicht. Halten Sie sich die Mäuse in der Box für 3 h jedes Mal Ozon ausgesetzt.
Hinweis: Feld kann Erhaltung ein Ozon 2,5 ppm in den 3 h durch die Ozon-Generator automatisch ein- und Auschalten und bläst die CO 2, die entsteht durch die Mäuse out of the Box. - Geben zwei Ozon Belichtungen (jeder Belichtung dauert 3 h) pro Woche (einmal alle 3 Tage) für 7 Wochen; Kontrollmäusen Luft gleichzeitig und im gleichen Zeitraum aussetzen.
3. Mikro-Computertomographie
- am Ende der 7. Woche, betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht reagieren auf eine Zehe Prise. Monitor und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.
- Legen den narkotisierten Mäuse in der Kammer ein Mikro-Computertomographie (µCT).
- Kalibrieren der µCT unter Verwendung der standard-Protokoll und der Hersteller ' Anweisungen. Festlegen der Röntgenröhre um 50 kV und der Strom am 450 µA.
Hinweis: Sowohl der Röntgen- und der Detektor drehen sich um die Mäuse. - Führen Sie die µCT-Analyse durch den Erwerb von 515 Projektionen mit einer effektiven Pixelgröße von 0,092 mm eine Belichtungszeit von 300 ms für eine Scheibe und eine Scheibendicke von 0,093 mm.
- Rekonstruieren die Lunge mit der aufgenommenen Bilder mit Hilfe einer Software. Passen Sie die Helligkeit des Graustufen-Bildes durch Festlegen von Minimum und Maximum der Graustufen-750 und-550 Hounsfield-Einheiten bzw..
Hinweis: Die Software berechnet automatisch die Bände des Lungenparenchyms und der niedrige Dämpfung Bereich (LAA) 34 , 35. - Berechnung des Prozentsatzes von LAA (LAA %) dividiert das LAA-Volumen durch das gesamte Lungenvolumen.
4. Laufband testen
- geben die Mäuse eine Anpassung mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 10 min auf einem laufenden Laufband Maschine Hinweis testen: der Strom ist immer deaktiviert, wenn das Verfahren durchgeführt wird.
- verwalten ein Dauertest für die Mäuse.
- Wärmen die Mäuse mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 5 min.
- Erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 15 m/min für 10 min.
- Die Trainingsintensität zu erhöhen: erhöht die Geschwindigkeit von 5 m/min, ab 20 m/min., alle 30 min. bis Mäuse kann nicht weiter 36 ausgeführt.
- Erfassen die gesamte Laufstrecke und Laufzeit als Müdigkeit Distanz und Müdigkeit Zeit bzw..
5. pulmonale Funktion Messungen
- betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus reagiert nicht auf eine Zehe Prise und warten, bis die Mäuse spontane Atmung. Monitor unterhalten und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.
- Tracheostomize die Mäuse sorgfältig und legen Sie sie in einen Körper Plethysmogramm, die an eine Computer-gesteuerte Lüfter angeschlossen ist.
Hinweis: Belüftung erfolgt über ein Ventil befindet sich proximal zu den Endotrachealtubus. Das Setup bietet verschiedene halbautomatische Manöver, einschließlich die quasi-statische Druck-Volumen-Manöver und das Manöver schnell Spülmenge. - Durchschnittlich Atemfrequenz von 150 Atemzüge/min um den narkotisierten Maus über druckgesteuerte Beatmung bis eine regelmäßige Atmung zu verhängen und komplette Ablauf bei jedem Atemzyklus erzielt wird.
- Führen das quasi-statische Druck-Volumen-Manöver mit dem Gerät mithilfe der Unterdruck erzeugt in der Plethysmogramm.
- Führen Sie durch die schnelle Strömung Volumen Manöver in die quasi-statische Druck-Volumen-Loops zum Aufzeichnen der FVC und der FEV. Aufblasen die Lunge + 30 cm H 2 O und sofort danach verbinden Sie es mit einem äußerst negativen Druck zur Durchsetzung Ablauf bis das Restvolumen der FEV in den ersten 25, 50 und 75 ms Ausatmung (FEV 25-30 cm H 2 O. Record ist FEV 50 und FEV 75, beziehungsweise). Lehnen Sie die suboptimale Manöver. Für jeden Test mit jedem Mausklick führen mindestens drei akzeptable Manöver, einen zuverlässigen Mittelwert für alle numerischen Parametern zu erhalten.
6. BALF Sammlung
- nach terminal Anästhesie mit Pelltobarbitalum Natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht auf eine Zehe Prise reagieren und Atem zu verlieren), Lavage der Mäuse mit 2 mL PBS über eine 1 mm Durchmesser endotracheal Schlauch und dann abrufen BALF 10.
- Die abgerufenen Lavage Aliquote bündeln und Zentrifugieren sie bei 4 ° C und 250 X g für 10 min.
- Den Überstand für den sofortigen Einsatz sammeln und speichern den Rest bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff.
- Zählen die Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
- Der Zelle Pellet in PBS und dann Spin (1.400 x g, 6 min) 250 µL resuspendierte Zellen auf Folien mit einer Folie Spinner Zentrifuge Aufschwemmen.
- Gelten Wright zu beflecken Zellen auf den Folien nach Angaben des Herstellers ' s Protokoll.
- 200 Zellen pro Maus; identifizieren die Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, nach standard Morphologie unter 400 X Vergrößerung; zählen und ihre Nummern.
7. Kardiale Blutabnahme
- Blut über Herzpunktion zu sammeln, laden Sie es in 1,5 mL Röhrchen, und halten Sie es für 30 min auf Eis
- Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 2.000 x g und 4 ° c
- Übertragung den überstand (Serum) zu einem neuen Schlauch und bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff aufbewahren.
- Bereiten das Serum für IL-1β, IL-10 und Tests zum Nachweis von TNF-α mit der jeweiligen ELISA-Kits.
8. Lunge morphometrische Analyse
- zu sezieren, die Lunge und Tracheas von den Mäusen.
- Stellung jedes euthanasierten Maus auf eine chirurgische Board sofort nach Opfer.
- Sezieren entfernt das Platysma und vorderen trachealen Muskeln zu visualisieren und Zugriff auf die trachealen Ringe.
- Open up der thorakalen Hohlraum. Sezieren von Lunge und Luftröhre, aber nicht das Herz aus der Lunge zu trennen.
- Den endotrachealen Katheter an eine Spritze mit 4 % Paraformaldehyd durch ein PE90 Polyethylen-Rohr anschließen.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und verwenden Sie die Lösung in einer Dampfhaube. - Aufblasen die Lunge komplett mit 4 % Paraformaldehyd (10 Tropfen, ~ 200 µL) durch den Endotrachealtubus Katheter. Entfernen Sie das Herz nach dem Abschluss der Inflation.
- Pflegen der Lunge in der 15 mL Tube mit 10 mL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Std.
- Die Lunge in Paraffin einbetten. Erhalten Sie 5 µm Abschnitte durch Paraffinblock mit einem rotierenden Mikrotom. Während dem Schneiden, setzen Sie die maximale Fläche von Lungengewebe im Bereich Bronchialbaum.
- Für morphometrische Analyse durchführen, Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken auf den Abschnitten.
- Bild in den Abschnitten mit aufrechten Hellfeld Mikroskop (Objektiv, 20 X, Belichtungszeit, 1,667 ms).
- Haben zwei Ermittler geblendet, das Behandlungsprotokoll die histologischen Abschnitte unabhängig voneinander zählen. Verwenden Sie die mittlere lineare abfangen (L m) als Parameter zum Messen des Abstands zwischen alveoläre septal Wand. L-m mit den folgenden Schritten zu bestimmen:
- die Bilder der Abschnitte in Photoshop öffnen und ein Fadenkreuz-Gitter auf das Bild mit fünf 550 µm langen Leitungen zeichnen.
- Die Anzahl der Alveolen über die Rasterlinie.
- L m berechnen indem man die Länge der Rasterlinie durch die Anzahl der Alveolen. Für die Quantifizierung Bild fünf Abschnitte per Mausklick. Zehn Bilder der einzelnen Abschnitte (ein Bild pro Feld) zu erwerben und nach dem Zufallsprinzip zu beurteilen. Während der Feldauswahl, vermeiden Felder der Atemwege und Schiffe durch ein Feld verschieben, vor oder in eine andere Richtung.
Hinweis: Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt Ein UN-gepaarter t-Test wurde für den Vergleich zwischen Luft-exponierten Mäusen und Ozon ausgesetzt Mäusen durchgeführt. Drei Tiere jeder Gruppe wurden verwendet, um die erhebliche Differenz berechnen. Ein p-Wert von < 0,05 galt als bedeutende.
