Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56583
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

Dette er en tid - og kostnadseffektive i vitro protokoll undersøker mekanismene av ervervet motstand mot målrettet terapeutisk agenter, som er svært udekkede medisinske behov i kreft behandling.

Abstract

De siste to tiårene har sett et skifte fra cytotoksiske medikamenter til målrettet terapi i medisinsk onkologi. Selv om målrettet terapeutisk agenter har vist mer imponerende klinisk effekt og minimert bivirkninger enn tradisjonelle behandlinger, har resistens blitt den viktigste begrensningen til sine fordeler. Flere prekliniske/i vitro/i vivo modeller av ervervet motstand mot målrettet agenter i klinisk praksis har blitt utviklet hovedsakelig ved hjelp av to strategier: i) genetisk manipulasjon for modellering genotyper ervervet motstand og ii) i vitro / i vivo utvalg av motstandsdyktig modeller. Den nåværende arbeidet foreslår vi en samlende ramme, for å undersøke de underliggende mekanismene ansvarlig for ervervet motstand mot målrettet terapeutisk agenter, fra generering av stoff-resistent mobilnettet subclones til beskrivelsen av stanse fremgangsmåtene som brukes for å gjenopprette følsomheten til inhibitor. Denne enkle tid - og kostnadseffektive tilnærming er allment tilgjengelig, og kan lett utvides for å undersøke resistens til andre målrettet terapeutisk narkotika i forskjellige svulst histotypes.

Introduction

Oppfølging på de avgjørende funnene i molekylær og cellulær biologi, er en rekke romanen syntetisert anticancer molekyler utviklet målrettingsland selektivt kreftfremkallende signalveier i et bredt spekter av svulst. Spesielt to kategorier av målrettet terapeutisk agenter med unike egenskaper i onkologi, nemlig syntetiske kjemiske forbindelser og rekombinant monoklonale antistoffer, er kjent for å ha oppnådd klinisk suksesser og dramatisk endret kreft omsorg i de siste tiårene1,2,3.

Likevel, til tross for deres imponerende første respons på behandling, fleste pasienter har utviklet resistens alle målrettet terapeutisk agenter, både monoklonale antistoffer og kinase hemmere. Som en konsekvens, er resistens, store hinderet for klassisk kreft medisiner4, fortsatt en stor utfordring for nye målrettet terapi5,6.

Motstand mot målrettet terapi kan være iboende (dvs.primære) eller ervervet (dvs., sekundær). Indre motstand beskriver de novo manglende respons til terapi, mens sekundær resistens forekommer etter en periode med svar på stoffet behandling7. Sistnevnte er forårsaket av utbrudd av små kohorter av kreftceller i hoveddelen av primitive svulst eller ligger i distale kryptiske anatomiske nisjer, viser opptil 90% mot én eller flere målrettet terapeutisk agenter. Molekylær mekanismene bak en motstand utvikling til målrettet terapi hovedsakelig skyldes målet genet mutasjoner og redundante aktivering av andre Pro overlevelse signalveier, med forståelse er fortsatt langt fra komplett8.

I dette arbeidet foreslått vi en tid - og kostnadseffektive tilnærming for å undersøke i vitro mekanismene av ervervet motstand mot målrettet terapeutisk agenter, fra generering av stoff-resistent mobilnettet subclones til beskrivelsen av demping prosedyrer brukes for å gjenopprette følsomheten til inhibitor, et avgjørende verktøy for testing og validere arbeider hypoteser. Spesielt ble vår tilnærming brukt til å undersøke, i magekreft, resistens til trastuzumab (f.eksHerceptin), et humanized monoklonalt antistoff målretting den ekstracellulære domenet av HER2 protein9. Trastuzumab + kjemoterapi er allment akseptert som standard første linje behandling for HER2-positiv metastatisk brystkreft. Takket være prekliniske studier viser at anti-HER2 terapi har betydelig aktivitet i både i vitro og i vivo HER2-positiv magekreft modeller10,11, molekylær narkotika målretting HER2 har vært grundig undersøkt i kliniske forsøk, er hvorav noen fortsatt pågående, på pasienter med gastroøsofageal kreft12,13,14,15.

