Summary
Eine Prozedur wird vorgestellt, für die Umfaltung der dCACHE periplasmatischen Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni Chemorezeptor Tlp3 Einschlusskörperchen und die Reinigung zu Milligramm-Mengen des Proteins führen.
Abstract
Identifizierung von natürlichen Liganden der Chemorezeptoren und strukturelle Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Liganden Besonderheit kann durch die Produktion von Milligramm-Mengen rein, gefalteten Ligand verbindliche Domains erheblich erleichtert. Versuche heterologously periplasmatischen Ligand verbindliche Domänen der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli (E. Coli) oft zum Ausdruck bringen, führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit den periplasmatischen dCACHE Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni (C. Jejuni) Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. Der Ansatz beinhaltet Expression des Proteins des Interesses mit einem spaltbaren seiner6-Tag, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol von Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung von Harnstoff Entleerung und Reinigung durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Tag-Entfernung und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Die kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie wird verwendet, um die gefalteten Zustand des reinen Proteins zu bestätigen. Es hat sich gezeigt, dass dieses Protokoll in der Regel nützlich für die Produktion von Milligramm-Mengen dCACHE periplasmatischen Ligand verbindliche Domains von anderen bakteriellen Chemorezeptoren in eine lösliche und kristallisierbaren Form.
Introduction
Chemotaxis und Motilität haben gezeigt, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Campylobacter Jejuni spielen, durch die Förderung der bakteriellen Besiedelung und Invasion der Host1,2,3. Chemotaxis ermöglicht Bakterien ein optimales Umfeld für Wachstum, Richtung, wie durch chemische Signale geführt. Dieser Prozess beinhaltet die Anerkennung der intrazellulären und Umwelt chemische Signale durch eine Reihe von Proteinen bezeichnet Chemorezeptoren oder Wandler-ähnliche Proteine (Tlps). Die meisten Chemorezeptoren sind Membran eingebettet Proteine mit einer extracytoplasmic Liganden-bindende Domäne (LBD), eine transmembrane Domäne und einer zytoplasmatischen Signal Domäne, von denen die letztere mit der cytosolischen Signalisierungen Proteinen interagiert, die Übertragung des Signals die flagellar Motoren4,5,6,7.
Elf verschiedene Chemorezeptoren wurden in der C. Jejuni Genom4,8identifiziert. Bisher haben nur einige der diese Chemorezeptoren geprägt und Liganden Spezifität der Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712und Tlp1113 ist bekannt. Identifizierung von natürlichen Liganden der verbleibenden Chemorezeptoren in dieser Spezies und zahlreiche Chemorezeptoren in andere Bakterien kann erheblich erleichtert werden, durch die Produktion von gefalteten und hochreinen rekombinante Chemorezeptor Weihnachtskleidern14, 15 , 16. jedoch Versuche, heterologously periplasmatischen Weihnachtskleidern der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli oft ausdrücken führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen17,18,19 . Dennoch kann dieses Phänomen einfach Isolierung und Wiederherstellung des Proteins in der hand erleichtern. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit der periplasmatischen LBD von C. Jejuni Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. In diesem Beispiel wurde gewählt, weil Tlp3-LBD dCACHE Familie20 Fernerkundung Domains gehört, die reichlich in Zweikomponenten-Histidin-Kinasen und Chemorezeptoren in Prokaryoten20,21, gefunden werden 22 , 23.
Bei diesem Ansatz der Ausdruck Konstrukt, basierend auf einem pET151/D-TOPO-Vektor wurde entwickelt, um eine N-terminale seiner6integrieren-Tag, gefolgt von einem Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease Spaltstelle für nachfolgende Tag Entfernung19. Das Protokoll beschreibt Protein Überexpression in E. Coli, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol Einschlusskörperchen und Protein Umfaltung durch Harnstoff-Depletion. Anschluss an Umfaltung, die Probe wird durch Affinitätschromatographie mit optionales Tag Entfernung und Größe-Ausgrenzung Chromatographie gereinigt. Die gefaltete Zustand des gereinigten Proteins ist mit kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie bestätigt. Dies ist eine modifizierte Version der Methode, die bisher entwickelt wurde, um zu erholen und Reinigen der LBD eine unterschiedliche Chemorezeptor, Helicobacter Pylori TlpC19. Dieses Verfahren, die in Abbildung 1zusammengefasst ergibt 10-20 mg rein, untagged Tlp3-LBD pro 1 L der bakteriellen Kultur mit einer Protein-Reinheit von > 90 % als geschätzt durch SDS-PAGE.
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Protocol
1. Ausdruck seiner6-Tlp3-LBD in E. Coli
- 150 mL sterile Luria-Bertani (LB) Brühe enthält 50 µg mL-1 Ampicillin mit BL21-Codon-Plus (DE3) zu impfen - RIPL Zellen umgewandelt mit der pET151/D-TOPO-Vektor für Ausdruck seiner6- Tlp3-LBD (Aminosäurereste 42-291), und inkubieren sie bei 37 ° C in einem Shaker (Umlaufbahn Durchmesser, 25 mm) mit 200 u/min über Nacht.
- Bereiten Sie sechs 2 L Erlenmeyerkolben mit 800 mL sterile LB Brühe und 50 µg mL-1 Ampicillin. Jede Flasche mit 20 mL der gewonnenen Schritt 1.1 über Nacht Kultur zu impfen. Inkubieren sie bei 37 ° C mit kontinuierlichen Schütteln bei 200 u/min bis die Extinktion bei 600 nm erreicht 0,6.
- Nehmen Sie 1 mL aliquoten aus einem Fläschchen (uninduced Kontrollprobe), Pellet mit einem Benchtop-Zentrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) und verwerfen Sie den überstand. Speichern Sie die bakterielle Pellet bei-20 ° C für die spätere SDS-PAGE-Analyse.
- Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactoside (IPTG) zu jedem Kolben mit Kultur zu induzieren. Fahren Sie fort, die Fläschchen bei 37 ° C in einem Shaker bei 200 u/min für weitere 4 h Inkubation.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 15 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
Hinweis: an dieser Stelle kann die Prozedur angehalten werden, indem man die Zelle Pellet in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
(2) Isolation und Denaturierung der Inclusion Bodies
- Übertragen Sie die Zelle Pellets erwarb Schritt 1.5, ein 250-mL-Becherglas geben und 100 mL Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Ermöglichen die Zellen zu tauen komplett (wenn gefroren) und Aufschwemmen der Pellets. Halten Sie die Probe auf dem Eis, sofern nicht anders angegeben.
- Übergeben der resuspendierte Zellen durch einen Hochdruck-Homogenisator dreimal lyse der Zellen und komplette Abscheren der genomic DNA zu gewährleisten.
- Zentrifugieren der lysate bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie eine 1 mL Probe des Überstands (löslichen Fraktion) und bewahren sie bei-20 ° C für die spätere SDS-PAGE-Analyse. Verwerfen Sie den Rest des Überstands und das Pellet auf Eis.
Hinweis: Dieser Pellet wird in der Farbe weiß (leicht unterscheidbar von ungebrochener Zellen, die den Farbton des Brauns sind in Farbe) und enthält Einschlusskörperchen. - Aufschwemmen Einschlusskörperchen Pellet gründlich in 20 mL eiskaltes Puffer B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF), 1 % Triton x-100). Dies erleichtert die Aluminiumionen der Membran und Membranproteine. Vortex für 1-2 min Wiederfreisetzung unterstützen.
- Probe bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entsorgen.
- Aufschwemmen der Pellet gründlich in 20 mL eiskaltes Puffer B durch aufschütteln der Röhre für 1-2 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet in kleine Stücke gebrochen ist. Pipettieren Probe rauf und runter zu Pellet Wiederfreisetzung zu unterstützen.
Hinweis: Es ist wichtig, das Pellet Einschlusskörperchen frei von Verunreinigungen gründlich zu Aufschwemmen. - Wiederholen Sie Schritt 2.5. Der Überstand trüb oder farbig, wiederholen Sie die Schritte 2,6 bis 2,5 (in dieser Reihenfolge) bis der Überstand ist klar und farblos.
- Das Pellet in 20 mL eiskaltes Puffer C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) durch aufschütteln der Röhre für 1-2 min aufzuwirbeln.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5.
- Fügen Sie 25 mL eiskaltes denaturierenden Puffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M Harnstoff, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) um die Einschlusskörperchen Pellet aufzulösen. Aufschwemmen Sie gründlich durch Vortexen für 1-2 Minuten, oder bis das Pellet in kleine Stücke gebrochen ist.
- Mischen Sie die Suspension durch axiale Rotation mit einer Rotationsrate von 30 u/min für 30-120 min bei 4 ° C.
- Klären Sie die denaturierten Proteinlösung durch Zentrifugation bei 30.000 x g, 4 ° C für 30 min, legen Sie überstand auf Eis und verwerfen Sie das Pellet zu.
- Die Konzentration des Proteins mit der Bradford-Test zu messen. 24 nehmen Sie ein Aliquot für SDS-Gel Analyse zu und legen Sie sie bei-20 ° C.
Hinweis: an dieser Stelle das Verfahren kann durch die regelmÄÑig Probe Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff angehalten werden und halten Sie es bei-80 ° C für die Lagerung.
(3) Protein Umfaltung
- Bereiten Sie 250 mL Puffer E (3 M Harnstoff, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M L-Arginin Monohydrochloride 20 mM reduzierte L-Glutathion, 2 mM oxidierte L-Glutathion) in einen 500-mL-Becherglas und kühlen Sie den Puffer bis auf 4 ° C.
- Hinzufügen von 60 mg von denaturiertem Protein-Mix mit seinem6-Tlp3-LBD in Schritt 2.13 bis 250 mL Puffer E, rühren die Puffer bei 500 u/min erhalten. Inkubieren Sie den refolding Mix unter ständigen Rühren bei 500 u/min für 24-48 h bei 4 ° C. Die endgültige Proteinkonzentration in diesem Schritt ist 0,2 mg mL-1.
- 7 L Puffer A in einem 8-10 L Eimer vorbereiten und kühlt es auf 4 ° C in Vorbereitung für den nächsten Schritt (Schritt 3.4), die in 24-48 h stattfinden wird (siehe Flussdiagramm in Abbildung 1).
- Tauchen Sie eine ~ 50 cm Stück Dialyse Schläuche mit überhöhten 28 mm Durchmesser, mit Molekulargewicht Cut-off bei 12-14 kDa in 200 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure Binatrium Salz (EDTA-Na2) und Erhitzen über einer Gasflamme zum Kochen bringen. Spülen Sie die Dialysemembran mit 200 mL DdH2O.
- Klemmen Sie ein Ende des Dialysemembran mit einem Dialyse-Schlauch-Verschluss und übertragen Sie die 250 mL Umfaltung in Schritt 3.2 in das Rohr Dialyse erhaltene Mischung zu. Schließen Sie das offene Ende mit einem anderen Klemme. Überprüfen Sie die Integrität der Membran, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind.
- Legen Sie die Dialyse-Röhre in ein Dialyse-Eimer mit vorgekühlten 7 L Puffer A im Schritt 3.3 hergestellt. Legen Sie eine magnetische rühren bar, um sicherzustellen, dass es nicht den Dialyse-Schlauch unter Rühren berühren.
- Dialyse die Probe bei 4 ° C mit 500 u/min weiter rühren und ändern Sie den Puffer mindestens vier Mal über einen Zeitraum von 12 h. Lassen Sie nach der letzten Änderung der Puffer die Probe um über Nacht dialyse.
Hinweis: Während der Dialyse, ist das Übermaß an Harnstoff (~ 3 M) allmählich aus der denaturierten Proteinlösung entfernt ermöglicht das Protein zu entfalten. Am Ende der Dialyse kann schwere Proteinfällung beobachtet werden. - Entfernen Sie die Dialyse-Röhre aus dem Eimer und übertragen Sie seinen Inhalt in einen 500-mL-Becherglas zu. Halten Sie die Proteinlösung auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
- Filtern Sie die Proteinlösung durch eine 0,43 µm Pore Größe Membran in eine 500 mL Flasche, ausgefälltes Eiweiß zu entfernen.
4. Reinigung von seiner6-tagged Proteins mit immobilisierten Metallion Affinitätschromatographie
-
Kostenlos und equilibrate eine 5 mL abgepackte chelatieren Spalte.
- Schließen Sie die Spalte an eine peristaltische Pumpe, um sicherzustellen, dass keine eingeschlossen in den verbindenden Rohrleitungen Luft.
- Waschen Sie die Spalte von 25-50 mL DdH2O. auf der Durchreise
- Laden Sie die Spalte, indem 3 mL 0,1 M NiCl2 laden und dann durch 25 mL DdH2O.
- Equilibrate der Spalte mit 25 mL Puffer F (Beladung Puffer, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol).
- Passen Sie die schnittsicheren Protein Probe im Schritt 3,9 auf die Zusammensetzung der Puffer F durch Zugabe von 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl und 2,5 mL der Stammlösungen 2 M Imidazol.
- Laden Sie die Probe auf die Säule bei einer Rate von 5 mL/min oder weniger und verwerfen die Durchströmung (ungebundene Proteine).
- Waschen Sie die Spalte mit 50-100 mL Puffer F, unspezifisch gebundene Proteine entfernen und entsorgen der durchströmten.
- Eluieren seiner6-Tlp3-LBD mit 25 mL Puffer G (Elution Buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol) und bündeln die durchströmten Brüche, enthält das Protein (wie mit dem Bradford-Reagenz bestimmt).
- Die Konzentration des Proteins in der gepoolten Probe mit der Bradford-Test zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten für SDS-PAGE-Analyse und Platz bei-20 ° C.
5. seine6-tag-Entfernung mit TEV Protease (Optional)
- Bereiten Sie vor, und kühlen Sie bis zu 4 ° C, 4 L Puffer H (TEV Spaltung Puffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (V/V) Glycerin, 2 mM DVB-t).
- Schneiden Sie ca. 5-7 cm Dialyse Schlauch (Durchmesser ca. 2-3 cm) und Tauchen sie in 200 mL DdH2O.
- Fügen Sie seine6-getaggt TEV Protease, die seine6-Tag Protein im Schritt 4.5 zu einem endgültigen Molverhältnis 1 TEV vorbereitet: 8 Protein.
- Klemmen Sie ein Ende des Schlauches mit einem Dialyse-Schlauch-Verschluss und füllen Sie ihn mit dem Protein/TEV Protease-Gemisch. Schließen Sie das andere Ende und sicherzustellen Sie, dass keine Lecks vorhanden sind.
- Ort die Dialyse Tubus in die vorgekühlte 4 L Puffer H (aus Schritt 5.1) und inkubieren Sie es bei 4 ° C mit kontinuierlichen rühren für 2 h. Änderung der Puffer und weiterhin Dialyse über Nacht die TEV-vermittelte Spaltung Reaktion abgeschlossen.
- In der Zwischenzeit bereiten und kühl (4 ° C) 4 L Puffer ich (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (V/V) Glycerin) in Vorbereitung für den nächsten Tag.
- Nach der Übernachtung Dialyse austauschen des Puffers, Puffer, die ich im Schritt 5.6 vorbereitet und dialyse für weitere 1-2 h bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Schlauch aus der Dialyse-Eimer, ausclipsen Sie ein Ende des Rohres und übertragen Sie die Proteinlösung auf eine 50 mL Falcon-Röhrchen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,43 µm Pore Größe Spritze Filter und halten sie auf dem Eis, sofern nicht anders angegeben.
- Messen Sie das Volumen der Probe und passen Sie die Tris, NaCl und Imidazol Konzentration auf die Zusammensetzung der Puffer F (z. B. für 25 mL Proteinlösung im Puffer J 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl und 0,25 mL 2 M Imidazol hinzufügen).
- Bereiten Sie eine 5 mL HiTrap chelatisierenden HP Spalte, wie unter Punkt 4.1 beschrieben.
- Laden Sie die Probe auf die Säule (Durchfluss: 5 mL/min) und sammeln Sie die Flow-through enthält der unmarkierten Tlp3-LBD (Rückstände 42-291). Uncleaved Protein, die gespalten sein6-Tag und seine6- TEV bleiben nach der Spalte.
- Waschen Sie die Spalte mit 5 mL Puffer F (Beladung Puffer) um alle unmarkierten Protein zu durchfließen und sammeln das Eluat zu ermöglichen.
- Pool das Eluat in Schritten 5.11 und 5.12 erhalten und die Proteinkonzentration zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten und bei-20 ° C für die SDS-PAGE-Analyse zu speichern.
6. Größe-Ausschluss Chromatographie (Gel Filtration) des Tlp3-LBD
- Bereiten Sie 1 L Puffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) und Filtern Sie es mit einem 0,43 µm-Membran.
- Eine 26/60-Größe-Ausschluss-Spalte mit Puffer A bei einer Durchflussmenge von 4 mL/min Equilibrate.
- Die Protein-Probe im Schritt 5.13 auf ein Volumen von 3 – 4 mL 15 mL zentrifugale Konzentrator mit einer 10 kDa Cutoff (4 ° C, 4.000 x g) zu konzentrieren.
- Klären Sie die Proteinlösung durch Zentrifugation bei 4 ° C für 30 min ausgefälltes Eiweiß entfernen 13.000 x g.
- Laden Sie die Probe auf die vorab äquilibriert 26/60 Gel-Filtration-Säule. Durchzuführen Sie Chromatographie in Puffer A bei einer Durchflussrate von 4 mL/min Monitor die UV-Ablaufverfolgung. Tlp3-LBD elutes bei einem Retentionsvolumen von 210-220 mL. Die Peak-Fraktionen zu bündeln.
- Die Proteinkonzentration zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten für SDS-PAGE-Analyse.
(7) SDS-PAGE-Analyse der Proben in verschiedenen Stadien der Proteinreinigung
- Bereiten Sie 1 L von SDS-PAGE läuft Buffer (Puffer J), mit 25 mM Tris, 250 mM Glycin pH 8,3 und 0,1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).
- 10 mL 5 x SDS-PAGE Loading Buffer (Puffer K) bereiten, mit 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % (w/V) SDS, 50 % (V/V) Glycerin und 1 mM DTT 0,05 % Bromophenol blue.
- Die Aliquoten gesammelt während der verschiedenen Schritte der Reinigung zu ermöglichen (Schritte 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) Auftauen.
- Mischen Sie für jede Probe das Volumen entspricht 15 µg des Gesamt-Protein mit 2 µL 5 X SDS-PAGE laden zu puffern, und stellen Sie die Lautstärke auf 10 µL mit DdH2O.
- Die Proben bei 95 ° C für ca. 5-10 min erwärmen, mit 10.000 x g für 30 s und Transfer drehen die Proben in ein sauberes Röhrchen.
- Bereiten Sie eine SDS-PAGE-Gel, mit 15 % Polyacrylamid-Gel zu trennen (für 5 mL: 2,5 mL 30 % (w/V) Bis-Acrylamid, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL DdH2O, 50 µL 10 % (w/V) SDS, 50 µL 20 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS), 3 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 5 % Polyacrylamid-Gel stapeln (für 2 mL: 340 µL 30 % (w/V) Bis-Acrylamid, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL DdH2O, 20 µL 10 % (w/V) SDS, 20 µL 20 % (w/V) APS, 2 µL TEMED).
- Montieren Sie die Elektrophorese-Apparatur und füllen Sie ihn mit 1 x SDS-Page Puffer nach Empfehlung des Herstellers ausgeführt.
- Laden Sie ein Protein Molekulargewicht Marker und die Proben im Schritt 7,5 vorbereitet. Führen Sie die Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 25 mA.
- Übertragen Sie das Gel in einen Behälter und spülen Sie ihn mit DdH2O. hinzufügen 150 mL Färbelösung mit 25 % (V/V) Isopropanol, 10 % (V/V) Essigsäure und 0,03 % (w/V) Brilliant Blue R-250 Coomassie-Blau. Stellen Sie den Behälter auf eine horizontale Drehung Plattform für 30 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie das Gel mit DdH2O und setzen Sie die destaining Lösung mit 5 % (V/V) Methanol und Essigsäure 7 % (V/V). Destain beim Mischen über eine horizontale Drehung-Plattform für 1 h.
- Bild das Gel und zu analysieren.
8. Runde Dichroismus (CD) Spektroskopie Analyse der Sekundärstruktur des schnittsicheren reines Eiweiß
- Übertragen Sie 0,5 - 1 mg schnittsicheren Protein in Schritt 6.6 in ein Dialyse-Rohr erhaltenen und legen Sie es in einem Dialyse-Eimer mit 5 L Puffer L (50 mM Natriumphosphat pH 7.4) vorgekühlt, 4 ° C. Dialyse die Probe bei 4 ° C unter ständigen rühren und mindestens 3-4 Puffer Änderungen ausführen über 2-4 h vor dem Verlassen der Probe um über Nacht dialyse.
- Die dialysed Proteinlösung auf 0,06 mg mL-1 mit einem 10 kDa Cutoff zentrifugale Konzentrator zu konzentrieren.
- Klären Sie die Lösung durch Zentrifugation bei 13.000 x g, 4 ° C für 30 Minuten.
- Notieren Sie das weit UV-CD-Spektrum der Probe bei 25 ° C in einem Wellenlängenbereich von 200-260 nm mit einer Spectropolarimeter mit einer Abtastrate von 20 nm min-1. Verwenden Sie den Dialyse-Puffer als ein leeres Steuerelement. Wiederholen Sie die Aufnahme in dreifacher Ausfertigung und erzeugen Sie das gemittelte Spektrum zu.
- Berechnen den Sekundärstruktur Inhalt von der CD deconvoluting Spektren mit dem CDSSTR-Programm von der DichroWeb trennen25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
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Representative Results
Rekombinante Expression von seinen6-Tlp3-LBD in E. Coli Protein Ablagerung in Einschlusskörperchen führte. Der Ausdruck Ertrag aus 1 L der Bakterienkultur in Schritt 2.13 berechnete war etwa 100 mg seine6-Tlp3-LBD in Einschlusskörperchen hinterlegt. Das Protein isoliert Verfahren, hier beschrieben und dargestellt in Abbildung 1, besteht aus Aluminiumionen Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung und Reinigung durch Affinitätschromatographie, Tag-Entfernung und Größe-Ausschluss-Chromatographie , und 10-20 mg reines, untagged Tlp3-LBD pro 1 L der bakteriellen Kultur ergibt.
Das Protein aus der Spalte "Gel-Filtration" als ein einziges, symmetrische Peak entspricht einem Retentionsvolumen von 220 mL (Abbildung 2A) eluiert. Berechnung der Molmasse (MW) mit einer Kalibrierung Grundstück von Log (MW) im Vergleich zu Retentionsvolumen (VAufbewahrung (mL) = 549.3-73,9 x log(MW)) auf der Website der EMBL-Protein-Expression und Reinigung Core Facility (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/Index.html), ergab den Wert von 29 kDa. Dieser Wert war sehr nahe, berechnet aus der Aminosäure-Sequenz (28,7 kDa), die vorgeschlagen, dass Tlp3-LBD ein Monomer in Lösung ist.
Um den Reinigungsprozess zu bewerten, wurden Proben in verschiedenen Schritten mit SDS-PAGE-Analyse ausgewertet. Wie in Abbildung 2 bdargestellt, Einschlusskörperchen enthalten überwiegend seine6-Tlp3-LBD. Kleine Mengen dieses Proteins waren ebenfalls in der löslichen Anteil der induzierten Kultur (IPTG(+)), und in der uninduced Kultur (IPTG(-)) – anscheinend aufgrund der undichten Ausdruck die T7-Polymerase. Seine6-Tlp3-LBD migriert auf dem Polyacrylamid-Gel mit einer scheinbaren Molekulargewicht von 28 kDa, in der Nähe der Wert aus der Aminosäure-Sequenz (31,8 kDa) berechnet. Die seine6-tag entfernen, Affinitätschromatographie und Filtrationsschritte ergab sehr reines Protein gel (> 90 % elektrophoretischen Homogenität).
Zu bestätigen, dass das Protein erhalten durch dieses Verfahren war gefaltet, die Sekundärstruktur von seinen6-Tlp3-LBD wurde durch CD-Spektroskopie untersucht. Schätzung der α-Helix und β-Sheet Inhalte aus dem CD-Spektrum (Abbildung 3) mit CDSSTR gaben 31 % α und 23 % β-Werte. Diese Werte wurden nahe bei den Vorhersagen aus der Sequenzanalyse mit dem Jpred3-Server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37 % α und 26 % β), darauf hinweist, dass das Protein erholte sich von den Harnstoff denaturiert Einschlusskörperchen gefaltet wurde.
Abbildung 1: Schematische vorgestellten Methode. Rekombinante seiner6-Tlp3-LBD ist Expressd in E. Coli nach Induktion mit IPTG (siehe Abschnitt 1). Nach 4 h Ausdruck Bakterienzellen werden geerntet und lysiert (siehe Abschnitt 2). Die unlösliche Fraktion mit die Inclusion Bodies (IB) ist für die Entfernung der Membran und Membran Proteine Verunreinigungen, wonach der IB werden aufgelöst in einem Puffer mit Harnstoff in hoher Konzentration (siehe Abschnitt 2) gewaschen. Seine6-Tlp3-LBD ist refolded durch Verdünnung in Puffer E gefolgt von erschöpfend Dialyse für die allmähliche Harnstoff Entfernung (Abschnitt 3). Seine6refolded-Tlp3-LBD ist dann durch immobilisierte Metallion Affinitätschromatographie gereinigt, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die seine6-Tag entfernt mit TEV Protease (Abschnitt 5). Untagged Tlp3-LBD ist konzentriert und weiter gereinigt durch Gel Filtration Chromatographie (siehe Abschnitt 6). Punkte für die Entnahme von Proben für die SDS-PAGE-Analyse sind gekennzeichnet mit *. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Reinigung von rekombinanten Tlp3-LBD. (A) Größe-Ausschluss Chromatographie Spur von unmarkierten Tlp3-LBD auf einer Superdex 200 unterschrieben 26/60-Gel-Filtration-Spalte. Das Protein mit einem Retentionsvolumen von 220 mL eluiert. (B) reduziert 15 % SDS-PAGE Coomassie Blau gefärbt Gel. M: Protein Molekulargewicht Marker; IPTG (-): uninduced Kontrollprobe in Schritt 1.3 gesammelt; IPTG (+): lösliche Anteil nach IPTG Induktion (gesammelt in Schritt 2.3); IB: isolierte Einschlusskörperchen (Schritt 2.13); Seine6refolded-Tlp3-LBD: schnittsicheren Protein Probe aus Schritt 4.6; Untagged Tlp3-LBD: Protein Probe im Schritt 5.13; Gel-Filtration 1 und 2: zwei Fraktionen vom Protein Peak eluiert aus der Spalte "Gel-Filtration" (Schritt 6.6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: kreisförmigen Dichroismus Spektrum gereinigt rekombinante Tlp3-LBD. Das Spektrum wurde bei 25 ° C in 50 mM Natriumphosphat pH 7.4 aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Ein einfaches Verfahren für Ausdruck und Umfaltung von Einschlusskörperchen der periplasmatischen LBD der bakteriellen Chemorezeptor Tlp3 wird vorgestellt. Vorbereitung des reinen Proteins beinhaltet Überexpression des Gens Haustier-Plasmid-encoded in E. Coli, Reinigung und Lutensol Einschlusskörperchen, Umfaltung des denaturierten Proteins und dessen Reinigung durch die aufeinander folgenden Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie Schritte. Die Harnstoff-erleichtert Denaturierung und Verdünnung/Dialyse-vermittelten Umfaltung sind die entscheidenden Schritte in das Protokoll, das Optimierung von denen oft erforderlich ist, um die ordnungsgemäße Renaturierung des Proteins in Einschlusskörperchen26hinterlegt zu gewährleisten.
Der Tlp3-LBD Umfaltung in gewissem Sinne in zwei Schritten, zunächst durch Verdünnen der denaturierten Probe in einen Puffer mit Harnstoff, und dann durch dialysing der Probe gegen einen Puffer es gelang. Das schnittsicheren Protein unter Verwendung dieses Protokolls war funktionell und kristallisierbaren18,23. Die vorgestellte Methode hat jedoch einige Einschränkungen. Es ist bekannt, dass Carbamylation von Aminogruppen häufig auftritt, wenn Protein denaturiert und in Anwesenheit von Harnstoff27,28,29refolded. Dies ist, da der gelöste Harnstoff mit der Zeit zerfällt und Cyanat30 , die reagiert mit der Protein-Aminogruppen produziert, eine stabile Carbamylated Produkt zu bilden und zu einem geringen Teil mit anderen funktionellen Gruppen31, 32. die Zersetzung von Harnstoff wird unter den Bedingungen der alkalischen pH-Wert und erhöhter Temperatur beschleunigt. Also, es empfiehlt sich, frische Harnstoff-Lösungen von hochreinen machen (> 99 %) solide Reagenz, und führen Sie die Umfaltung/Dialyse-Schritte bei niedrigen Temperaturen (4 ° C)30,33, Cyanat Bildung keinen Abbruch. Darüber hinaus ist die Wahl der Puffer mit primären Aminen, z. B. Tris, Glycin oder Ammonium Bicarbonat, für den refolding Mix wichtig, Aufräumen der produzierten Cyanat29,33. Andere Option ist Guanidin-Hydrochlorid anstelle von Harnstoff, verwenden wie Guanidin-Hydrochlorid nicht gemeldet worden ist, um Proteine chemisch zu ändern.
Neben Harnstoff ein Reduktionsmittel (DVB-t oder β-Mercaptoethanol) ist oft erforderlich, um anderweitig Einschlusskörperchen und zur Vermeidung von gebietsfremden Intra- und intermolekularen Disulfid Anleihen Bildung durch die Aufrechterhaltung der Cystein-Rückstände in ihrer reduzierten Zustand26 ,34. Tlp3-LBD hat eine intramolekulare Disulfid Bindung, und in diesem Protokoll, 10 mM DTT in den Einschlusskörperchen Denaturierung Puffer (Schritt 2.10 gegründet) zugunsten der Wiederfreisetzung des unlöslichen Proteins. DVB-t-Konzentration verringerte sich dann um ~ 100 Falte durch Verdünnen der Probe in das Protein Umfaltung Puffer, gefolgt von der Dialyse Schritt, nach und nach alle DVB-t zu entfernen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Anwendung dieses Verfahrens auf die Umfaltung der Proteine mit Mehrfachbindungen Disulfid Optimierung der Konzentration von Oxidations- und Reduktionsmittel eventuell (z.B. oxidiert und reduziert Glutathion (GSSH/GSH) GSSH/DTT, Cystamine/Cysteamineor Cystin/Cystein) Förderung der richtigen Bildung von Disulfid überbrückt34,35. Darüber hinaus Wenn das Protein des Interesses Cysteine ungepaarten hat, die nicht Disulfid Bindung Bildung beteiligt sind, sollte ein Reduktionsmittel alle Reinigung Puffer hinzugefügt werden. Vorhersage der potenziellen Disulfidbrücken von der Aminosäuresequenz eines Proteins mit mehreren in Silico Werkzeugen durchgeführt werden kann (z. B. Cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& Untergruppe = Propt).
Die Verwendung des vorliegenden Protokolls zur Reinigung von verschiedenen Proteinen dürfte auch zur Optimierung der Konzentration von Imidazol während Waschschritt 4.4 erfordern. Wie in Abbildung 2 b gezeigt (Lane IB gekennzeichnet), die isolierte Inclusion Bodies enthalten, in diesem Fall überwiegend das Protein des Interesses. Wenn weitere bedeutende Bands Gel der IB-Probe, Erhöhung der Imidazol-Konzentration in Schritt 4.4 wird benötigt, um die Verunreinigungen zu entfernen, aber möglicherweise verringern Protein Ertrag36,37auf SDS Seite sichtbar sind. Andere Möglichkeit besteht darin einen linearen Verlauf Imidazol-Konzentration und bündeln der eluierten Brüche, die das Protein des Interesses enthalten.
Der letzte Schritt bei der Reinigung, Größe-Ausschluss-Chromatographie, bietet die Möglichkeit, gleichzeitig schätzen die molekulare Masse des eluierten Partikel und leiten die Oligomeren Zustand des Proteins. Jedoch ist Schätzung der molekularen Masse von Größe-Ausschluss Chromatographie nur genau für sphärische Moleküle, was nicht der Fall für viele Proteine38,39ist. Man kann feststellen, dass das Protein molekulare Masse und Oligomere Zustand mit einer höheren Genauigkeit mithilfe Größe-Ausschluss-Chromatographie an Multiwinkel Lichtstreuung (SEC-MALS)40 oder Analytische Ultrazentrifugation41gekoppelt. Wir haben bisher bestätigt, dass Tlp3-LBD Monomere in Lösung mithilfe von SEC-MALS Analyse23, und dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Berichten über andere dCACHE Weihnachtskleidern42,43.
Die vorgestellte Protokoll wurde in seiner ursprünglichen oder abgewandelter Form verwendet, um umfalten und reinigen mehrere Chemorezeptor-Weihnachtskleidern aus der Familie der dCACHE für x-ray kristallographischen Studien17,18,19, 23 , 42 , 44. dieses Verfahren kann in der Regel für die Produktion von Milligramm-Mengen von periplasmatischen Weihnachtskleidern von anderen bakteriellen Chemorezeptoren in eine lösliche und kristallisierbaren Form nützlich sein. In jedem Einzelfall ist wahrscheinlich Protokoll Optimierung erforderlich. Zusätzlich zu den oben genannten Punkten, optimale Lutensol Einschlusskörperchen und Protein Umfaltung erfordern die Verwendung von Reinigungsmitteln (z.B. SDS oder N-Acetyl Trimethyl Ammoniumchlorid), Zusatzstoffe (z.B. L-Arginin) und Anpassung ihrer Konzentration und Inkubation Zeit in einzelnen Umfaltung Schritte26,34,45,46. Darüber hinaus beeinträchtigt die Proteinkonzentration im refolding Schritt erheblich die refolding Ausbeute. Das Spektrum der Konzentrationen von 1 ng mL-1 bis 10 mg mL-1 sollte in der Regel getestet werden. Für Tlp3-LBD war die optimale Konzentration des Proteins in den refolding Mix 0,2 mg mL-1.
Extrem niedriger Umfaltung Ertrag ist in der Regel ein Zeichen, dass die Versuchsbedingungen refolding alles andere als optimal sind. Man kann erwarten, dass diese high-Yield eine gefaltete Protein entspricht dem überprüft werden kann, mithilfe von CD-Spektroskopie (wie in diesem Verfahren beschrieben). Darüber hinaus können Crystallisability das resultierende Protein Sugguest das Protein gefalteten Zustand. Alternativ kann ein funktionelle Assay (falls vorhanden) verwendet werden, um zu bestätigen, dass das Protein gefaltet wird. Bei Tlp3-LBD beispielsweise das schnittsicheren Protein zeigte sich weiterhin seine Liganden-Bindungsfähigkeit, dargestellt durch Isotherme Kalorimetrie. 23
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Yu C. Liu für seine frühen Arbeiten auf der Tlp3-LBD-Produktion. Mayra A. Machuca ist verpflichtet, Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS für ein Promotionsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R.
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).