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Representative Results
Beispiele für 3D µCT-Bilder der einzelnen Gruppen werden in Abbildung 1eineangezeigt. Die Ozon-exponierten Mäuse hatten einen deutlich größeren totale Lungenvolumen (Abbildung 1ein und b) und LAA % (Abbildung 1c) als die Luft-exponierten Kontroll-Mäusen hat. Das Lungenvolumen und LAA % weiterhin auf erhöhtem Niveau nach sechs Wochen von Ozon Exposition31,32. Erhöhtes Lungenvolumen und LAA % repräsentieren die Emphysem-Phänotyp. Beispiele der Lunge alveoläre Erweiterung in Abbildung 2eine veranschaulichen die Emphysem-Bildung. Eine Erhöhung der mittleren linearen abfangen (Lm) verzeichneten Ozon ausgesetzt Mäuse (Abbildung 2b), die bestätigt, dass die Lunge parenchymatösen Zerstörung nach Ozonbelastung aufgetreten sind.
Lungenfunktion wurde gemessen, indem der Luftstrom Rate Parameter, wie FEV25/FVC, FEV50/FVC und FEV75/FVC. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Parameter, die bei Ozon-exponierten Mäusen (Abbildung 3a-c) verringerte sich der typische Lunge Funktionsstörungen in COPD Patienten4,37entsprächen. Um das OE-Modell weiter zu bewerten, führten wir eine Übung-Toleranz-Test, die ersetzt für die 6-minütiger Spaziergang Test (6MWT)38,39, die häufig verwendet, um Änderungen in funktionelle körperliche Belastbarkeit bei COPD-Patienten zu beurteilen. Die Ozonbelastung signifikant verringert die Müdigkeit Zeit und Müdigkeit-Entfernung (Abbildung 4ein und b).
Um die Pathogenese der COPD in der OE-Modell zu begegnen, wurden die Makrophagen und Neutrophilen aus den BALFs der Mäuse gezählt; Pro-inflammatorische Zytokine (IL-1β und TNF-α) und Anti-inflammatorische Zytokine (IL-10) wurden in der Maus Sera erkannt. Die Ozon-exponierten Mäuse zeigten eine signifikante Zunahme der entzündlichen Zellen, einschließlich Makrophagen und Neutrophilen (Abbildung 5a-c), sowie eine signifikante Abnahme der IL-10 und erhöhter IL-1β und TNF-α (Abbildung 6a-c ). Alle Daten zeigten, dass die OE Modell rekapituliert menschlichen COPD-ähnliche Symptome.
Abbildung 1. Ozonbelastung erhöht das Lungenvolumen und LAA % röntgenologisch µCT. (a) repräsentative 3D-Bilder zeigen die Lunge Luft oder Ozon ausgesetzt Mäuse in 7 Wochen nach der jeweiligen Exposition. (b) individuelle totale Lungenvolumen der beiden Gruppen wurden die 3D-Bilder für Statistik entnommen. Ozon-exponierten Mäusen zeigte einen signifikanten Anstieg im gesamten Lungenvolumen. (c) individuelle und mittlere LAA % der beiden Gruppen. Ozon-exponierten Mäuse zeigten eine deutliche Steigerung in LAA %. Die rote Farbe zeigt LAA (Voxel mit dichten von 2.550-2.700 Hounsfield Einheiten). Der Luftröhre und Bronchien in rot in dieser Abbildung dargestellt wurden entfernt, um die Lunge LAA zu berechnen. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M präsentiert ** P < 0,01, *** P < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Ozonbelastung erhöht die Lm. (a) repräsentative Mikrographen Lunge alveoläre Räume in HE-gefärbten Abschnitte der Luft ausgesetzt oder Ozon ausgesetzt Mäuse. (b) einzelne Werte von Lm wurden aus der Lunge Abschnitte der beiden Gruppen für Statistiken quantifiziert. Ein Anstieg der Lm war bei Ozon-exponierten Mäusen beobachtet. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M präsentiert ** P < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Ozonbelastung verringerte Lungenfunktion. (c) Aus der Luft ausgesetzt und Ozon ausgesetzt Mäuse, die einzelnen FEV in den ersten 25, 50 und 75 ms von Fasten Ablauf (FEV25FEV50und FEV75, beziehungsweise), sowie der FVC, wurden alle aufgenommen. Die Anteile der FEV25FEV50und FEV75 bis FVC wurden separat berechnet. FEV-25/FVC, FEV50/FVC und FEV75/FVC alle verringerte sich deutlich in Ozon ausgesetzt Mäuse. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt * P < 0,05, ** P < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Ozonbelastung verringert Müdigkeit Zeit- und Müdigkeit. (a) einzelne laufen mal für Luft - oder Ozon-exponierten Mäuse wurden aufgezeichnet. Ozon-exponierten Mäuse zeigten eine signifikante Abnahme der Müdigkeit Zeit. (b) individuelle Laufstrecken der beiden Gruppen wurden aufgezeichnet. Ozon ausgesetzt Mäuse zeigte eine signifikante Abnahme der Müdigkeit Abstand. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt * P < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Entzündungszellen gezählt von BALF. (a) individuelle und mittlere Zahl von insgesamt Zellen (gesamt) in Luft oder Ozon ausgesetzt Mäuse. (b) individuelle und mittlere Anzahl von Makrophagen (MAC) in den beiden Gruppen. (c) individuelle und mittlere Zahl der Neutrophilen (NEU) in den beiden Gruppen. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt * P < 0,05, ** P < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Entzündliche und Anti-inflammatory Cytokine Erkennung im Serum. (a) individuelle und mittlere Werte der Höhe der IL-10 bei Mäusen Luft oder Ozon ausgesetzt. (b) individuelle und mittleren Werte der Höhe der IL-1β in den beiden Gruppen. (c) individuelle und mittleren Werte der Höhe der TNF-α in den beiden Gruppen. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt * P < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode zur Erzeugung eines neuen COPD-Modells. Im Vergleich zu anderen Modellen (z.B. LPS oder PSA-Modelle), rekapituliert dieser OE-Modell des pathologischen Prozesses von COPD-Patienten. Da Zigarettenrauch das Hauptmaterial gefährlicher, das menschlichen Patienten40COPD verursacht ist, bleibt das CS-Modell der beliebtesten COPD Modell41,42. Das CS-Modell erfordert jedoch eine 3 - 12-Monats-R & D-Zeit für neue Medikamente. Im Vergleich zu den CS-Modell, reduziert die aktuelle OE-Modell die Generation Zeit auf 6-8 Wochen. Wir haben in unseren früheren Studien30,31,32Emphysem bei männlichen Mäusen nach 6 Wochen nach der Exposition gegenüber Ozon beobachtet. In dieser Studie wir das OE-Protokoll auf weibliche Mäuse für 7 Wochen angewendet und erfolgreich generiert ein weibliches OE-Modell. Da gemeldet wurde, dass COPD-Mortalität bei Männern zurückgegangen aber bei Frauen in einigen Ländern33 erhöht, ist es notwendig, die pathogenen Mechanismen zu studieren und Heilung Ansätze für weibliche COPD-Patienten mit einem weiblichen COPD-Modell zu entwickeln. Wir wissen, dass die oben genannten COPD-Modelle (d. h. LPS, PSA und CS) sowohl männliche als auch weibliche Tiere43arbeiten können. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein zusätzliches COPD-Modell vorzuschlagen, das sowohl des pathologischen Prozesses von COPD-Patienten rekapituliert und ein sehr kurzer Generation erfordert.
Der entscheidende Schritt zur Erzeugung von diesem Modell wurde die Mäuse zu Ozon (auf einem Niveau von 2,5 ppm) zwei Mal pro Woche (einmal alle 3 Tage) für 6-8 Wochen auszusetzen (in dieser Studie verwendeten wir 7 Wochen, obwohl wir nicht, Dosissteigerung versuchen). Durch die Kontrolle der kritischen Parameter der Belichtung Frequenz und Ozonkonzentration, reproduziert wir erfolgreich Emphysem in männlich C57BL/6 Mäusen31,32, Männlich BALB/c Mäuse30und weiblichen Mäusen BALB/c (die aktuelle -Studie). Der Emphysem-Phänotyp resultiert aus Ozonbelastung, mit dem Luftstrom Einschränkung und Lunge parenchymatösen Zerstörung ähnlich wie die Veränderungen in COPD Patienten44,45.
Noch gibt es Beschränkungen in Bezug auf diese Studie. Beispielsweise, weil die Pathogenese der menschlichen COPD auf die Anatomie der Lunge verbunden ist, sollte ein ideales COPD-Modell bei Tieren erzeugt werden, die eine pulmonale anatomische Struktur ähnlich dem des Menschen haben. Im Vergleich zu großen Tieren, besitzen kleine Tiere noch weniger umfangreiche Atemwege verzweigen als Mensch46. Wir müssen zugeben, dass es sinnvoller wäre, ein COPD-Modell in großen Tiere zu erzeugen. Allerdings ist es sehr schwierig, Großmodelle bei Tieren zu etablieren. Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist die klinische Relevanz. Obwohl es sicher ist, dass Ozon mit den Atemwegen reagieren und Lunge Gewebe19,22schädigen kann, und es gibt Beweise, die die Symptome der COPD-Patienten nach der Exposition gegenüber Ozon28verschlechtern, Ozon ist nicht die Hauptursache der COPD Patienten. Wir sind jedoch immer noch schlägt und mit Hilfe dieses OE-Modells, weil Ozon und CS Schäden der Atemwege durch Induktion Entzündung verursachen und zu oxidativem Stress26,27 führen. So eine neue Droge, die COPD in der OE-Modell kann dieses heilen kann auch in der CS-Modell arbeiten und daher potenziell für COPD-Patienten entwickelt werden.
Anwendungen des Modells OE beschränken sich nicht auf Entschlüsselung der molekularen und zellulären Mechanismen der COPD. Unsere zwei Publikationen untersuchte auch die Wirksamkeit von N-Acetylcystein (NAC)31 und NaHS32 (eine exogene Spender von H2S) bei der Behandlung von COPD über die exogene Verabreichung von zwei Medikamenten, die OE-Modell. In der ersten Studie fanden wir eine Umkehr der Atemwege hyper-Reaktionsfähigkeit und eine Reduktion der Atemwege Glattmuskel Masse nach der Verabreichung der NAK. Diese Effekte könnte darauf hindeuten, dass die Grundlage für potenzielle klinische Vorteile der NAK in COPD Patienten31. In der zweiten Studie des OE-Modells fanden wir, dass die Verwaltung der exogenen NaHS Lungenentzündung umgekehrt und die Funktionen des Emphysems teilweise rückgängig gemacht. So, mit diesem Modell OE wir nachgewiesen in einer Vorstudie, dass NaHS als potenzieller Kandidat für COPD Patienten32Medikament entwickelt werden könnte. Daher hat die OE-Modell Einsatzmöglichkeiten sowohl Mechanismus Forschung und Drogen-Screening für COPD.
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Disclosures
Z.W.S. und W.W sind aktuelle Mitarbeiter und Stock-Option-Inhaber der zellulären Biomedizin-Gruppe (NASDAQ: CBMG). Die anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Mr Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) bedanken, für die technische Hilfe bei der µCT-Bewertung in diesem Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Slac Laboratory Animal,Shanghai, China | N/A | 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study. |
| Individual ventilated cages | Suhang, Shanghai, China | Model Number: MU64S7 | The cages were used for housing mice in the animal facility. |
| Sealing perspex-box | Suhang, Shanghai, China | N/A | The box was used to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box. |
| Electric generator | Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany | Model 500 | The device was used for generating ozone. |
| Ozone probe | ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK | Ozone 300 | The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone. |
| Pelltobarbitalum natricum | Sigma, St. Louis, MO, USA | P3761 | Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum. |
| Micro-Computed Tomography | GE Healthcare, London, ON, Canada | RS0800639-0075 | This device was used for acquiring images of the lung. |
| Micro-view 2.01 ABA software | GE Healthcare, London, ON, Canada | Micro-view 2.01 | This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung. |
| Treadmill machine | Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China | DSPT-208 | This machine was usd for fatigue test. |
| Body plethysmograph | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Ventilator | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Slide spinner centrifuge | Denville Scientific, Holliston, MA, USA | C1183 | It was used to spin BALF cells onto slides. |
| Wright Staining | Hanhong, Shanghai, China | RE04000054 | It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF. |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, Horsham, PA, USA | 4000 | It was used to count cells. |
| IL-1β | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100704 | They were used to test the respective factors in serum. |
| IL-10 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab46103 | They were used to test the respective factors in serum. |
| TNF-α | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100747 | They were used to test the respective factors in serum. |
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO, USA | P6148 | The lung was inflated by 4% paraformaldehyde. |
| Paraffin | Hualing, Shanghai, China | 56# | It was used to embed the lung. |
| Rotary Microtome | Leica, Wetzlar, Hesse, Germany | RM2255 | It was used for sectioning the lung. |
| Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution | Solarbio, Beijing, China | G1120 | H&E staining was done for morphometric analysis. |
| Upright bright field microscope | Olympus, Center Valley, PA, USA | CX41 | It was used to image the H&E staining slides. |
| Adobe Photoshop 12 | Adobe, San Jose, CA, USA | Adobe Photoshop 12 | It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images. |
| GraphPad prism 5 | Graphpad Software Inc., San Diego, CA | GraphPad prism 5 | It was used for data analysis and production of figures. |
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