Disse studiene har understreket det økende antallet pasienter opplever motstand mot trastuzumab16, tilsvarende til hva er observert for andre målrettet terapeutisk hemmere. Spesielt responsen på trastuzumab var 47%, og median total overlevelse for pasienter på trastuzumab + kjemoterapi var bare 2,7 måneder lenger enn til pasienter på kjemoterapi alene17. Dette foreslo at mens primære trastuzumab motstand er utbredt, sekundær trastuzumab motstand er uunngåelig. Derfor finnes det presserende behovet for å avklare mekanismer forårsaker HER2-målrettet terapi motstand i magekreft, som er enda mer problematisk gitt den intra-tumoral genetisk mangfold i denne neoplasi18.

I tillegg har mekanismer for resistens mot trastuzumab i magekreft vist utfordrende å forklare, delvis på grunn av vanskelighetene med å få pålitelig prekliniske modeller representant for denne tilstanden. Oshima et al. rapporterte en i vivo utvalg metode for trastuzumab-resistente magekreft cellelinjer, som består av en gjentatt kultur for en liten residual peritoneal metastasering etter behandling med trastuzumab19. Men bidro behovet av et kabinett, bestemte dyr håndtering kompetanse og godkjenning av dyr etikk til å gjøre det - og kostnader-tidkrevende metode. Tilnærmingen vi beskrive i dette arbeidet er enkel og allment gjeldende, og kan lett utvides for å undersøke resistens til andre terapeutiske narkotika i forskjellige svulst histotypes20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Denne protokollen er spesielt justert for analyse av mekanismene bak ervervet motstand mot trastuzumab henne-positive magekreft cellen linjer. Alle laboratorium instrumenter nødvendig blir rapportert i Tabellen for materiale.

1. generasjon av målrettet terapi motstandsdyktig Subclones

Merk: Dette er den mest kritiske og vanskelig å standardisere trinn i protokollen skyldes at forskjellige linjer kan ha ulike følsomhet til den målrettede terapeutisk inhibitor uavhengig fra deres svulst histotype eller narkotika konsentrasjon brukt.

  1. Kultur NCI-N87 celle linje i RPMI medium supplert med fosterets kalv serum (10%) og glutamin (2 mM, 1%), som en monolayer på 37 ° C, og frø det på 25 cm2 kultur flasker.
  2. Legge til kultur medium i hver kolbe 10 µg/mL trastuzumab som startdosen. Utsett cellene til startdosen før de gjenopptar vokser.
    Merk: Startdosen av målrettet terapi hemmer skal 10-fold lavere enn plasma peak konsentrasjonen. Plasma peak konsentrasjon er høyeste narkotika konsentrasjon i pasientens blod vanligvis etter flere doser av standard terapi. Denne verdien kan hentes fra studier på farmakokinetikken.
  3. Overvåke cellevekst med metoden trypan blå utelukkelse; Når cellevekst er gjenopptatt (vanligvis etter en periode på to til tre uker), utsett cellene til en 10 ganger høyere dose konsentrasjon av trastuzumab.
  4. Utsett cellene til en gradvis økende dose trastuzumab (fra 100 µg/mL til 400 µg/mL) til celler fortsetter å vokse (etter ca 2 uker) til tross for tilstedeværelsen av en høy narkotika konsentrasjon (minst 2,5 - 4-fold høyere enn plasma toppen).
  5. Utføre en clonogenic analysen for å evaluere motstand mot målrettet terapi ved hver endring i konsentrasjonen av den mål terapi inhibitor i kultur medium, og definerer relativ motstand IC50 indeks (RR KI50) som følger.
    1. Frø 500 celler i 24 flere godt kultur plater.
      Merk: 5 brønner må være forberedt for hvert vilkår.
    2. Utsette celler for økende mål terapi hemmer (trastuzumab) konsentrasjoner fra 100 µg/mL til 400 µg/mL.
    3. Inkuber celler i en CO2 inkubator på 37 ° C i 15 dager.
    4. Etter inkubasjon fikse og flekken prøver som følger.
      1. Fjerne medium og skyll celler med 10 mL 1 x PBS. Fjern 1 x PBS og legge 2-3 mL fiksering løsning (eddiksyre acid: metanol, 1:7, (vol/vol)). Fjern fiksering løsningen og legge 0,5% crystal violet løsning. Inkuber ved romtemperatur for 2t
      2. Fjerne crystal violet løsningen nøye ved aspirating med en pipette og fordype plater i vann til skyll av crystal violet løsning rester. Air-Dry ved romtemperatur for opp til 2 dager.
    5. Telle kolonier av mer enn 50 celler med en invertert mikroskopet (4 X forstørrelse).
      Merk: To uavhengige observatører er nødvendig for dette.
    6. Beregne RR KI50 som forholdet mellom IC50 verdien av mål-terapi-resistant subclone celler og verdien av de opprinnelige/naiv cellene.

2. validering protokoll for kandidaten målrettet terapi motstand gen (R-gen)

Merk: Etter karakterisering av genuttrykk, signaturer knyttet ervervet motstanden mot målet terapi og noen kandidat genet som driver motstand vil bli etterforsket gjennom: a) RT PCR, og b) Western blot analyse.

  1. Sanntid RT PCR
    1. Ekstra totale RNA fra linjer ved hjelp av syre guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform blanding (se Tabell for materiale).
    2. Utføre omvendt transkripsjon (RT) reaksjoner med tilfeldig praktiske primere og sette den termiske cycler som følger: grunning ved 25 ° C i 5 min, RT på 46 ° C for 20 min, og RT inaktivering ved 95 ° C i 1 minutt.
    3. Bruk 400 ng av totalt for en 20 µL reaksjon. Forberede reaksjonsblandingen for eksempel slik: 7 µL RNase gratis H2O, 2 µL cDNA (10 ng/µL), 1 µL 20 x fluorescerende-merket mål-spesifikke sonde og 10 µL 2 x blanding som inneholder bufferen, dNTPs og DNA polymerase (se Tabell for materiale).
    4. Legge til 20 µL reaksjonsblandingen hver godt plate og kjøre følgende program: holde scenen ved 50 ° C i 2 minutter, til 95 ° C i 10 min (1 syklus); deretter 40 sykluser på 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 minutt.
  2. Western blot
    1. Gjenopprette celle suspensjoner legge 2 mL 0,05% trypsin/EDTA løsning og gir 2-3 minutter for trypsin å arbeide.
    2. Legg 2 volumer av middels inneholder 10% fosterets bovin serum å nøytralisere trypsin (f.eks2 mL av medium for hver 1 mL av trypsin) sentrifuge 1200 x g for 5 min. forkaste supernatant og vask celler med kaldt 1 x PBS.
    3. Sentrifuge 1200 x g i 5 min og kast nedbryting. Resuspend celle pellets med lyseringsbuffer og ruge på en rocker på 4 ° C i 30 min.
      1. Mengden lyseringsbuffer avhenger av antall celler (f.eks, 100 µL for 1 x 106 celler); Pass på å forberede frisk lyseringsbuffer hver gang. For 1 mL av lysis buffer forberedelse (la på is): bruke 975 µL M-PER pattedyr lysate buffer, 15 µL protease og fosfatase hemmere og 10 µL 100 µM PMSF hemmere.
    4. Gjenopprette supernatant protein celle lysate sentrifugering 13.000 x g på 4 ° C i 15 min.
    5. Bestemme protein konsentrasjonen ved hjelp av en BCA protein analysen.
    6. Legge til 4 x LaemmLi eksempel Buffer protein eksempler (minst 20-30 µg protein) og varme ved 100 ° C i 3 minutter.
    7. Bruk precast 4-20% gels og laste 20-30 µg LaemmLi protein løsning og 5-10 µL av protein standard per prøve.
    8. Fylle Western blot ringen med TRIS/GLICYNE /SDS 1 x buffer og kjøre gel på 110 V i 30-60 minutter (når tid stopper sjekk som fargestoff har nådd slutten av gel, ellers kjører for et par ekstra minutter)
    9. Electroblot overføre protein til en PVDF membran (se Tabell for materiale) ved hjelp av en semi-tørr system.
    10. Blokkere membranen av soaking i den aktuelle protein løsningen (melk/BSA 5%) på shaker ved romtemperatur 1t.
    11. Lage en 1:400 løsning med anti-IQGAP1 primære antistoff i en 5% melk løsning (se Tabell for materiale).
    12. Plass membranen i primære antistoff løsningen på en shaker i et kaldt rom over natten.
    13. Dagen forkaste antistoff løsningen og suge i T-SS 1 x løsning (1 x T-ss: 1 x Tris Saline Buffer lagt ved Tween20 0,1%) i en shaker i romtemperatur i 7 min.
    14. Forkaste T-SS 1 x løsning og erstatt. Gjenta 3 ganger.
    15. Lage en 1:10,000 sekundære mus-antistoff løsning ved å legge antistoff for standard Western blot gjenkjenning (se Tabell for materiale) og membranen på en shaker; La ved romtemperatur for 2T.
    16. Forkaste antistoff løsningen og suge i T-SS 1 x løsningen på en shaker i romtemperatur i 7 min.
    17. Forkaste T-SS 1 x løsning og erstatt. Gjenta 3 ganger.
    18. Suge membran i 5 min i en chemiluminescent løsning, og image membranen på en chemiluminescence imager.

3. gjenopprette mål-terapi Inhibitor følsomhet av kandidaten R-genet sammenleggbare

  1. Cellen forberedelse
    1. Forberede enkeltcelle suspensjon av trypsinization. Utføre hva på dagen at cellene er belagt.
      1. Vask NCI-N87 celler med PBS og ruge på 37 ° C med 0,05% trypsin/EDTA løsning for 5-10 min. legge 2 volum av RPMI medium som inneholder 10% fosterets bovin serum å nøytralisere trypsin (f.eks2 mL av medium for hver 1 mL av trypsin).
      2. Telle celler med en hemocytometer bruker trypan blå flekker. Frø 2.5 x 105 celler (60% samløpet) på en T25 cm2 kolbe for hvert vilkår.
        Merk: Riktig antall celler for såing bestemmes av cellen linjen dobling tid og varighet av eksperimentet. Målet er å oppnå målet genet sammenleggbare for hele varigheten av forsøket. Ni T25 cm2 flasker er ideelle for hva og clonogenic analysen (3 flasker for kontroller, 3 flasker for negative transfection kontroller, 3 flasker for genet mål hva).
  2. Omvendt transfection
    1. Forberede genet mål og negativ kontroll hva miks for hver T25 cm2 kolbe som følger.
      1. Fortynne 12.5 µL av hver genet målretting siRNA oligonucleotides eller negativ kontroll siRNA oligonucleotides i minimal viktig transfection medium (forhold 1:55, se Tabellen for materiale).
      2. Legge til en kationisk liposome transfection reagens (1:1 ratio med gene målretting siRNA oligonucleotides, se Tabellen for materiale). Inkuber ved romtemperatur for 20 min.
        Merk: Det totale volumet av transfection blandingen er 700 µL.
      3. Legge til 700 µL av transfection blandingen i hver T25 cm2 kolbe. Inkuber cellene på 37 ° C i 1-3 dager.
    2. Kontroller genet sammenleggbare av RT PCR og Western blot analyse. Dobbeltsjekk virkningen av den antatte R-genet knock-ned på følsomhet restaurering til målrettet terapeutisk agent gjennom kolonien formasjon eksperimenter (gjenta trinn 1.5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser rammen av den eksperimentelle prosedyren. Tre magekreft-cellelinjer uttrykker høy HER2 og følsom for trastuzumab (IC50 < plasma toppnivået av stoffet, figur 2A, venstre diagram) ble dyrket i kultur medium med målrettet terapeutisk agent. En dose 10-fold lavere enn topp plasma konsentrasjonen av trastuzumab (10 µg/mL) ble satt som startdosen, og gradvis økt til 400 µg/mL over en periode på 8-12 måneder. Etterpå fikk vi tre subclones preget av en stabil motstand fenotypen med IC50 verdier lavere enn topp Plasmanivåer av trastuzumab (figur 2A, høyre diagram). Spesielt nådde den mest motstandsdyktige subclone, HR NCI N87, RR KI50 verdien 28.57 (figur 2B). IQGAP1 synes å spille en avgjørende rolle i motstand fenotypen av HR NCI N87 sub linjen. Analyser av protein og gene uttrykk støttes denne hypotesen: IQGAP1 protein nivå i den motstandsdyktig mot subclone er ca 5-fold høyere enn i foreldrenes cellene. Tilsvarende er korrespondenten IQGAP1 genuttrykk 2.5-fold høyere i HR NCI N87 sub-linjen enn i NCI N87 linjen (figur 3A).

IQGAP1 gene stanse ble utført for å evaluere sin rolle i utviklingen av trastuzumab motstandsdyktig fenotypen. Protokollen for å slå IQGAP1 genuttrykk viste seg spesielt effektiv til å slå ned IQGAP1 proteininnhold på nesten alle celler dyrket i en T25 cm2 celle kultur kolbe (omtrent 2,5 x 105 celler) (figur 3A).

Videre bekreftet clonogenic analysen arbeidsgruppen hypotesen, viser at IQGAP1 gen stanse gjenoppretter trastuzumab følsomhet i HR NCI N87 celler, som dokumentert ved at IC50 verdi 7 µg/mL (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: rammeverk for i vitro analyse av mekanismene bak ervervet målrettet terapi motstand. Tre forskjellige trastuzumab-resistente subclones avledet fra tre forskjellige trastuzumab-sensitive kreftcelle linjer ble generert og preget for endringer i HER2-signalisering mekanismer av neste generasjons sekvensering, immunohistochemical, Western Blot og RT PCR teknikker. Alle subclones viste en forskjellig motstand mekanisme. Målrettet terapi følsomhet ble restaurert i en bestemt subclone når kandidat driveren genet motstand var forstummet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Fastsettelse av relativ motstand IC50 indeks (RR KI50) via clonogenic analysen i mage kreftcelle linjer. (A) vekst kurver for naiv (venstre diagram) og resistente (høyre grafen)-linjer genereres av kolonien danner eksperimenter. X-aksen representerer trastuzumab konsentrasjon. Feilfelt representerer standardavviket (SD). Standardavviket overskredet aldri 5%. (B) representant bilder av clonogenic analysen støtte generering av en NCI-N87-resistant subclone. Som vist ved den tidslinjen, nødvendig generering av HR trastuzumab NCI N87 celler 12 måneder kontinuerlig eksponering til målrettet agent. Dette tallet er tilpasset fra arbeidet til Arienti et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: gjenopprette trastuzumab følsomhet av IQGAP1 genet sammenleggbare. (A) IQGAP1 proteininnhold, av densitometric analyse vises i stolpediagrammet, i foreldrenes NCI N87 linje, og dens motstandsdyktig og forstummet-resistente subclone (venstre diagram). MRNA IQGAP1 uttrykk nivå ble også bekreftet i alle tre celle-linjene av RT PCR teknikk (høyre grafen). Dataene ble presentert som mener ± SD. (B) Clonogenic analysen viste ulike følsomheten av foreldrenes NCI N87 linje og dens motstandsdyktig og forstummet-resistente subclone til 100 µg/mL trastuzumab. Kolonien var regnet etter 14 dager av cellen frø. Thumbnail tallene viser representant kolonien kulturer. Dette tallet er tilpasset fra arbeidet til Arienti et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Trinn Protokollen T25 cm2
Frø celler 60% confluent Tilhenger celler 1.75 x 103
Fortynn siRNA oligonucleotides i Minimal viktig Transfection medium (forhold 1:55) siRNA 12.5 ΜL
Hva medium 687.5 ΜL
Legge til Lipofectamine transfection reagens Lipofectamine reagensen 12.5 ΜL
Inkuber Inkuber ved romtemperatur for 20 min
Legg blandingen til celler Inkuber celler ved 37 ° C i 1-3 d

Tabell 1: Anbefalt reagens beløp og volumer for kandidaten motstand genet knock-ned.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens personlig tilpasset og målrettet terapi har skapte voksende entusiasme, disse såkalte 'smarte' terapier står overfor de samme store hinderet som tradisjonelle kjemoterapi narkotika, dvs, rask og uforutsigbare oppkjøpet av resistens. For å forbedre resultatene av målrettet terapi, løses resistens problemene gjennom en bedre forståelse av mekanismer som forårsaker dem. Her presentert vi en allment tilgjengelig i vitro metodikk for å undersøke mekanismene av ervervet motstand mot målrettet terapi rusmidler i kreft cellen modeller.

Generering av målrettet terapi motstandsdyktig subclones er den mest kritiske og vanskelig å standardisere skritt i denne protokollen, på grunn av den iboende genetiske heterogenitet mellom cellelinjer brukes, og deres forskjellige grader av stoff følsomhet. For disse grunner, kan tiden det tar å få motstandsdyktig subclones variere. Kronisk eksponering for anticancer molekylær agenter vanligvis forårsaker en sterk tumor vekst hemming. Men etter en variabel kontinuerlig narkotika eksponering (8-12 måneder) gjenoppta celler vekst med en frekvens lik som ubehandlet kontroll celler.

I tillegg til tross for at genuttrykk data har blitt brukt til hypothesize gen-relaterte mål terapi motstand, et annet uttrykk nivå ikke alltid gjenspeile en uriktig protein funksjon eller korrelerer med motstand fenotypen. På grunn av kompleksiteten i forholdet mellom uttrykk for antatte multiresistent genet og motstand mot den målrettet terapien, er ytterligere molekylær undersøkelser nødvendig, for eksempel bioinformatikk analyse, inkludert gene/protein samhandling, biologisk prosess berikelse og molekylær modellering.

En annen kritisk punkt kunne spesifisitet og nøyaktigheten av siRNA oligonucleotide å redusere måluttrykk. En mulig løsning kan være bruk av verktøy for å velge funksjonelle siRNA og en blanding av siRNA for det samme mål genet.

Til slutt, en mindre begrensning gjelder metoden som brukes til å gjenopprette følsomheten til målrettet terapi hemmer på grunn av forbigående varigheten av hva. Maksimal sammenleggbare av målrette mRNA (> 85%) ble rapportert på dag 2 etter transfection og ble opprettholdt > 80% gjennom dager 5-7. Betydelig sammenleggbare, om enn i mindre grad, var fortsatt observert på dag 6. Derfor skal cytotoksisitet analysen for å bekrefte restaurering av narkotika følsomhet utføres innen om 5 dager fra gene stanse.

Våre protokollen er en tid - og kostnadseffektive metode for å undersøke i vitro ervervet motstand. Generering av motstandsdyktig subclones, kunne speilvending intra-svulst heterogenitet av kreftceller, hjelpe avsløre romanen mekanismene av ervervet motstand mot anticancer målrettet agenter. Spesielt er de mer egnet for høy gjennomstrømming genomisk eller proteomic visninger for å identifisere molekylær endringer i motstandsdyktig celler enn sine følsomme kolleger.

Denne prekliniske plattformen kan enkelt utvides for å undersøke de generelle resistens til målrettet terapeutisk agenter i forskjellige svulst histotypes, gir en standard prosedyre for å ytterligere narkotika mål å overvinne resistens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Dr. Veronica Zanoni for redigering manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

Tags

Kreft biologi problemet 130 In vitro modell clonogenic analysen målrettet terapi resistens ny overfølsomhet siRNA hva
Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni,… More

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter