Первичного человека трофобласта модель для изучения эффекта воспаления, связанные с материнской ожирения по регулированию Autophagy в плаценту
Summary
Представленные здесь — это протокол для отбора проб тканей человека плацентарной ворсинок, следуют изоляции cytotrophoblasts для начальных клеточной культуры. Лечение трофобласты с TNFα резюмирует воспаления в ожирением внутриутробной среды и облегчает открытие молекулярных целей регулируется воспаление плаценты с материнской ожирения.
Abstract
Материнская тучность ассоциируется с повышенным риском неблагоприятных перинатальных исходов, которые скорее всего опосредовано скомпрометированных плацентарной функция, которая может объясняться, в части, регуляции autophagy. Аномальные изменения в выражении autophagy регуляторов в плаценты с ожирением беременности может регулироваться воспалительные процессы, связанные с ожирением и беременности. Описанные здесь — это протокол для выборки ворсинчатых ткани и изоляции ворсинчатых cytotrophoblasts из плаценты человека термин культуры главной ячейки. Это сопровождается метод для моделирования воспалительных окружение в ожирением внутриутробной среды, рассматривая первичной трофобласты от худой беременностей с провоспалительных цитокинов, который возводится в ожирение и фактора некроза опухоли альфа (TNFα), беременности. Посредством осуществления протокола, описанные здесь, установлено, что воздействие экзогенных TNFα регулирует выражение Рубикон, негативный регулятор autophagy, в от худой беременностей с женский плод трофобласты. Хотя целый ряд биологических факторов в ожирением внутриутробной среды поддерживать потенциал, чтобы модулировать критических путей в трофобласты, эта система ex vivo является особенно полезным для определения, если выражение моделей наблюдаемого в естественных условиях в человеческой плаценты с материнской ожирения являются прямым результатом TNFα сигнализации. В конечном счете такой подход дает возможность разобрать регулирования и молекулярных последствия воспаления, связанные с материнской ожирения на autophagy и других важнейших клеточных путей в трофобласты, которые имеют потенциал для воздействия плацентарный функции.
Introduction
Ожирение является воспалительных состояние, характеризующееся хроническим низкосортных воспаления, вытекающие из избыток жировой ткани и наличия питательных веществ. В ожирение провоспалительных цитокинов повышенный уровень метаболизма тканей, а также системно в обращении. Надежные совокупность доказательств показал, что TNFα значительно повышается в параметре ожирения с последствиями в сопротивление инсулина и метаболический дисфункции1. Активация TNFα также способствует патогенеза заболеваний в условиях, таких как рак и аутоиммунные заболевания, что делает его привлекательным терапевтического цели2.
Воспаление в ожирении усугубляется вследствие беременности, также провоспалительных государства3,4. Ранее было показано, что содержание плацентарного TNFα увеличивается с материнской ожирения в беременности с женского плода. Кроме того TNFα лечения препятствует митохондриальное дыхание клеток трофобласта женщин, но не мужчин, предполагая, что TNFα участвует в регулировании плацентарной метаболизм в сексуально диморфных образом5. Материнская тучность ассоциируется с увеличением числа различных осложнений во время беременности, включая мертворождение, с мужской плодов, будучи наиболее восприимчивы3,6,7,8 . Из-за его ключевую роль в интерфейсе матери и плода изменения функциональных возможностей через плаценту в ожирением внутриутробной среды в ответ на воспалительные сигнализации могут играть важную роль в посредничестве итоги ожирением беременностей.
Cytotrophoblasts и syncytiotrophoblasts в ворсинчатых ткани плаценты являются критическими для эндокринных сигнализации и питательных веществ и кислорода обмен между матерью и развивающегося плода9. Сбои в функциональные возможности ворсинчатых cytotrophoblasts (в дальнейшем именуемый трофобласты) может поставить под угрозу здоровье плода и развития. Этот протокол описывает метод для выборки ворсинчатых ткани из плаценты человека срок путем рассечения прочь хорионический и базальных плит наряду с оптимизированной процедуры для изоляции трофобласты культуры главной ячейки. Этот протокол является производным от установленным методологиям, с участием ферментативного пищеварения ворсинчатых ткани выпустить клетки из внеклеточного матрикса, следуют плотность дифференциального центрифугирования изолировать трофобласты10, 11,12. Этот подход, в котором первичный трофобласты от плаценты от худой беременности относятся с культура СМИ дополнена TNFα для имитации один компонент воспалительных окружение, связанных с материнской ожирения детали протокола. Наконец описан простой процедуры для уборки всего lysates клетки от TNFα-лечение трофобласты следуют западной blotting обнаружить изменения в экспрессии генов.
Хотя эта модель не пилки obesogenic в утробе матери окружающей среды во всей ее полноте, она обеспечивает управляемая система, которая позволяет разобрать индивидуального вклада TNFα-опосредованной воспаления в ответ трофобласты Материнская тучность. Эта модель дает возможность обнаружить или подтвердить молекулярных целей, непосредственно регулируются TNFα сигнализации в трофобласты, а также позволяет проверить, если изменения в картин выражения гена наблюдается в естественных условиях в плаценты с материнской ожирение может быть результатом TNFα-опосредованной воспаления.
Чтобы проверить эффект TNFα-опосредованной воспаления на регулирование autophagy в человека трофобласты был реализован подход, описанный здесь. Трофобласты с ожирением беременностей с мужской плодов выставку нарушается autophagic оборот или autophagosome созревания13. Белок, называемый Рубикон (запуск домена Beclin1-взаимодействующих и хвоща богатые белковые), который локализован для лизосомы и поздно endosomes, был недавно описан как «тормоз» в процессе autophagic оборот потому, что он функционирует как отрицательный Регулятор autophagosome созревания14,15. В самом деле Рубикон является редким примером белок, который сдерживает autophagy, что делает его ценным терапевтических цели. Очень мало информации имеется о патофизиологические значение Рубикон, за исключением его роли в врожденный иммунный ответ на микробы16,17 и cardiomyocyte защиты18. Используя протокол, описанный здесь, он найден что Рубикон upregulated в женской первичной трофобласты в ответ на лечение с увеличением концентрации TNFα до 250 пг/мл. Регулирование Рубикон могут играть роль в как женский плод тариф лучше, чем мужчины в беременности с материнской ожирения. Изложив воспаления, связанные с материнской ожирения ex vivo , подвергая человека трофобласты экзогенных TNFα обеспечивает платформу для изучения последствий страдают ожирением внутриутробной среды на регулирование критических путей в трофобласты и, следовательно, функция плаценты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Плацента, ответственным за регулирование роста плода, экспонаты нарушенной функцией в ожирением среды6. Несмотря на высокие метаболические требования трофобласты плаценты с материнской ожирения экспонат неблагополучных митохондриальное дыхание6,<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят женщин, кто пожертвовал их плаценты для этого исследования. Мы также благодарим труда и отдел доставки на OHSU и матери и плода исследовательская группа для координации сбора плаценты. Мы благодарны Эрик ван, к.т.н., и Келли Куо, MD за поддержку и помощь с экспериментальными методами и оптимизации.
Эта работа финансировалась по НИЗ HD076259A (AM) и Ана GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
