En procedure er præsenteret for hvorved man genfolder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 fra inklusion organer og rensning at give milligram mængde af protein.
Identifikation af naturlige ligander chemoreceptors og strukturelle undersøgelser med henblik på udredning af det molekylære grundlag af ligand specificitet kan lettes meget af produktionen af milligram beløb af ren, foldede ligand bindende domæner. Forsøg på at heterologously express periplasmic ligand bindende domæner af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli (E. coli) ofte resultere i deres målretning i inklusion organer. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af periplasmic dCACHE ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som eksempel. Metoden indebærer udtryk for protein af interesse med en cleavable hans6-tag, isolering og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding og rensning ved affinitet kromatografi, efterfulgt af tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Cirkulær dichroism spektroskopi bruges til at bekræfte den foldede tilstand af ren protein. Det er blevet påvist, at denne protokol er generelt nyttigt for produktion af milligram mængder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæner af andre bakterielle chemoreceptors i en opløselig og crystallisable form.
Chemotaxis og motilitet har vist sig at spille en vigtig rolle i Campylobacter jejuni patogenesen ved at fremme bakteriel kolonisering og invasion af vært1,2,3. Chemotaxis giver mulighed for bakterier til at gå i retning af et optimalt miljø for vækst, som styres af kemiske signaler. Denne proces indebærer anerkendelse af intracellulære og miljømæssig kemiske signaler ved et sæt af proteiner kaldes chemoreceptors eller transducer-lignende proteiner (Tlps). De fleste chemoreceptors er membran-embedded proteiner med en extracytoplasmic ligand bindende domæne (LBD), en transmembrane domæne og et cytoplasmatisk signalsystemer domæne, hvor sidstnævnte interagerer med de cytosole signalsystemer proteiner, der sender signalet til flagellaternes motors4,5,6,7.
Elleve forskellige chemoreceptors er blevet identificeret i C. jejuni genom4,8. Til dato, kun nogle af disse chemoreceptors har været præget og ligand specificiteten af Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, og Tlp1113 er kendt. Identifikation af naturlige ligander af de resterende chemoreceptors i denne art, og talrige chemoreceptors i andre bakterier, kan lettes meget af produktionen af foldede og meget ren rekombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. imidlertid forsøg på at heterologously express periplasmic LBDs af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli ofte resultere i deres målretning i inklusion organer17,18,19 . Ikke desto mindre kan dette fænomen lette let isolation og inddrivelse af protein i hånden. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af den periplasmic LBD af C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som eksempel. I dette eksempel blev valgt, fordi Tlp3-LBD tilhører dCACHE familien20 af sensing domæner, som findes talrigt i to-komponent histidin kinaser og chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.
I denne tilgang, udtryk konstruktion, baseret på en pET151/D-TOPO vektor, har været udviklet til at inkorporere en N-terminale hans6-tag efterfulgt af en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang site, for efterfølgende tag fjernelse19. Protokollen beskriver protein overekspression i E. coli, isolation og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, og protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding. Efter, hvorved man genfolder, prøven er renset af affinitet kromatografi, med valgfri tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Foldede staten af oprenset protein er bekræftet ved hjælp af cirkulære dichroism spektroskopi. Dette er en modificeret udgave af den metode, der tidligere er udviklet til at restituere sig og rense LBD af en anden chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Denne procedure, sammenfattet i figur 1, udbytter 10-20 mg ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriekultur, med protein renhed > 90% som anslået af SDS-PAGE.
En enkel procedure for udtryk og hvorved man genfolder optagelse ligene af den bakterielle chemoreceptor Tlp3 periplasmic LBD er præsenteret. Forberedelse af ren protein indebærer overdreven udtryk for pET-plasmid-kodede genet i E. coli, rensning og opløsning af inklusion organer, hvorved man genfolder af den denaturerede proteiner og dets rensning af de på hinanden følgende affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi trin. Urea-faciliteret denaturering og fortynding/dialyse-medieret hvorved man genfol…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yu C. Liu for sit tidlige arbejde med Tlp3-LBD produktion. Mayra A. Machuca står i gæld til lejlighed Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS for et ph.d.-stipendium.
Tris base | AMRESCO | 497 | |
Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |