Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

Abstract

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מאופיין על ידי הגבלת זרימת האוויר מתמשך והרס parenchymal ריאות. יש שיעור גבוה מאוד של הזדקנות האוכלוסייה. טיפולים קונבנציונליים הנוכחי COPD דגש בעיקר על שינוי סימפטום סמים; לפיכך, ההתפתחות של טיפולים חדשים דרוש בדחיפות. מוסמך מודלים חייתיים של COPD יכול לעזור כדי לאפיין את המנגנונים המשמשת כבסיס, יכול לשמש עבור חדש והתרופות הקרנה. המודלים הנוכחיים של COPD, כגון ליפופוליסכריד (LPS) או elastase הלבלב חזירי (עיקרון השוויון הפוליטי)-מודל אמפיזמה המושרה, ליצור נגעים COPD, כמו ריאות, דרכי הנשימה אבל אחרת לא דומים בפתוגנזה של COPD אנושי. לעשן סיגריה (CS)-מודל המושרה נותר אחד הפופולריים ביותר כי זה לא רק מדמה COPD דמוי נגעים במערכת הנשימה, אבל זה גם מבוסס על אחד החומרים המסוכנים העיקרית הגורמת COPD בבני אדם. עם זאת, ההיבטים מהגידולים ועתירת של דגם CS-induced להגביל באופן דרמטי שלה יישום חדש והתרופות הקרנה. במחקר זה, בהצלחה יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת עכברים לרמות גבוהות של האוזון. מודל זה הפגין את הפעולות הבאות: 1) ירד קיבולת ויטל 25, 50, והכריח את 75/נפח expiratory בכפייה (FEV25/FVC, FEV50/FVC, FEV75/FVC), המציין את התדרדרות תפקוד הריאות; 2) alveoli ריאות מוגדלת, עם הרס parenchymal ריאות; 3) מופחת עייפות הזמן והמרחק; . ו-4) מוגבר דלקת. יחדיו, נתונים אלה מדגימים כי המודל חשיפה (OE) האוזון הוא מודל בעלי חיים אמין דומה לבני כי חשיפת יתר האוזון הוא אחד הגורמים etiological של COPD. בנוסף, לקח רק 6-8 שבועות, בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, כדי ליצור מודל OE, ואילו זה דורש 3-12 חודשים לזירוז המודל עשן סיגריות, המציין כי המודל OE עשוי להיות בחירה טובה עבור מחקר COPD.

Introduction

ההערכה היא כי COPD, כולל אמפיזמה וגם ברונכיטיס כרונית, עשוי להיות הגורם המוביל השלישי המוות בעולם 20201,2. שכיחות COPD פוטנציאליים בקרב אוכלוסיה מעל גיל 40 מוערך 12.7% אצל גברים ו- 8.3% אצל נקבות בתוך 40 שנה הבאה3. אין תרופות זמינים כעת להפוך את הידרדרות הדרגתית חולי COPD4. אמין מודלים חייתיים של COPD לא רק דורשים החיקוי של תהליך פתולוגי המחלה אך גם לדרוש תקופה קצרה הדור. המודלים הנוכחיים COPD, כולל את התקליטים או מודל הנוצרות על-ידי עיקרון השוויון הפוליטי, יכול לגרום תסמינים דמויי אמפיזמה5,6. ניהול יחידה או אתגר השבוע של LPS או עיקרון השוויון הפוליטי תוצאות עכברים או חולדות neutrophilia המסומן בנוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF), מגביר pro-מתווכים דלקתיים (למשל, TNF-α ו- IL-1β) BALF או סרום, מייצרת ריאות האיזורים אוויר מוגדל-הרס parenchymal, גבולות זרימת אוויר5,6,7,8,9,10. עם זאת, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי אינם גורמים אנושיים COPD, ובכך לא לחקות את תהליך פתולוגי11. דגם CS-induced המיוצר על הגבלת זרימת האוויר מתמשך, הרס parenchymal ריאות, מופחתת יכולת תפקודית פעילות גופנית. עם זאת, פרוטוקול CS מסורתי דורש לפחות 3 חודשים כדי להפיק COPD מודל12,13,14,15. לכן, חשוב לייצר מודל בעלי חיים חדשים, יעיל יותר העומד בדרישות שני.

לאחרונה, בנוסף עישון סיגריות, זיהום אוויר, חשיפה תעסוקתית הפכו הסיבות השכיחות יותר של COPD16,17,18. האוזון, כאחד המזהמים העיקריים (אם כי לא המרכיב העיקרי של זיהום אוויר), יכולים להגיב עם מערכת הנשימה באופן ישיר לנזק רקמת הריאה של ילדים והן צעירים מבוגרים19,20,21 ,22,23,24,25. אוזון, כמו גם תכשירים אחרים כולל LPS, עיקרון השוויון הפוליטי של הפקולטה למדעי המחשב, מעורב של משעולים הביוכימי של סטרס חמצוני ריאתי, נזק לדנ א הינם מקושרים על ייזום וקידום של COPD26,27. גורם נוסף הוא כי הסימפטומים של חלק מהחולים COPD להתדרדר אחרי נחשפים האוזון, המציין כי האוזון יכול לשבש את הריאה פונקציה18,28,29. לכן יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון 7 שבועות; כתוצאה מכך זרימת אוויר פגמים ונזק ריאות parenchymal דומים לאלה של חקירות קודמות30,31,32. עלינו להרחיב את פרוטוקול OE עכברים הנשי במחקר זה, בהצלחה לשכפל האמפיזמה נצפתה בעכברים זכרים ב שלנו הקודם מחקרים30,31,32. כי COPD התמותה ירדה בגברים אך גדל אצל נשים אצל מדינות רבות33, מודל COPD אצל נקבות יש צורך ללמוד את המנגנונים וכדי לפתח שיטות טיפוליות לחולים COPD הנשי. תחולת שמודל OE כל המינים משאיל תמיכה נוספת לשימוש שלה כמודל COPD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: מודל ה OE שנוצר, המשמשים למחקר שדווחה בעבר 30 , 31 , 32. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת שנחאי ג'יאוטונג של.

1. עכברים

  1. בית נטולת הפתוגן, 7 עד 9-בת נקבה BALB/c עכברים בכלובים מאוורר בודד בחיה מתקן תחת מבוקר טמפרטורה (20 ° C) ולחות (40-60%). מספקים אור 12 שעות ו 12 שעות מחזור כהה במתקן. לספק מזון ומים ad libitum.

2. האוזון או חשיפה אוויר

  1. צור האוזון עם גנרטור חשמלי בתוך קופסה איטום אקרילי (למשל פרספקס). לנשוף האויר מחוץ לקופסה באמצעות מפוח אוויר קטן דרך צינור אוורור אוויר המחובר מבפנים, מחוץ לקופסה. נטר את ריכוז האוזון בתיבה באמצעות בדיקה של האוזון. המתן עד ריכוז האוזון בתיבת מגיע ל- 2.5 חלקים למיליון (ppm).
    הערה: החללית האוזון יכולה להחליף באופן אוטומטי את מחולל האוזון או ביטול, באפשרותך לשמור על רמת האוזון בתיבה בחלק 2.5 ppm.
  2. למקם את העכברים לתוך התיבה בעת הרמה של האוזון מגיע ל- 2.5 ppm. לשמור את העכברים בתיבה עבור 3 שעות בכל פעם לחשוף אותם האוזון.
    הערה: תיבת יכול לשמר רמה האוזון של 2.5 ppm במהלך ה 3 על-ידי מיתוג אוטומטית את מחולל האוזון או ביטול ו CO 2 הזמבורה המיוצר על ידי העכברים מהקופסה.
  3. לתת אוזון שתי חשיפות (בכל חשיפה מתמשכת 3 h) בשבוע (פעם אחת כל 3 ימים) במשך 7 שבועות; לחשוף את העכברים הבקרה האווירית, באותו זמן, באותה התקופה.

3. מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת

  1. בסוף שבוע 7, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים כדי לראות העכבר אינו להגיב הבוהן קמצוץ. צג ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.
  2. מקום העכברים anesthetized בחדרו של טומוגרפיה שחושב מיקרו (µCT).
  3. לכייל את µCT באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי והיצרן ' s הוראות. הגדר את שפופרת רנטגן 50 kV והזרם ב 450 µA.
    הערה: שניהם הרנטגן והגלאי סובב סביב העכברים.
  4. לבצע את הניתוח µCT על-ידי השגת תחזיות 515 עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.092 מ מ, של זמן חשיפה של ms 300 בשביל פרוסה אחת, עובי הפרוסה של מ"מ 0.093.
  5. לשחזר את הריאה עם תמונות נרכשות באמצעות תוכנה. לכוונן את בהירות התמונה בגווני אפור על-ידי הגדרת את מינימום ומקסימום של גווני האפור ב-750 ו-550 נ. האונספילד יחידות, בהתאמה.
    הערה: התוכנה יחשב באופן אוטומטי את אמצעי האחסון של parenchyma הריאה, 35 אזור נמוך-הנחתה (LAA) 34 ,.
  6. לחשב את אחוז LAA (LAA %) על-ידי חלוקת האחסון LAA לפי נפח הריאות הכולל.

4. הבדיקה על ההליכון

  1. לתת העכברים הסתגלות לבדוק במהירות של 10 מ' לדקה 10 דקות ריצה הליכון המכונה הערה: החשמל הוא תמיד כבוי כאשר ההליך מתנהל.
  2. מנהל מבחן עייפות לעכברים.
    1. לחמם את העכברים במהירות של 10 מ' לדקה במשך 5 דק.
    2. להגדיל את המהירות עד 15 מ' לדקה במשך 10 דקות
    3. להגדיל את עצימות: הגדלת המהירות על ידי 5 מטר/דקה, החל מ- 20 מ'/דקה, כל 30 דקות עד עכברים אין אפשרות להמשיך לפעול 36.
  3. להקליט את הסיכום רץ מרחק ויפעילו את הזמן כמו עייפות מרחק וזמן עייפות, בהתאמה.

5. מדידות תפקוד ריאתי

  1. עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר עושה לא להגיב קמצוץ הבוהן ולחכות עד העכברים נשימה ספונטנית. צג שמרו ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.
  2. בעיון tracheostomize העכברים ומניחים היא תגלה הגוף שאליו מחובר חמה מבוקר-מחשב-
    הערה: אוורור נשלטת דרך שסתום הממוקם הציר הקרוב הצינור אנדוטרכאליות. הגדרת מספק תמרונים חצי אוטומטי שונים, כולל את התמרון של אמצעי האחסון לחץ סטטי ומעין ולתמרן את נפח זרימה מהירה.
  3. לכפות ממוצע נושם התדירות של 150 נשימות לדקה העכבר anesthetized באמצעות אוורור מבוקר ללחץ עד דפוס נשימה רגיל והשיג תפוגה מלאה על כל מחזור הנשימה.
  4. לבצע את התמרון לחץ סטטי ומעין-נפח עם המכשיר באמצעות הלחץ השלילי שנוצר היא תגלה.
  5. לבצע את התמרון נפח זרימה מהירה בתוך לולאות לחץ סטטי ומעין-נפח להקליט את FVC ואני את FEV. לנפח הריאה +30 ס"מ H 2 O ומיד לאחר מכן לחבר אותו כדי לחץ שלילי מאוד כדי לאכוף תפוגה עד שאמצעי האחסון שיורית ב-30 ס מ H 2 O. שיא FEV הראשון 25, 50, ו ms 75 של נשיפה (FEV 25 FEV 50, FEV 75, בהתאמה). דוחים את התמרונים שיוצרת. עבור כל בדיקה עם כל עכבר אחת, לנהל מינימום של שלושה מקובל תמרונים כדי לקבל ממוצע אמין עבור כל הפרמטרים מספריים.

6. אוסף BALF

  1. בעקבות הרדמה מסוף עם pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 גרם/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר לא מגיב קמצוץ הבוהן, לאבד את הנשימה), שטיפה עכברים עם 2 מ של PBS דרך 1 מ מ קוטר צינור אנדוטרכאליות ו מכן לאחזר BALF 10-
  2. מאגר של aliquots שטיפה שאוחזרו ו centrifuge אותם ב 4 ° C ו- g x 250 במשך 10 דקות
  3. לאסוף את תגובת שיקוע לשימוש מיידי ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.
  4. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer.
  5. Resuspend בגדר תא PBS, ואז ספין (1,400 x g, 6 דקות) µL 250 תאים resuspended על השקופיות בעזרת צנטריפוגה טווה שקופיות.
  6. רייט להחיל מכתימה את התאים של השקופיות לפי היצרן ' פרוטוקול s.
  7. לספור תאים 200 לכל עכבר; לזהות את התאים המקרופאגים או נויטרופילים, על פי המורפולוגיה סטנדרטי, תחת הגדלה X 400; ולספור את המספרים שלהם.

7. דגימה דם לב

  1. לאסוף דם באמצעות דקירה בלב, לטעון אותו לתוך צינורות 1.5-mL, ולשמור את זה על קרח במשך 30 דקות
  2. Centrifuge את דגימות הדם למשך 5 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
  3. להעביר את תגובת שיקוע (סרום) צינור ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.
  4. להכין את הנסיוב IL-1β, IL-10, ו- TNF-α בדיקות זיהוי באמצעות ערכות אליסה בהתאמה.

8. ניתוח ריאות Morphometric

  1. לנתח את הריאות ואת tracheas של העכברים.
    1. למקם כל עכבר לאללה על גבי לוח כירורגית מיד לאחר ההקרבה.
    2. לנתח משם platysma את שרירי הנשימה הקדמי כדי להמחיש ולגשת הטבעות והכו אותי.
    3. פתח את החזי חלל. לנתח את הריאות, קנה הנשימה, אך אל תפריד את הלב מהריאות.
  2. להתחבר הקטטר אנדוטרכאליות המזרק המכיל 4% paraformaldehyde דרך צינור פוליאתילן PE90.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים ולהשתמש הפתרון בתוך ברדס fume.
  3. מנפח הריאות לחלוטין באמצעות paraformaldehyde 4% (10 טיפות, µL ~ 200) דרך הקטטר אנדוטרכאליות. להסיר את הלב לאחר השלמתו של האינפלציה.
  4. שמור על הריאה בשפופרת 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde לפחות 4 h
  5. להטביע את הריאה פרפין. לקבל סעיפים 5-מיקרומטר על-ידי בלוק פראפין חלוקתה עם מיקרוטום רוטרי. במהלך חלוקתה, לחשוף את פני השטח המרבי של רקמת הריאה בתוך אזור עץ הסמפונות.
  6. ניתוח morphometric, לבצע hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת במקטעי.
  7. תמונה הסעיפים עם מיקרוסקופ זקוף בהיר-שדה (המטרה עדשה, 20 X; זמן החשיפה, 1.667 ms).
  8. שני חוקרים עיוור בפרוטוקול טיפול באופן עצמאי לספור הסעיפים היסטולוגית. השתמש בנקודת החיתוך ליניארי רשע (L m) כפרמטר למדידת המרחק של הקיר במחיצה הבין-מכתשי. לקבוע את L m באמצעות השלבים הבאים:
    1. לפתוח את התמונות של הסעיפים ב- Photoshop וצייר החריט-רשת על התמונה עם תורים ארוכים 550 5 מיקרומטר.
    2. לספור את מספר alveoli מעבר לקו רשת.
    3. לחשב את ה L m על-ידי חלוקת אורך הקו ברשת על ידי מספר alveoli. על כימות, תמונה לחמישה מדורים לכל העכבר. לרכוש עשר תמונות של כל אחד מהמקטעים (תמונה אחת לכל שדה), להעריך באופן אקראי. בעת בחירת שדה, להימנע שדות של דרכי הנשימה וכלי על-ידי הזזת שדה אחד קדימה או לכיוון אחר.
      הערה: הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. מבחן-t בלתי מזווג בוצע לשם השוואה בין עכברים החשופים אוויר ועכברים החשופים האוזון. שלוש חיות של כל קבוצה שימשו כדי לחשב את ההבדל המשמעותי. ערך-p של < 0.05 נחשב משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמאות של תמונות תלת-ממד µCT של כל קבוצה מוצגים באיור 1. העכברים החשופים האוזון היה נפח הריאות הכולל גדול יותר באופן משמעותי (איור 1ו- b) LAA % (איור 1c) מאשר העכברים בקרת אוויר החשופים. נפח הריאות ואת LAA % נשארו גבוהות לאחר שישה שבועות של אוזון חשיפה31,32. נפח הריאות מוגברת LAA % מייצגים את פנוטיפ אמפיזמה. דוגמאות התרחבות מכתשי ריאות ב איור 2 ממחישים את היווצרות אמפיזמה. עלייה החיתוך ליניארי רשע (Lm) נצפתה בעכברים החשופים אוזון (איור 2b), אשר אישר כי הרס parenchymal ריאות התרחשה לאחר חשיפה האוזון.

תפקודי ריאה נמדדה על ידי הפרמטרים קצב זרימת אוויר, כמוצג FEV25/FVC, FEV50/FVC, FEV75/FVC. התוצאות הראו כי כל הפרמטרים ירד בעכברים החשופים אוזון (איור 3-c) הם עקביים עם הליקויים תפקודי ריאה טיפוסית ב- COPD מטופלים4,37. להעריך עוד יותר את הדגם OE, אנחנו ביצעה תרגיל סובלנות מבחן זה מוחלף עבור 6 דקות הליכה מבחן (6MWT)38,39, המשמש בדרך כלל להעריך שינויים במעמד תרגיל פונקציונלי בחולי COPD. החשיפה האוזון ירד באופן משמעותי את המרחק הזמן ועייפות של עייפות (איור 4ו- b).

כדי לטפל בפתוגנזה של COPD במודל OE, מקרופאגים של נויטרופילים נספרו מ BALFs של העכברים; ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β ו- TNF-α) ו ציטוקינים אנטי דלקתי (IL-10) אותרו סרה העכבר. העכברים החשופים האוזון הראו עלייה משמעותית תאים דלקתיים, לרבות מקרופאגים, נויטרופילים (איור 5-c), כמו גם ירידה משמעותית IL-10 ועלייה IL-1β ו- TNF-α (איור 6-c ). כל הנתונים הפגינו OE דגם recapitulated האנושי COPD תסמינים דמויי.

Figure 1
איור 1. האוזון חשיפה מוגברת של נפח הריאות ו- % LAA שזיהה µCT. (א) להחליפן בתמונות תלת-ממדית מציג את הריאות של עכברים אוויר או אוזון-חשופים בגיל שבעה שבועות לאחר חשיפת בהתאמה. (ב) כרכים בודדים הריאות הכולל שתי הקבוצות חולצו מן התמונות 3D לסטטיסטיקה. חשוף האוזון עכברים הראו עלייה משמעותית של נפח הריאות הכולל. (ג) בודדים וחסרי % LAA של שתי הקבוצות. חשוף האוזון עכברים הראו עלייה משמעותית LAA %. צבע אדום מציין LAA (voxels עם צפיפות של 2,550-2,700 נ. האונספילד יחידות). קנה הנשימה של הסמפונות מוצגים בצבע אדום באיור זה הוסרו כדי לחשב את הריאה LAA. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * * P < 0.01, * * * P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. האוזון חשיפה מוגברת של Lm. (א) micrographs נציג של חללים מכתשי ריאות בסעיפים שהוכתמו הוא של עכברים החשופים אוויר או חשוף האוזון. (ב) ערכים בודדים של Lm היו לכמת מן הסעיפים ריאות של שתי הקבוצות לסטטיסטיקה. עלייה Lm נצפתה בעכברים החשופים האוזון. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . חשיפה האוזון ירד תפקוד ריאתי. (-ג) חשוף את האוויר וגם העכברים החשופים האוזון, FEV בודדים 25 הראשון, 50, ו- ms 75 של מהר תפוגה (FEV25, FEV50ו- FEV75, בהתאמה), כמו גם FVC, נרשמו כל. האחוזים של FEV25, FEV50FEV75 ל FVC חושבו בנפרד. FEV25/FVC, FEV50/FVC ועכברים FEV75/FVC כל ירד באופן משמעותי בתוך החשופים האוזון. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * P < 0.05, * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . חשיפה האוזון ירד עייפות הזמן והמרחק עייפות. (א) ריצה בודדים פעמים עבור אוויר או אוזון-חשופים עכברים נרשמו. חשוף האוזון עכברים הראו ירידה משמעותית בזמן עייפות. (ב) בודדים רץ מרחקים שתי הקבוצות נרשמו. עכברים החשופים האוזון הציגה ירידה משמעותית בעייפות מרחק. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . דלקתיות התאים הנספרים BALF. (א) בודדים וחסרי מספר של תאים הכולל (סה) בעכברים אוויר או אוזון-חשופים. (ב) בודדים וחסרי מספרים של מקרופאגים (MAC) בין שתי הקבוצות. (ג) בודדים וחסרי מספרים של נויטרופילים (NEU) בין שתי הקבוצות. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * P < 0.05, * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

עמוד ithin = "1" >Figure 6
איור 6 . זיהוי ציטוקינים דלקתיים ואנטי דלקתיות בנסיוב. (א) בודדים וחסרי ערכים של כמות IL-10 בעכברים אוויר או אוזון-חשופים. (ב) בודדים וחסרי ערכים של כמות IL-1β בין שתי הקבוצות. (ג) בודדים וחסרי ערכים של כמות TNF-α בין שתי הקבוצות. הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה ליצירת מודל חדש של COPD. מודל זה OE לעומת דגמים אחרים (קרי, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי מודלים), recapitulates את תהליך פתולוגי של מטופלי COPD. כי עישון סיגריות הוא החומר מסוכנים העיקרית שגורמת COPD בחולים אנושיים40, דגם CS נשאר הפופולרי ביותר COPD דגם41,42. עם זאת, דגם CS דורש a R 3 - 12 חודש & D תקופה עבור תרופות חדשות. לעומת דגם CS, המודל הנוכחי OE מצמצם תקופה דור 6-8 שבועות. הבחנו אמפיזמה בעכברים זכרים לאחר 6 שבועות של חשיפה האוזון ב שלנו הקודם מחקרים30,31,32. במחקר זה, אנו שהוחל פרוטוקול OE עכברים נקבה 7 שבועות, בהצלחה שנוצר מודל נשי OE. . כי זה כבר דווח כי התמותה COPD יש ירידה בגברים אבל גדל אצל נשים אצל כמה מדינות33, יש צורך ללמוד את המנגנונים פתוגניים וכדי לפתח גישות תרופה לחולי COPD נקבה באמצעות מודל נשי COPD. אנו יודעים כי הדגמים COPD הנ ל (קרי, תקליטונים, עיקרון השוויון הפוליטי ו CS) יכולים לעבוד בשני חיות זכר ונקבה43. מטרת עבודה זו היתה להציע מודל COPD נוספות הן recapitulates את תהליך פתולוגי של מטופלי COPD ודורש דור-תקופה קצרה מאוד.

הצעד מפתח ליצירת מודל זה היה חשיפת העכברים אוזון (ברמה של 2.5 ppm) שתי פעמים בשבוע (פעם אחת כל 3 ימים) במשך 6-8 שבועות (במחקר זה, השתמשנו 7 שבועות, למרות שאנחנו לא ניסית. המינון). על ידי שליטה על פרמטרים קריטיים תדירות החשיפה וריכוז האוזון, אנחנו בהצלחה לשכפל אמפיזמה באיחוד זכר C57BL/6 עכברים31,32, BALB/ג זכר עכברים30ועכברים הנשי BALB/c (הזרם לימוד). פנוטיפ אמפיזמה נבעה חשיפה אוזון, עם הגבלת זרימת האוויר ואת ריאות parenchymal הרס דומה לשינויים ראיתי ב- COPD חולים44,45.

עדיין יש מגבלות על מחקר זה. לדוגמה, כי בפתוגנזה של COPD האנושית קשורה האנטומיה של הריאות, מודל אידיאלי COPD צריך להיווצר בבעלי חיים בעלות מבנה אנטומי ריאתי דומה לזו של בני אדם. חיות קטנות לעומת חיות גדולות, בעלי דרכי הנשימה אפילו פחות נרחב מ בני46הסתעפות. אנחנו חייבים להודות שזה יהיה משמעותי יותר לייצר מודל COPD חיות גדולות. עם זאת, קשה מאוד ליצור מודלים בקנה מידה גדול אצל בעלי חיים. מגבלה נוספת של מודל זה הוא הרלוונטיות הקלינית שלה. אמנם אין ספק כי האוזון יכולה להגיב עם מערכת הנשימה ונזק ריאות רקמות19,22, ולמרות יש עדויות לכך הסימפטומים של חלק מהחולים COPD להתדרדר לאחר חשיפה האוזון28, האוזון הוא לא הגורם העיקרי של COPD בחולי. עם זאת, אנו עדיין מציע, באמצעות מודל זה OE כי האוזון והן CS לגרום נזק למערכת הנשימה על ידי וגורם לדלקת ולהוביל סטרס חמצוני26,27. לפיכך, תרופה חדשה שיכול לרפא COPD בשירותים OE דגם assumably לעבוד גם במודל CS, ולכן פוטנציאל להתפתח לכל מטופלי COPD.

יישומים של המודל OE אינם מוגבלים פיענוח המנגנון המולקולרי וסלולריות של COPD. שלנו בשני העיתונים האחרונות חקר גם את היעילות של N-אסטילסיסטיין (NAC)31 : NaHS32 (תורם אקסוגני של H2S) בשעה בטיפול COPD באמצעות הממשל אקסוגני של התרופות שני למודל OE. במחקר הראשון, מצאנו היפוך של דרכי הנשימה hyper-תגובתיות וירידה של מסת שריר חלק דרכי הנשימה לאחר הממשל של NAC. תופעות אלה עשוי להצביע על בסיס היתרונות הפוטנציאליים קליני של NAC ב- COPD חולים31. במחקר השני של המודל OE, מצאנו כי הממשל של NaHS אקסוגני הפוך דלקת ריאות וביטל חלקית את התכונות של אמפיזמה. לפיכך, עם מודל זה OE, אנחנו הפגינו מחקר ראשוני כי NaHS יכול להיות מפותח מועמד פוטנציאלי סמים עבור חולי COPD32. לפיכך, המודל OE יש יישומים אפשריים למחקר מנגנון הן והתרופות הקרנה עבור COPD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. וו. וו הם העובדים הנוכחי ומחזיקים אופציות של קבוצת וההתערבות הסלולר (סימול: CBMG). המחברים אחרים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים ברצוננו להביע תודה מר אדם מאוד צ'ין (שנגחאי בריאות הציבור קלינית במרכז) לסיוע טכני עם ההערכה µCT ב פרוטוקול זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

Tags

רפואה גיליון 126 מחלת ריאות חסימתית כרונית דלקת סימפונות כרונית נפחת הגבלת זרימת האוויר הרס parenchymal ריאות האוזון חשיפה
דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter