Summary
付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイを開発しました。この試金は牽引力顕微鏡、細胞、細胞外マトリックスおよび病原性細菌の生体力学的相互作用の定量的測定を可能にする、免疫染色、フローサイトメトリーと互換性が。
Abstract
細胞外マトリックスの剛性には、一般的な携帯電話の動作、機能、および運命に影響を与える知られている複数の環境機械刺激の一つが装備されています。ますます付着性のセル型のレスポンス剛性行列を特徴とすると、付着細菌感染に対する細胞の感受性によって決まるマトリックス剛性なんてとして主に知られているが細菌感染の影響で、宿主細胞のバイオメカニクス。我々 は細菌感染に対する宿主の血管内皮細胞の感受性によって異なりますこれらの細胞が存在するマトリックスの剛性とのバイオメカニクスが変更されるホストの感染が細菌細胞、仮説します。これら二つの仮説をテストするため、内皮細胞はモデルの病原体としてモデル ホストとリステリア菌として使用されました。小説ウェル フォーマット アッセイを開発することによってを示す菌、リステリア菌による内皮細胞の感染に及ぼす剛性マトリックスがフローサイトメトリー ・免疫染色顕微鏡続いてによって定量的に評価できます。さらに、ホスト内皮細胞バイオメカニクスの菌、リステリア菌感染の影響は牽引力顕微鏡を使用して、検討することができます。提案手法は、組織に関連する力学の付着性細胞の細胞、彼らの細胞外マトリックスの生体力学的相互作用の理解に向けての重要なステップである細菌の感染に及ぼす影響の解析と病原性細菌。このメソッドはさまざまな細胞のバイオメカニクスと基板剛性への応答に関する研究の他のタイプに適用されますも各実験では並行して多くの複製を実行することができる必要があります。
Introduction
ほとんどの動物の組織内の細胞が通常付着、隣接する細胞とその細胞外マトリックス (ECM) の両方を取り付けます。細胞の ECM へのアンカレッジは細胞の運動性細胞の増殖と生存の1,2に至る多くの細胞プロセスにとって重要です。ECM に細胞の定着は、ECM の組成と剛性の両方に依存します。セルは、動的に再配置することで、細胞骨格、細胞バイオメカニクスと機能3,4,5,6 を批判的に順番変更細胞外マトリクスと細胞間の癒着、後者の変化に対応します。.時間 (すなわち、高齢化)、および病態生理学的プロセス (例えば、動脈硬化、癌、感染症、等)、(すなわち、解剖学的位置)、スペース、ECM 剛性によって異なります。例えば、それは広く受け入れられているその血管内皮細胞上に存在する硬めの柔らかい行列と比較して、ecm と互いに高められた力を及ぼし、増加の運動性と増殖7、8を展示します。同様に、剛性行列上に存在する線維芽細胞は、ECM の高い収縮力を伝えるし、増殖の亢進、運動、および ECM 生産9,10,11を表示します。様々 な細胞タイプ、付着性宿主細胞との関係を細胞力学と ECM 剛性への応答が広く調査された、ECM、および細菌感染症の剛性はありませんまだ主として知られています。
ECM 剛性細菌ホスト細胞の相互作用の役割を研究するには、菌、リステリア菌(Lm) は、モデルの病原体として選ばれました。Lm は、さまざまな哺乳類を宿主の全身感染症を引き起こす可能性がユビキタス食品由来の菌です。この通性細胞内の病原体は、血管内皮細胞の種類を調べることによって腸の粘膜上皮から遠隔臓器で移動できます。Lm は、髄膜炎を引き起こす可能性が血液脳関門を違反にする場合、それは胎盤を交差させる、自然流産12,13を生じる。Lm は別のホスト細胞型に感染し、病原性の明瞭な作戦を使用してこれを行うことができます。Lm 感染はあまり Lm に感染することができる方法について知られているが、バイパス血管内皮細胞の血管14,15,16の内腔上皮細胞においてほとんど研究されています。さらに、それはまだ主として知られている内皮細胞が存在する ECM の剛性が Lm の能力これらの宿主細胞に侵入して、広めるために調節します。Lm といくつか追加の細菌種の (すなわち、リケッチア parkeri) ホストの両方に感染した細胞、細胞質に侵入して細胞間普及17を容易にするためのアクチン細胞骨格の活用,18,19. 彼らはホスト アクチン重合経路を妨害して16,20代の前方に推進力を促進するアクチン彗星の尾を生成するそれらを可能にする蛋白質の表現を通して、それを達成します。感染症の結果として宿主細胞のアクチン細胞骨格は動的にはまだ完全に特徴付けられる、出すは、ECM と各物理的な力を含む宿主細胞のバイオメカニクスに影響を与える可能性のある方法で再配置する必要があります。その他。これらのプロセスを調べるひと血管内皮細胞 (HMEC-1) モデル宿主細胞として 3 つの理由から選ばれた: 1 内皮細胞が知られている高度機械受容変動の物理的な手がかり21; 常に公開されている。2. Lm を血管内皮細胞に感染する採用戦略がまだ未知22;3。HMEC 1 不死化細胞ラインし、したがって、こと簡単に培養ができ遺伝子操作を受けます。
主に宿主細胞の細菌感染症研究生体外でガラスや、ほとんど電池12,14,23の生理学的な ECM より大幅剛性ポリスチレン基板上に細胞を播種されて。その剛性は生理学的に関連する行列に播種された細胞の感染を調べる、病原性細菌によって細胞の伝染の ECM 剛性の役割を解明するためには、我々 従って薄く加工に基づく革新的なアプローチウェル プレートの可変剛性のビーズに埋め込まれたポリアクリルアミド ゲル。提案されたアプローチの目新しさはそれがウェル フォーマットにより同時に複数の条件を監視できると基板が組み込まれている特定の方法のための複数の技術と互換性があります。HMEC 1 細胞これらタンパク質被覆ヒドロゲルでシード, 内面に蛍光になるか恒常蛍光を発する Lm の異なる株に感染し.ホスト HMEC 1 細胞の感染感受性の ECM 剛性の役割は、フローサイトメトリーで評価しました。さらに、免疫染色と蛍光顕微鏡は、付着および内面化された細菌を区別するために使用されました。最後に、牽引力顕微鏡 (TFM) は、感染時にその行列に内皮細胞を発揮牽引応力に Lm 感染の影響を特徴付けるために成功しました。提示されたアッセイは、異なる細胞や病原体を用いた付着性のセルの伝染の感受性に及ぼす ECM 剛性に関する研究を有効にするには、さらに簡単に変更できます。
Protocol
1. ウェル プレートに薄層ポリアクリルアミドゲル (PA) ゲルの製造
- 過硫酸アンモニウム (APS) を 10 グラム/mL の最終的な集中を達成するために超高純度蒸留水に溶かしてください。因数とストア短期使用 (3 週間) のための 4 ° C でソリューション。
注: 上記の解決策は、ゲル作製を事前に用意できます。 -
24 よく料理のガラスの活性化
- 室温でウェルあたり 2 M NaOH を 500 μ l 添加で 1 h 24 ウェル ガラス底板 13 mm 径井戸 (材料の表を参照) を孵化させなさい。
- 1 井戸を洗浄純水を x、500 μ L の 2% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加 (材料の表を参照してください) それぞれ 95% エタノールに 5 分も。
- 水でもう一度 x 1 井戸を洗い、30 分すすぎ 1 井戸の各ウェルに 0.5% グルタルアルデヒドの 500 μ L を追加水 x ふた付き 60 ̊ C でそれらを乾燥し、。
図 1: 様々 な剛性の薄い 2 層蛍光ビーズに埋め込まれたポリアクリルアミド (PA) ゲル上に存在する宿主細胞の細菌感染試験。A.ガラス coverslips 化学ハイドロゲルの添付ファイルを有効にするのに変更されます。B. 3.6 μ PA の混合物はガラスの底で堆積しました。C. 混合物の重合を可能にする 12 mm 円形ガラス coverslip で覆われています。D. 針注射器で、coverslip が削除されます。E. 2.4 μ L マイクロ ビーズと PA ソリューションの下のレイヤーの上に追加され、円形ガラス基板を頂いた。F. 井戸のバッファーが追加され、coverslip が削除されます。G. 1 h における紫外光照射により殺菌します。H.、10 分は私の UV の下で配置されているゲルのスルホ SANPAH 含むソリューションが追加されます。ゲルをバッファーで洗浄してそれからコラーゲン i. Jで夜通し孵化します。ヒドロゲルは携帯メディアと平衡に達した。K。 ホスト細胞を播種。L.Lm 細菌がソリューションに追加され、遠心分離を介して感染を同期します。M. ソリューションの 1 h 後感染細菌が洗い流される、抗生物質を添加したメディアが追加されます。N. 4 h 感染後、蛍光を発する Lm (JAT985) が開始。O. HMEC 1 セルのマトリックスから切り離されます、ソリューションが流れ cytometry 測定を行うためのチューブに転送されます。日、試金の各ステップに必要な時間が示されていることに注意してください。この図は、Bastounis と・ テリオ59から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
-
ポリアクリルアミド ゲル作製
注: 参照してください図 1.- 40% ストック アクリルアミド溶液の 3-10% を含む水溶液を準備 (材料の表を参照) と 0.06 - 2% 0.6% 貯蔵 bis アクリルアミド液 (材料表を参照) 0.6 からまで可変剛性のゲルを製造するには70 kpa kPa。表 1を参照してください。
- 0.6 kPa ヒドロゲルの 0.045% ビス アクリルアミドと 3% アクリルアミドをミックスします。3 kPa ヒドロゲルの 0.074% ビス アクリルアミドと 5% アクリルアミドをミックスします。10 kPa ヒドロゲルの 0.075% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。20 kPa ヒドロゲルの 0.195% ビス アクリルアミドと 8% アクリルアミドをミックスします。70 kPa ヒドロゲルの 0.45% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。
注: 望ましい PA ハイドロゲル剛性を達成するための詳細についてはさらに見つけることができます他の場所24,25,26,27。
- 0.6 kPa ヒドロゲルの 0.045% ビス アクリルアミドと 3% アクリルアミドをミックスします。3 kPa ヒドロゲルの 0.074% ビス アクリルアミドと 5% アクリルアミドをミックスします。10 kPa ヒドロゲルの 0.075% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。20 kPa ヒドロゲルの 0.195% ビス アクリルアミドと 8% アクリルアミドをミックスします。70 kPa ヒドロゲルの 0.45% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。
- 各望ましいハイドロゲル剛性の 2 つの水溶液を準備します。準備するソリューション 1 ビーズ無料ソリューション 2 0.03 %0.1 μ m 径蛍光マイクロ ビーズ (材料の表を参照) を格納します。
- ドガ ソリューション 1 と 15 分間の真空によって 2 ソリューションの重合を阻害する知られている酸素を除去するために。
- 重合開始を有効にするソリューション 1 に 10 グラム/mL の在庫 APS ソリューション、0.43% テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 0.6% を追加します。迅速に行動します。
- 24 よく料理の各ウェルのセンターにソリューション 1 の 3.6 μ L を追加 (その準備手順 1.2を参照してください)。
- すぐに 12 mm 未処理円形 coverslips に井戸をカバーし、ソリューション 1 のそれは完全に重合して 20 分間座ってみましょう。
- 優しく、coverslips の除去を容易に、その先端に小さなフックを作成するために表面に注射針をタップします。注射針を使用して coverslips を持ち上げます。
- 10 グラム/mL の原液 APS の 0.6%、0.43% を追加 TEMED ソリューション 2」に。24 よく料理の各ウェルに 2.4 μ L の最初の層の上に混合物を入金します。
- ソリューション 2 を 12 mm 円形ガラス coverslips にカバー、優しく下ピンセットのペアを使用して 2 番目の層の厚さを確保するため押しては最小限です。20 分間重合ソリューション 2 をしましょう。
- 各井戸に 50 mM HEPES pH 7.5 の 500 μ L を追加し、鉗子、注射針とガラス coverslips を削除します。
- 40% ストック アクリルアミド溶液の 3-10% を含む水溶液を準備 (材料の表を参照) と 0.06 - 2% 0.6% 貯蔵 bis アクリルアミド液 (材料表を参照) 0.6 からまで可変剛性のゲルを製造するには70 kpa kPa。表 1を参照してください。
-
殺菌、コラーゲン ・ コーティング、ポリアクリルアミド ゲルの平衡
- 公開-UV ティッシュ文化フードの 1 h のヒドロゲル殺菌できるようにします。
- 0.5% 重量/体積 sulfosuccinimidyl 6-(4 '-アジドフェニル-2'-nitrophenylamino) ヘキサン酸の混合物を準備 (スルホ-SANPAH、材料の表を参照してください) 1 %dmso と 50 mM HEPES pH = 7.5。
- この溶液 200 μ L をゲルの上面に追加します。UV を公開、高速動作 (302 nm) それらをアクティブにする 10 分間。
- 2 回を 1 mL 50 mM HEPES pH のヒドロゲルを洗う = 7.5。繰り返し任意の余分な架橋剤を確実に必要な場合は削除されます。
- タンパク質-0.25 mg/mL ラット 200 μ L をゲルのコート尾コラーゲン私 (材料の表を参照) で 50 mM HEPES の。上、室温で一晩コラーゲン溶液とゲルを孵化させなさい。
注: 脱水/蒸発を防ぐためには、二次封じ込めでウェルのプレートを配置し、格納容器の内部の周囲の水に浸したティッシュをクリーニング研究室を追加します。 - 40 X 目的と落射蛍光または共焦点の顕微鏡を使用して、ゲルの厚さを測定します。(ガラス面は) 下の z 位置を配置することによってそうとトップ (蛍光ビーズの強度が最大) ハイドロゲルの平面。その後、高さ z の位置を減算します。
注意: 使用して逆落射蛍光顕微鏡と 40 × 対物開口数 0.65 と、ゲルの厚さを測定します。原子間力顕微鏡による測定 (AFM) は、(図 2参照) ヒドロゲルの正確な剛性を確認するこの時点で実行できます。 - 利息、ゲルの細胞を播種する前に、ゲル上のメディアの 1 つの mL を追加し、平衡を確保するため 1 時間に 30 分の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
注: 我々 はどこモデル宿主細胞 (HMEC-1) (詳細については手順 2.1を参照) で培養したメディアであるため MCDB 131 一杯になったメディアを追加しました。
図 2: PA ハイドロゲル剛性とビーズの分布の AFM 測定。A. データ PA の期待のヤング率 (剛性の測定) を表示は、ハイドロゲル、アクリルアミドの量を考えると bis アクリルアミド使用する原子間力顕微鏡によるヤング率 (N = 5-6)。水平バーは、平均値を表しています。ゲルがので非常に柔らかく、AFM の先端に付着、0.6 kPa ヒドロゲルの剛性を測定できなかった。B. これは合流する HMEC 1 セルの位相画像とソフト 3 kPa PA ハイドロゲルの最優位の表面に埋め込まれたビーズの対応するイメージ。HMEC 1 は、ウェルあたり 4 x 10 の5セルの濃度で 24 h の播種。C.図 2Bとして、硬い 70 kPa PA ハイドロゲルに存在する細胞のため、この画像は同じ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. 人間の微小血管内皮細胞培養およびゲル上シード
- HMEC 1 を文化 (人間、微小血管内皮) MCDB 131 細胞 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、ヒドロコルチゾン、1 μ g/mL と L-グルタミン (を参照してください材料表の 2 mM を添加した MCDB 131 メディアを含むメディアがフル).
- 分割 1:6 の合流の文化ごとに 3-4 日と 40 の通路まで細胞を維持します。
- 1 日、実験の前に、0.25% トリプシン/EDTA で文化血管から細胞をデタッチします。最初のセルとその培養器 1 を洗う x 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 5-10 分の 37 ° C でフラスコをインキュベート 0.25% トリプシン/EDTA (100 mm ディッシュや 75 cm フラスコ、60 mm ディッシュやフラスコ 25 cm あたり 1 mL につき 2 mL) の適切な量を追加基板から細胞の剥離をできるようにします。
- MCDB 131 フル メディア、細胞の塊を破るし、円錐形遠心管にソリューションを配置に優しくピペットの適切なボリュームを追加してトリプシンを中和します。
- 優しくセル均等に分散して、ソリューションの 20 μ L を取るように細胞のソリューションを旋回し、非常に優しくガラス検定の coverslip の下に 2 つの部屋を記入します。
- ペレット 500 x g で 10 分間遠心分離を使用して円錐形遠心管に含まれるセルのソリューションを。
- 10 分待機期間中に診断を使用してセルをカウントします。顕微鏡を使用して 10 × 対物と検定のグリッド行に焦点を当てる、1 mm × 1 mm 平方に 1 つのセルの数をカウントする手集計カウンターを使用します。
- 別 1 mm × 1 mm の正方形に、検定を移動、そこのセルをカウント、さらに 2 回この手順を繰り返します。4 つの測定値の平均を計算し、掛ける 10 の平均4。最終的な値は、実行可能なセル/mL 遠心分離されて、細胞の懸濁液の数です。
- 細胞ペレットは中断されないことを確保しながら円錐形遠心分離機管から液体を削除します。4 x 105セル/mL の濃度で MCDB 131 フル メディアで細胞を再懸濁します。
- まず、ゲルを培養メディアを削除して各ゲルの細胞懸濁液の 1 mL を追加して、懸濁液、ゲル上の細胞を播きます。
3.菌、リステリア菌と人間の血管内皮細胞の感染症
- 事前準備
注: は、次の解決策を事前に準備します。-
クロラムフェニ コール、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン株式
- ストレプトマイシン硫酸塩 0.5 g を計量し、10 mL の超純水水に完全に溶解ストレプトマイシンの 50 mg/mL の原液を準備します。
- クロラムフェニ コールの 75 mg を計量し、100% エタノール 10 mL に完全に溶解クロラムフェニ コールの 7.5 mg/mL の原液を準備します。
- 硫酸ゲンタマイシンの 0.2 グラムの重量を量る 10 mL の超純水水に完全に溶解ことにより、ゲンタマイシンの 20 mg/mL の原液を準備します。
- すべて原液 0.2 μ m のシリンジ フィルターをフィルター滅菌し、長期使用 (1-2 ヶ月) のための-20 ° C で保存します。
-
脳心注入 (BHI) メディアと寒天プレート
- 2 つの 1 L フラスコを検索し、各フラスコ内電磁攪拌棒を追加します。
- BHI メディア BHI 粉末 37 g 1 つのフラスコで、純水 1 l. ミックス ソリューション粉末を溶解するまで電磁攪拌プレートにフラスコを置くことによって積極的に追加します。
- BHI 寒天 37 g BHI パウダーとグラニュー寒天 15 g を追加 (材料の表を参照してください) 第 2 フラスコ内で粉体を溶解するまで電磁攪拌プレートにフラスコを置くことによって純水 1 l. ミックスまでのソリューションを積極的に追加し、。
- 余りに堅く、フラスコの蓋をネジとオートクレーブを設定またはオートクレーブの仕様によると、液体を用いたソリューション。
- オートクレーブからソリューションを削除し、55 ° C に BHI 寒天ソリューション クールダウン1 L フラスコで BHI メディアが滅菌保持されている場合ために使用することができます 1 ヶ月まで。
- BHI 寒天培地プレートに細菌を準備するには、に応じて、BHI 寒天培地 (によって成長する細菌の緊張) を含むフラスコにまず抗生物質を追加します。急速混合できるように電磁攪拌板にフラスコを簡潔に入れます。
注: ここで使用される抗生物質 Lm 供に特有ですが、BHI 寒天で、必要に応じて抗生物質を使用できます。10403S Lm 系統、ストレプトマイシンに対する耐性があるために、濃度 200 μ G/ml と 7.5 μ g/mL の濃度にクロラムフェニ コールにストレプトマイシンをしました。これらの系統がされている共役、クロラムフェニ コールのアセチルトランスフェラーゼ開いたリーディング ・ フレーム、それゆえを含むプラスミドとクロラムフェニ コールへの抵抗。 - 注ぎ混合物 10 cm ポリスチレン細菌培養皿 (プレートごと約 20 mL)。気泡を取り除くために、プレートの上面を簡潔に炎します。クール プレートは室温で一晩します。
- 次の日、乾燥プレートをシールし、4 ° C で保存
-
クロラムフェニ コール、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン株式
- 菌、リステリア菌と人間の血管内皮細胞の感染
- 感染前に、3 日間 Lm うち連勝は 7.5 μ g/mL クロラムフェニ コール、ストレプトマイシンの 200 μ G/ml が含まれる場合、適切な BHI 寒天培地プレート上に (-80 ° C で保存) グリセロール ストックから使用するひずみ。
注: を縞にするのにひずみは野生型や変異、恒常発現 (JAT1045 を用いて染色) 用蛍光または ActA プロモーター (流れの cytometry または牽引力の顕微鏡の JAT983 または JAT985 の下で蛍光を表現をすることができます。使用された)22。 - (1-2 日) の植民地離散までは、37 ° C でプレートを孵化させなさい。
- 感染、前日は成長目的のひずみ、一晩 30 ° c (該当する場合) はクロラムフェニ コールの 7.5 μ g/mL と BHI メディアで 150 rpm で揺れているようです。
- 場所 5 mL の遠心分離機 15 mL コニカル チューブに BHI 培クロラムフェニ コール (該当する場合)、7.5 μ g/mL を加えるし、寒天培地滅菌 10 μ L チップを使用してから単一コロニーを接種します。
- 感染の直前に、次の日 600 でバクテリア溶液の光学密度を測定サンプル 1:5; を希釈して nm (OD600)空白として使用するだけで BHI を含むキュベットを使用します。
- 0.1 の OD600 に一晩かけて培養を希釈し、7.5 μ g/ml のクロラムフェニ コール (該当する場合) の BHI メディアでの 30 ° C で 2 時間ログ相成長に到達する細菌を許可するように揺れ、それを孵化させなさい。
- 測定 0.2 - 周りに予想される細菌のソリューションの OD600 0.3。0.2 - でそれを希釈、OD600 が高い場合、BHI だけで 0.3。
- 微量遠心チューブに細菌溶液 1 mL を入れます。室温で遠心分離を使用して 2,000 x g で 4 分の間それを回しなさい。上澄みを除去し、組織培養グレード PBS、ティッシュ文化フードの 1 mL の細菌のペレットを再懸濁します。室温で 2,000 x g で 4 分のそれらを回すことによって倍の細菌を洗浄します。上澄みを除去し、1 mL の PBS の細菌を再懸濁します。
- MCDB 131 フル メディア (MOI; 感染症の多様性のための 1 mL の PBS で再停止される細菌の 10 または 50 μ L を混合することによって感染のミックスを準備します。すなわち、宿主細胞あたりの菌数) 約 50 細菌宿主細胞や宿主細胞あたり 10 細菌の。
- ゲルまたはセルを妨害しないように注意してください 24 ウェル プレートの井戸からメディアを削除します。洗浄セル 1 MCDB 131 の 1 ml x メディアがフルし、各ウェルに細菌の 1 つの mL を追加。
- MOI の決定のためのいくつかの感染症ミックス (少なくとも 100 μ L) を維持 (ステップ 3.3を参照)。
- カバーの蓋付きプレートと漏れを避けるために食品ラップをポリエチレンでプレートをラップします。遠心分離機でプレートを配置し、侵攻を同期する 200 x g で 10 分間のサンプルをスピンします。組織培養の定温器にプレートを移動し、37 ° C で 30 分間インキュベートそれら
- サンプル 4 を洗う MCDB 131 x メディアがフルし、組織文化のインキュベーターにそれらを移動します。さらに 30 分後に、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加したメディアでメディアを置き換えます。
- 感染前に、3 日間 Lm うち連勝は 7.5 μ g/mL クロラムフェニ コール、ストレプトマイシンの 200 μ G/ml が含まれる場合、適切な BHI 寒天培地プレート上に (-80 ° C で保存) グリセロール ストックから使用するひずみ。
- 感染症 (MOI) の多様性の定量
- 細菌と宿主細胞の最初の 30 分孵化中に、MOI を決定する感染ミックスの 10 倍のシリアル希薄を準備します。1 × PBS (10-1希釈) の 900 μ L で感染ミックスの 100 μ L を混合することによって 10 倍希釈液を作る。900 μ L の PBS (10-2希釈) 10-1希釈の 100 μ L を混ぜます。
- 10-5希釈が得られるまで続けます。
注: すべてのソリューションは、よくそれらを希釈する前に混合する必要があります、新鮮なきれいなピペット チップは各ステップで使用する必要があります。 - 希釈を加えた後、10-2 - (該当する場合)、BHI、寒天、クロラムフェニ コール、ストレプトマイシン プレートの中心に 10-5希釈液 100 μ L を配置します。
- フックを作成するピペットを曲げないように火を使用してガラス ピペットから散布を行います。殺菌のため 100% エタノールでピペットを浸し、その後、炎を上げてエタノールを燃焼します。
- 拡散機を冷却して、一度 10-5希釈から始まってより集中しているミックスに移動板に均一細菌希釈を広めます。2 日間の 37 ° C で逆さま版を孵化させなさい。
- コロニーの密度に応じていずれか 10-3 10-4または 10-4と 10-5希釈プレートのコロニーの数を決定します。慣性モーメントを次のように計算します。
植民地 × 希釈係数 ÷ ボリュームの初期追加数 μ L あたり CFU の数 =
μ L/ウェル菌ミックス × 量あたり CFU の数 = 井戸あたり CFU の数
井戸ごとのセル × ボリュームも CFU の数 = セルあたりの細菌数
注意: CFU 意味コロニー形成単位。 - 最終的なモアを取得する 2 つのプレートからモアを平均します。
4. 感染宿主細胞の細胞外マトリックス剛性依存感受性を定量化するためのフローサイトメトリー
- コラゲナーゼの 5 mg の重量を量る、15 mL の円錐形遠心管中に置きます。0.25% トリプシン-EDTA の 10 mL を追加し、よく混ぜます。
- 8 h 感染後、24 ウェル プレートの井戸からメディアを取り出し、洗浄 1 培養 PBS で x。井戸から PBS を削除し、各ウェルにトリプシン-EDTA/コラゲナーゼ ミックス 200 μ L を追加します。セルの完全離脱を許可する 10 分間培養孵卵器でこれを置きます。
- 井戸およびピペット 8 x 上下ミックスごとに新鮮なピペットを使用します。細胞を損傷しないように優しくすること。トリプシンを中和するために各ウェルに一杯になったメディアの 200 μ L を追加します。
- 35 μ m セル ストレーナー キャップ付き 5 mL ポリスチレン管各ウェルの 400 μ L 携帯ソリューションに転送 (材料の表を参照してください)。
- フローサイトメトリーによるサンプルごとの 10,000-20,000 の細胞を分析します。フローサイトメトリーによるデータ取得を実行し、/ウェル関連の市販ソフトウェアを使用して感染した細胞の割合を決定します。細胞数の分布の大部分をゲート側散布と前方散乱を使用します。
注: これは単一細胞を分析を確保し、残骸または細胞ダブレットまたは三つ子を排除します。- 制御感染細胞からの蛍光信号を測定し、蛍光を除く感染細胞の人口のゲートします。
5. 細胞細菌顕微鏡画像処理の免疫染色
注: このアプローチは ECM 剛性依存細菌付着細菌の内面 (侵略)、ホスト内で対ホスト細胞表面上に区別するためにされます。
図 4: Lm 感染 HMEC 1 の免疫染色は細胞侵入対細菌の付着を区別するためにさまざまな剛性のヒドロゲル上します。これらの画像は、 Aを示す差分免疫染色の代表的な例を示します。細胞核 (DAPI) B。すべての細菌 (GFP) とC。外の細菌 (Alexa-546)。HMEC 1 セルがソフト 3 kPa ハイドロゲルに寝泊まりしていた。矢印は、緑のチャネルのみに表示されるように内在している細菌をポイントします。Dデータ N を参照してF = 感染 HMEC 1 セル ソフト 3 kPa と硬い 70 kPa ゲルおよびDを表示の上の 20 の画像。核; あたり合計細菌E. 核; あたり内面化された細菌とF. 侵入効率 (全細菌に内面化された細菌の比率)。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 感染後 30 分、洗浄 HMEC 1 細胞感染 JAT1045 (恒常緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する Lm) 4 x メディアを。
- 第 4 回洗浄後 MCDB 131 一杯になったメディアの 1 mL と 1 mg/mL の 1 μ L ヘキスト染料を混ぜるし、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置します。
- 1 セルを洗浄して PBS の x。部屋温度28で 20 分の差分免疫染色の構造の非固定液で固定します。
注: 固定液には、0.32 M ショ糖、10 mM MES pH 6.1 138 mM KCl、MgCl2、3 mM 2 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 4% のホルムアルデヒド (電子顕微鏡グレード) が含まれています。 - 1 セルを洗浄して PBS の x。5% ウシ血清アルブミンとの 30 分のためのサンプルのブロック (表の材料を参照) PBS で。
- アンチ Lm で 1 h のサンプルをインキュベート一次抗体 (を参照してください材料表) 2 %bsa を含む PBS で 1: 100 希釈します。
- PBS 3 でサンプルを洗う x し、それらをインキュベートして 1 h AlexaFluor 546 ヤギ抗うさぎ抗体は 2 %bsa を含む PBS で 1: 250 を希釈 (材料の表を参照してください)。サンプル 3 を洗って PBS で x。イメージングのための 1 mL の PBS のサンプルを格納します。
- イメージし、条件ごとの以上 1,000 セルを分析します。
- CCD カメラを使用して逆落射蛍光顕微鏡、イメージングのため (材料の表を参照してください)、0.6 開口数 (NA) と空気計画蛍石空気目的 X 40。
注: 力は 25% に設定され、100 さんに露出時間 mCherry 用顕微鏡フィルターが 470/525 nm、GFP 530/645 nm の励起と放射のための DAPI 395/460 nm のそれぞれ。我々 が使用される顕微鏡は、オープン ソース顕微鏡ソフトウェア パッケージ29によって制御されました。 - 差分免疫染色の付着として個々 のセルに関連付けられたすべての '緑' 細菌を数えます。'緑' と '赤' (のために抗体の結合) として内在化している非細菌を数えます。
注: カスタム スクリプトと CellC ソフトウェアを実行することによって核数がわかりました (材料の表を参照してください) 細菌30の列挙。
- CCD カメラを使用して逆落射蛍光顕微鏡、イメージングのため (材料の表を参照してください)、0.6 開口数 (NA) と空気計画蛍石空気目的 X 40。
6 ウェル牽引力顕微鏡および単分子膜応力顕微鏡
図 5:感染時の ECM に出す牽引力のマグニチュードを減少させる Lm 感染 HMEC 1 セル.パネルAは位相画像Bは変形場を示して、 Cが牽引応力場やDショー、20 kPa ハイドロゲル上感染 HMEC 1 細胞の細胞内張力場を示しています。変形のカラーバー マップ (μ m)、牽引力のストレス マップ (Pa)、細胞内張力のマップ (nNµm-1) は、ヒート マップの上部に表示されます。列に 3 つの代表的な時間ポイントが表示: 3, 8, 18 h の感染後。E H。パネルA~D 300 の MOI で Lm 感染細胞と同じです。細菌 (赤のチャネル) の画像をセルの位相画像に重ね合わせます。TFM の録音は、同時に複数の井戸をイメージングによって実施されました。PIV のウィンドウ サイズは、16 の重なる部分が 32 ピクセルをだった。スケール バーは、32 μ m です。この図は、Bastounis と・ テリオ59から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 24 ウェル プレートに PA ヒドロゲルを準備 (手順 1を参照)。Seed HMEC 1 (手順 2を参照) を細胞し、それらを感染と前述の JAT983 上記 (手順 3を参照)。
- 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、1 μ g/mL ヒドロコルチゾン リーボビッツの L-15 を継ぎ足すことによって住んでいる顕微鏡媒体を準備します。
注: L-15 は、MCDB 131 メディアの場合と同様に余分なを追加する必要はありませんので、2 mM L-グルタミンを既に存在します。 - 4 h の後感染 (起動時内面 JAT983 蛍光を発する) L-15 一杯になったメディアの 1 mL と 1 mg/mL の 1 μ L ヘキスト染料を混ぜるし、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置し、各ウェルの L-15 フル メディアに置き換えます L-15 ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加した完全なメディアの 1 mL。
- カバー プレート蓋と場所を顕微鏡の試料室には 37 ° C に平衡 (材料の表を参照してください)。
注: 画像を CCD カメラ逆落射蛍光顕微鏡を使用 (材料の表を参照してください)、0.6 と空気計画蛍石空気目的 X 40 na という - 蛍光ビーズや蛍光菌のコマ撮り画像をマルチ チャンネルと宿主細胞、4 に 12 時間 10 分毎の位相コントラストの画像を取得します。
注: イメージングのための力は 25% に設定された、100 さんに露出時間 mCherry と GFP 用顕微鏡フィルター (励起/蛍光) 470/525 nm と 530/645 nm それぞれ。 - 録音の最後に、各井戸の水で 10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 500 μ L を追加します。
注: セルは、ハイドロゲルからデタッチされ、ヒドロゲルは弾性があるので、初期の変形前の状態に戻ります。 - ヒドロゲルのイメージを取るし、参照変形していないイメージとしてそれを使用します。
- 粒子画像流速測定法 (PIV)31、変形前のハイドロゲルの参照画像をコマ撮りシリーズの各画像を比較を使用して時間の各瞬間、ハイドロゲルの二次元変形を決定します。適切なウィンドウ サイズを使用し、実験によって重複。
注意: 16 ピクセルの重なる部分が 32 ピクセルのウィンドウを使用しています。 - 細胞に与えるハイドロゲルも32,332D 牽引応力を計算します。
- 牽引ストレスから単分子膜張力前述の単分子膜に PA ハイドロゲルによって作成された反力を受ける弾性平板の力学的平衡の方程式を解くことによって34の方法を計算します。測定の牽引ストレス サインの反対。
注: は、補足資料 1を参照してください。
7 査定細胞外マトリックス剛性依存菌、リステリア菌の普及を通じて内皮細胞と微速度顕微鏡観察定量
図 6: HMEC 1 分子を介して Lm 普及のタイムラプス定量顕微鏡データは 3 kPa および 70 kPa 剛性を有する基板上にシードします。A.このパネルはまだ 0、200、400、600 分、2 つの代表的な感染巣からのイメージを示しています。相チャネルを示し HMEC 1 細胞膜、赤のチャネルは、細胞内の Lm を示しています (プロトコルの手順 7を参照)。B。 このパネルは、時間の関数としてプロット感染症フォーカスを包含凸包の領域を示しています。3 kPa 状態 (赤) のフォーカス エリアは (緑) では 70 kPa のより速く育ちます。C.このパネルは、感染病巣 (赤) 3 kpa PA 基板上にシード HMEC 1 単分子膜の成長と 70 kPa (グリーン) 剛性感染症フォーカスの端に中心からの放射状の距離が担当者の時間の関数としてプロットを示しています。放射状の速度 (dr/dt) は、70 kPa 条件の相性、3 kPa 条件一定です。D. これらのデータが 10 の独立した感染巣の最初の 200 分の放射状の速度を示します。赤 (3 kPa) と緑 (70 kPa) のデータ ポイントを描く前のパネルで説明している 2 つの巣の斜面。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 24 ウェル プレートに PA ヒドロゲルを準備 (手順 1を参照)、シード HMEC 1 セル (手順 2を参照)、および (を参照してくださいステップ 3) 上記のように一晩 JAT983 文化を育てます。
- 感染症の日 MCDB 131 一杯になったメディアの mL あたり細菌ペレットの 10 μ L を混合することによって感染のミックスを準備します。慎重に 24 ウェルの井戸からメディアを削除し、各ウェルに 1.9 mL MCDB 131 フル メディア、細菌のミックスの 0.1 mL を追加します。
注: この試金で使用される低い慣性モーメントから単一の細菌が宿主細胞に侵入を開始する普及イベントを分析する必要は。 - その蓋付きプレートをカバーし、漏れを避けるためにプラスチック製のラップでそれを封印します。遠心分離機でプレートを配置し、侵攻を同期する 200 x g で 10 分間のサンプルをスピンします。
- 組織培養の定温器にプレートを移動し、5 分間インキュベートします。
- 洗浄サンプル 4 x メディアをし培養孵卵器に移動します。追加の 5-7 分後に、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加したメディアでメディアを交換します。
- ActA プロモーターをオンにし、mTagRFP の発現を開いたリーディング ・ フレーム35にドライブできるように余分な 5 時間のためのインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
- 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、1 μ g/mL ヒドロコルチゾン リーボビッツの L-15 を継ぎ足すことによって住んでいる顕微鏡媒体を準備します。
注: L-15 は、MCDB 131 メディアの場合と同様に余分なを追加する必要はありませんので、2 mM L-グルタミンを既に存在します。 - 1 mg/mL ヘキストのミックス 1 μ L 1 ml L-15 一杯になったメディアの色素し、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置し、各ウェルの L-15 フル メディアに置き換えます L-15 ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加した完全なメディアの 1 mL。カバー プレート蓋と場所を顕微鏡の試料室には 37 ° C に平衡 (材料の表を参照してください)。
注: イメージング、逆落射蛍光顕微鏡を用いて CCD カメラで (材料の表を参照してください)、0.75 と空気計画蛍石空気目的 X 20 na という力が 50% に設定され、50 ms までの露光時間 mCherry 用顕微鏡フィルターが 470/525 nm 励起と放射のそれぞれ。 - Lm がどのように HMEC 1 分子を介して拡散を監視するオート フォーカス機能を使用して 5 分ごとに複数の位置が可変剛性ヒドロゲルにシードのイメージ。
注: L-15 がバッファーされ HEPES、イメージング中に CO2を使用する必要はありませんので。
Representative Results
Lm 感染細胞 HMEC の ECM 剛性に依存の感受性:
さまざまな剛性の PA ヒドロゲル、すべては表面をコーティングしたコラーゲン私、プロトコルの手順 1で説明したようにマルチよくガラス底板に造られた (図 1参照)。26,27を前述のように、ゲルの正確な剛性を確認する AFM 測定を行った (図 2参照)。過去の研究は、内皮細胞の基底膜のローカル コンプライアンス 1 kPa (例えば、脳組織) から 70 kPa (例えば大動脈)36,37,38,の範囲が示されています。39,40。 したがって、次剛性行列上に存在する HMEC 1 細胞の感染をテストしました: 70 kPa 20 kPa、3 kPa 0.6 kPa。各ハイドロゲル剛性の結果の再現性を評価するために六つのゲルを作製しました。
フローサイトメトリーは、Lm 感染 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性を評価するために使用された (図 3参照)。HMEC 1 細胞は細胞内細菌のみ (参照図 1 L - 1N) の検出を許可する内面化 (actAp::mTagRFP) 後、蛍光マーカーを表す Lm ひずみ (JAT985) に感染していた。JAT985 はまた、ActA、ActA はアクチン彗星の尾およびそれに続く細菌の散布の形成に必要な細胞から細胞に広がってから細菌を無効にすることを欠いています。7-8 h 後 HMEC 1 細胞の感染は、フローサイトメトリーを使用して査定されました。単一細胞を分析するように、細胞数の分布の大部分は、対側の散布、フォワードを使用ゲートだったし、蛍光を示す細胞を除外する 2 番目のゲーティング ステップを行った、(図 3 a - 3 Cを参照してください。).図3 予備的な結果を示すその Lm HMEC 1 感染が約 2 倍 HMEC 1 セル ソフト 0.6 kPa ゲル上のセルと比較すると硬い 70 kPa ゲル上の大きい (図 3B - を参照してください。3D). ソフト行列と比べて硬い上に存在する HMEC 1 セルの Lm 感染感受性の増加に起因することができる: 1; HMEC 1 に Lm 付着力が強く。2. 増加 Lm 侵入 HMEC-1;または 3。上記の共起するの両方。HMEC 1 細胞が仮説を保持をテストするソフト (3 kPa) と硬い (70 kPa) ヒドロゲル シード, Lm を表現する GFP 恒常に感染して (図 4 a - 4 C参照)。サンプルは、感染直後に修正され、外部 (付着) 細菌は抗体で染色しました。定量的な顕微鏡を使用して、宿主細胞に存在する柔らかいゲル ( 4 図D参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 へ付着したかなり多くの細菌があることがわかった。流れの cytometry のデータと一致して、大幅により多くの細菌は宿主細胞に存在する柔らかいゲル (図 4E参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 によって内面化します。しかし、HMEC 1 セルに Lm の侵入効率 (細菌の内面/総細菌数) は同様に、基板の剛性に関係なく (図 4F参照)。
Lm 感染 HMEC 1 細胞の牽引力顕微鏡:
Lm HMEC 1 細胞の感染は、添付ファイルの ECM にまたは互いにそのバリアの整合性に影響を与えず強度を含む、感染した宿主細胞のバイオメカニクスを変えることができます。我々 は細胞 ECM 牽引力と単分子膜応力顕微鏡41細胞内張力力を計算する計算する牽引力顕微鏡32を使用してケースをできるかどうかを評価しようと思う。図 5は、変形フィールド、牽引応力場と異なる時間ポイント感染後に 20 kPa ヒドロゲル上 HMEC 1 細胞の細胞内張力場のマップを示しています。図 5 a - 5 Dは、図 5E中感染制御 HMEC 1 セルを参照 - 5 H 300 細菌/セルと同じ感染症の多様性で Lm HMEC 1 細胞を参照してください。この準備作業は、感染制御の細胞のない観察されるに対し感染 HMEC 1 細胞が lm、感染の過程で細胞外マトリクスと細胞内ストレスの大きさを減らすことを示唆します。
ECM 依存剛性 Lm 普及 HMEC 1 分子の間で:
微速度顕微鏡観察の効果を調べるために, HMEC 1 分子による Lm の剛性行列が。Lm は、単分子膜に広がる、細菌は時間 (参照してください図 6Aとビデオ図 1および2) の関数として成長感染のフォーカスを作成します。感染症フォーカス部を凸、細菌42周りのポイントのセットを含む最小の凸ポリゴンを描画することによって測定しました。菌、リステリア菌宿主細胞の単層細胞-細胞拡散の効率を測定する分野では標準的な指標はありません。拡散効率を評価するためにいくつかの感染症フォーカス41の場合は、宿主細胞の数をカウントしているし、感染ホスト細胞43のグループの周りに手動で描画境界を持って他の人。菌、リステリア菌の拡散の効率を測定するための自動化された、一貫性、および計算安価なプロセスだから、細菌の周り凸多角形を描画しました。これにより我々 は 70 kPa ヒドロゲル シード 3 kPa 行列 (図 6Bとビデオの数字 1と2を参照) のそれらと比較されたときにシード HMEC 1 セルで感染症フォーカス領域のわずかな減少を見つけた。感染症フォーカスの成長速度を決定するには、半径の距離は感染症フォーカスの面積の平方根 pi によってこれを割ることによって時間の関数としてプロットしました。この数学的な変換では、感染症フォーカスの形状はほぼ円形44と仮定します。フォーカス成長の速度を測定するには、両方 3-70 kPa 行列の半径方向の距離の変化 (すなわち斜面) の速度を測定しました。このアプローチが明らかに感染症フォーカスが HMEC 1 セル 3 kPa 行列上でより速く、単調増加しました。ただし、フォーカスでは、大幅に遅くなります (最初の 200 分) とわずかに遅い (200 に 600 分) を (参照してください図 6C) 70 kPa 行列に播種された細胞に成長しました。確かに、さらにデータの分析を確認、感染症フォーカス伸び率は、平均では、2 倍 70 kPa 行列で特に最初の 200 分間 (図 6Dを参照してください)。
図 3: Lm 侵略 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性をフローサイトメトリーを用いて測定. HMEC 1 セルが Lm (JAT985) で感染し、感染したフローサイトメトリーで分析しました。A. このパネルは単一の井戸から来る代表 HMEC 1 細胞の前方散乱プロット対側を示しています。(左) 破片を除外し細胞ダブレット、トリプレット (右) のゲートを介して細胞の一括配布が選ばれました。B. HMEC 1 ソフト 0.6 kPa にメッキのため、このグラフはセルあたり Lm の蛍光強度の対数のヒストグラムを示しています。Cします。 このグラフは、HMEC 1 硬い 70 kPa ゲル上メッキのセルごとの Lm の蛍光強度の対数ヒストグラムを示しています。N のヒストグラム = 4-6 レプリケートが異なる色で表示されます。感染制御の細胞のヒストグラムは紫です。何が感染しているを定義するために使用するゲートは、赤で表示されます。覚書は 100、感染症は感染後評価 8 h。D. データを示すハイドロゲル剛性対感染 HMEC 1 細胞の割合 (N = 5)。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ図 1: HMEC 1 細胞膜 (フェーズ) を介して細胞内 Lm (赤のチャネル) の普及はシード 3 kPa 基板上。リーボビッツの L-15 メディアでセルをイメージしました (10 %fbs、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml) 内部環境室が 37 ° C に平衡します。画像は 5 分ごとに収集されました。映画は 15 フレーム/秒してくださいここをクリックして、このビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ図 2: 70 kPa 基板上 HMEC 1 細胞膜 (フェーズ) を介して細胞内 Lm (赤のチャネル) の普及がシードします。リーボビッツの L-15 メディアでセルをイメージしました (10 %fbs、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml) 内部環境チャンバー平衡を 37 ° C画像は 5 分ごとに収集されました。映画は 15 フレーム/秒してくださいここをクリックして、このビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| ヤング率 (E, kPa) | (株式 40%) からアクリルアミド % | (株式 2%) から Bisacrylamide % |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
テーブル 1。さまざまな剛性のポリアクリルアミド (PA) ゲル組成します。この表の株式 40% アクリルアミド溶液の割合との割合在庫 2% ビス アクリルアミド溶液与えられた剛性 (ヤング係数, E) を達成するために別の列に示されています。
補足資料 1。計算された牽引ストレスから細胞内張力の計算。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
細胞はさまざまな細胞の形態だけでなく、その遺伝子発現および蛋白質活動、重要な細胞機能および動作45,46に影響を与えることができる影響を与える物理的環境手がかりを感じることができます。セルの ECM の剛性は、細胞運動、分化、増殖、および最終的に細胞の運命47,48,49の重要な変調器としてますます感謝です。細胞とその ECM の複雑な生体力学的相互作用を理解することの多くの最近の進歩をされているが、どのように環境剛性について細菌感染に対する細胞の感受性に影響を与える少し知られています。このような調査を促進する、感染症の試金50で互換性が可変剛性のポリアクリルアミド ゲルの老舗作製に基づいてこの小説ウェル アッセイを開発しました。伝統的に、ガラスや約 1 3 桁が最も付着性細胞8,51自然 ECM より硬めは、ポリスチレンの表面上の組織培養細胞の細菌感染を研究されています。ここで説明アッセイは、関連する生理学的環境剛性政権における細菌ホスト相互作用の研究を有効にする新しい高速道路を開きます。
提示されたアッセイのコンセプトの証明の HMEC 1 細胞モデル付着性宿主細胞と Lm モデルの細菌の病原体として選ばれました。ただし、適切に変更された場合は、アッセイをさらなる研究に対して拡張できます。このような研究は、細菌やウイルスなどを含むその他の病原体によって異なる哺乳類付着性宿主細胞の種類の感染症を含むことができます。この特定のアッセイ ゲル蛋白質 - でコーティングしたコラーゲンは、ホスト細胞の種類に応じてそれはヒドロゲルへの関心の宿主細胞の付着を容易にするために異なる ECM タンパク質-コーティング、フィブロネクチン、ラミニンなどを使用すること52。 ホスト セルの種類に依存する追加の考慮事項が検討するハイドロゲル剛性範囲。剛性の範囲に決まるべきである何が特定のホスト セルの型に関連する生理学的、どれだけをホストする接続与えられた剛性ハイドロゲル.に単分子層を形成同様に、検討する必要に応じて、モデル病原体によってわずかな変更は記載感染試験に実装する必要があります。
製造ポリアクリルアミド ゲル24,50,53にある特定の特徴のための以前の方法と比較して試金の技術革新は、提案された感染症法に統合。まず、マルチもガラスの底板を同時に複数の条件のスクリーニングを可能にするだけでなく、特定の手順の自動化、ゲルが構築されます。これはしばしば変更同時にまたは複数の複製は非常に重要ですのでこのようなアプローチの結果は、ホスト細胞の通路と追加のホストに感染する細菌の正確な数などの要因によって影響される可能性が調べることで複数の条件を監視、間の独立した実験。このアッセイのユニークな特徴は、ゲルがある従来の顕微鏡を使用してのイメージを十分に薄い高さ約 40 μ m のこと。我々 は、我々 は、両方の生細胞顕微鏡検査およびセル固定および高いバック グラウンド蛍光を導入することがなくイメージング、続いて免疫染色に正常に実行できますを示した。最後に、ゲルは、蛍光マイクロ ビーズ、単一の焦点平面に閉じ込められた埋込アッパーの 1 つで、2 つの層から成っています。この属性は、アウト フォーカスの光イメージング中に干渉することがないことを保証します。ビーズの存在により、制服が、TFM と MSM の24,32,41のパフォーマンスが向上を確保するためゲルの表面地形学です。TFM と MSM、それぞれ可変剛性マトリックスに存在する細胞の細胞外マトリクスと細胞の力を計算することが可能です。この小説の試金を使用して、環境の剛性と感染症の両方の貢献を同時に比較することによって物理的な力のような測定をすることが可能です。次のようなアプローチ、効果感染は、宿主細胞そのコースを通して力学を定めることができます。また、細胞の細胞内ストレスの進化は MSM を使用して計算することができます、単層の障壁の完全性の測定として使用することができます。最後に、アッセイのウェルの性質を考えると、それはより多くの深さでホスト細胞力学と感染症との間の複雑な相互作用を調査するため、細菌感染症の薬理学的および遺伝的摂動を同時に導入することが可能。
細胞の増殖速度に及ぼす基板の剛性にある技術の固有の制限の 1 つがあります。通常、感染症法では、異なる条件下でホストの細胞密度が同じであることを確認する必要があります。単独で細胞密度があります感染ホストの感受性に影響を及ぼすためにです。宿主細胞として使用された HMEC 1 セル、ゲル上の 24 h のとき自分の番号の差が表示されません。ただし、異なる種類の細胞は差分の増殖、感染症研究をバイアスすることがでくハイドロゲル剛性によってを発生可能性があります。同様に、感染のバイアスが生じるときセル単分子膜を形成しないまたはゲル、特定の細胞のタイプは非常に柔らかい行列 (例えば、ひと臍帯血管内皮細胞やマディン-ダービー犬腎臓に播かれるときに発生するにも接続しないでください。上皮細胞は 0.6 kPa ヒドロゲル54,55でシードします。)ある特定の細菌 (例えば、ボレリア burdgorferi) に接続できる病原体に関する限りでは、宿主が彼らを侵略、それらを介しても生まれ変わることができます56。この試金は病原体の輪廻の研究、仕事だろうが、57を正常に機能する好中球 PA ヒドロゲルでシード内皮細胞細胞に関する過去の研究をされているので、それは可能と思われる場合我々 はまだ未テストします。アクリルアミドと bis アクリルアミド24,25,26 の適切な濃度を混合することによって与えられたヤングのポリアクリルアミド ゲルを製造する方法を示す調査の多くがずっとあります。 ,27。しかし、1 つの様々 な剛性のヒドロゲルに存在する細胞の TFM 実験を実行する欲望、特にとき、AFM または他のインデント技術58を通じてヒドロゲルの予想の剛性を確認する重要です。使用される各種の溶媒や高齢アクリルアミド原液、期待値からのわずかな偏差が発生する可能性や方法の原子間力顕微鏡による測定が実行される (例えば、原子間力顕微鏡の先端の形状)。最後に、ここに提示されたアプローチより現実的な生理学的関連性の高い 3 D のシナリオとは異なる 2次元行列に宿主細胞を播種に基づいています。ただし、可変剛性を有する 3 D ゲルを製造、宿主細胞とそれらをシードとし、病原体に感染するにはまだ、特定の技術的な問題が包含します。それにもかかわらず、我々 は、近い将来に我々 ことができる 3 D の設定で感染症を研究するため現在のアッセイを拡張するを予測します。
要するに、予備的な結果とともに記載されている治験はこの新規アッセイが定量的方法より多くの病原性細菌の付着菌の感染を研究するための非常に有用なツールになることを証拠を提供します。以前調べたより生理学的環境。光顕、続いて提案セットアップにおけるヒドロゲルあるアッセイ フローサイトメトリー、免疫染色などの複数の手法のパフォーマンスと互換性のあるポリアクリルアミドの加工力と牽引力顕微鏡。両方、病原体は、ホストを感染させる戦略を解くのとの開発を促進する上で重要な影響を及ぼすだろうと見込んで、病原体によって異なる付着性ホスト細胞の種類の感染症を含む研究のアッセイを使用ことができます。感染症に対する治療的介入は。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
誠に感謝フッター、r. Lamason、m. Rengaranjan、議論の実験的なサポート ・ テリオ研究室のメンバー。この作品は、高度な研究 (F.E.O.)、スタンフォード大学院フェローシップ (F.E.O.) アメリカ心臓協会 (E.E.B.) に NIH R01AI036929 (J.A.T.)、ハワード ヒューズ (J.A.T.)、ハワード ヒューズ ギリアム交わりによって支えられました。フローサイトメトリーは、スタンフォード共有 FACS 施設で行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
| 25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
| 40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
| Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
| Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
| TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
| Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
| Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
| HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
| Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
| Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
| Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
| DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
| Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
| Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
| BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
| Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
| 0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
| COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
| Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
| Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
| MES powder | Sigma | M3885 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
| MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
| EGTA | Acros | 40991 | |
| Disposable lab equipment | |||
| 12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
| 5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| 15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
| Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
| Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
| Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
| Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
| Razors | VWR | 55411-050 | |
| Syringe needle | BD | 305167 | |
| 0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| 20 ml syringes | BD | 302830 | |
| 0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
| Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
| Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
| Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
| Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
| Cage Incubator | Haison | Custom | |
| Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
| Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
| Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
| pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
| forceps | FST | 11000-12 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
| Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
| Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
| Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
| Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
| Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
| Software | |||
| Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
| Matlab | Matlab Inc | ||
| Flowjo | FlowJo, LLC | ||
| Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
- Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
- Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
- Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
- LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
- Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
- El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
- Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
- Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
- Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
- Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
- Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
- Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
- Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
- Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
- Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
- Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
- Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
- Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
- del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
- Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
- Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
- Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
- Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
- Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
- Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
- Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
- Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
- Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
- Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
- Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
- Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
- Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
- Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
- Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
- Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
- Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).
