Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

L’objectif global de cette méthodologie est de permettre la caractérisation de l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’infection bactérienne des cellules adhérentes de manière hautement quantitative. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine émergent de la biomécanique hôte-pathogène, comme le rôle des forces mécaniques dans la modulation de la susceptibilité aux infections bactériennes des cellules hôtes. Cette technique permet de créer des séquences vidéo en accéléré haute résolution tout en filtrant simultanément plusieurs conditions et en automatisant certaines procédures.

Pour effectuer l’activation du verre des plats à 24 puits, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde de sodium tumalo par puits de 13 millimètres de diamètre et incubez les plaques à température ambiante pendant une heure. Jetez l’hydroxyde de sodium et utilisez de l’eau ultra-pure pour rincer les puits une fois. Ajoutez ensuite 500 microlitres de triéthoxysilane à 2 % dans de l’éthanol à 95 % dans chaque puits et incuberez-les pendant cinq minutes.

Avec de l’eau, rincez les puits une fois. Ajoutez ensuite 500 microlitres de glutaraldéhyde à 0,5 % dans chaque puits et incubez les plaques pendant 30 minutes. Après avoir rincé une fois à l’eau, séchez les plaques à 60 degrés Celsius avec le couvercle retiré.

Pour fabriquer des hydrogels à rigidité réglable, préparez des solutions aqueuses contenant de 3 à 10 % d’une solution d’acrylamide à 40 % et de 06 à 6 % d’une solution de bis-acrylamide à deux %, selon la rigidité souhaitée de l’hydrogel. Après cela, ajoutez l’eau. Pour chaque rigidité, la solution un est sans billes, tandis que la solution deux contient 03 % de microbilles fluorescentes de 0,1 micromètre.

Dégazez les solutions un et deux sous vide pendant 15 minutes pour éliminer l’oxygène qui inhibera la polymérisation. Ensuite, tout en agissant rapidement, ajoutez 0,43 % de TEMED et 0,6 % de la solution mère APS de 10 grammes par millilitre à la première solution. Ajoutez 3,6 microlitres de la solution au centre de chaque puits de la parabole à 24 puits.

Utilisez immédiatement des lamelles circulaires de 12 millimètres pour couvrir les puits et laissez reposer la solution pendant 20 minutes afin qu’elle polymérise complètement. Tapotez doucement l’aiguille d’une seringue sur une surface dure pour créer un petit crochet à son extrémité afin de faciliter le retrait des lamelles, puis utilisez l’aiguille pour soulever les lamelles. Ensuite, ajoutez 0,43 % de TEMED et 0,6 % de la solution mère APS de 10 grammes par millilitre à la deuxième solution.

Déposez ensuite 2,4 microlitres du mélange sur les lamelles circulaires de 12 millimètres. Placez les lamelles circulaires avec une goutte de Solution Deux sur la première couche de polyacrylamide et utilisez une pince pour appuyer doucement vers le bas pour vous assurer que l’épaisseur de la deuxième couche est minimale. Laissez ensuite la solution deux polymériser pendant 20 minutes.

Ajoutez 500 microlitres de HEPES 50 millimolaires pH 7,5 dans chacun des puits et utilisez l’aiguille de la seringue et la pince pour retirer les lamelles du verre. Pour stériliser les hydrogels, placez-les dans une hotte de culture tissulaire et exposez-les aux UV pendant une heure. Maintenant, préparez un mélange de 0,5 % en poids par volume de Sulfo-SANPAH et d’un pour cent de DMSO et de 50 millimolaires HEPES pH 7,5.

Ajoutez 200 microlitres de la solution sur la surface supérieure des hydrogels. Ensuite, en travaillant rapidement, exposez-les à 302 nanomètres UV pendant 10 minutes pour les activer. Utilisez un millilitre de HEPES pH 7,5 de 50 millimolaires pour laver les hydrogels deux fois, en répétant si nécessaire pour éliminer tout excès de réticulant.

Enrobez les hydrogels de protéines avec 200 microlitres de collagène de queue de rat I de 0,25 milligramme par millilitre et 50 millimolaires HEPES. Incuber les hydrogels avec le collagène à température ambiante pendant la nuit. Avant d’ensemencer les cellules d’intérêt sur les hydrogels, ajoutez un millilitre de milieu et équilibrez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pour ensemencer des cellules endothéliales microvasculaires humaines, après avoir cultivé et préparé une suspension cellulaire selon le protocole de texte, retirez le milieu des hydrogels, puis ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits. Après avoir préparé une culture nocturne de L. monocytogenes selon le protocole textuel, transférez un millilitre de la culture dans un tube de microcentrifugation et faites-le tourner à 2 000 fois g à température ambiante pendant quatre minutes. Après avoir utilisé du PBS de qualité culture tissulaire pour laver la pastille deux fois, utilisez un millilitre de PBS pour remettre la pastille en suspension.

Préparez le mélange infectieux en combinant 10 ou 50 microlitres de suspension bactérienne avec un millilitre de milieu complet MCDB 131 pour une multiplicité d’infection, ou MOI, d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par cellule hôte. Retirez le milieu des puits des plaques de 24 puits en prenant soin de ne pas perturber les hydrogels ou les cellules. Utilisez un millilitre de MCDB 131 pour laver les cellules une fois, puis ajoutez un millilitre de bactéries dans chaque puits.

Placez le couvercle sur les assiettes et enveloppez-les d’un film alimentaire en polyéthylène pour éviter les fuites. Centrifugez les plaques à 2 000 fois g pendant 10 minutes pour synchroniser l’invasion, puis incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Avec le milieu complet MCDB 131, lavez les échantillons quatre fois et renvoyez-les dans l’incubateur de culture tissulaire.

Après 30 minutes supplémentaires, remplacez le milieu par du milieu complet MCDB 131 complété par 20 microgrammes par millilitre de gentamicine. Pour effectuer une cytométrie en flux, huit heures après l’infection, retirez le milieu des puits de la plaque à 24 puits et utilisez la culture tissulaire PBS pour laver les puits une fois. Après l’élimination du PBS, ajoutez 200 microlitres de mélange de trypsine EDTA collagénase dans chaque puits.

Placez la boîte dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes pour permettre le détachement complet des cellules. Après avoir pipeté doucement chaque puits huit fois, ajoutez 200 microlitres de milieu complet pour neutraliser la trypsine. Transférez les 400 microlitres de solution cellulaire de chaque puits dans un tube en polystyrène de cinq millilitres avec un capuchon de crépine de 35 micromètres.

Analysez les échantillons par cytométrie en flux. Après avoir ensemencer des cellules HMEC-1 sur des hydrogels de Pa et les avoir traitées avec de la gentamicine conformément au protocole de texte, incubez la plaque pendant cinq heures pour permettre au promoteur ActA de s’activer et de piloter l’expression du cadre de lecture ouvert mTagRFP. Quatre heures après l’infection, mélangez un microlitre d’un milligramme par millilitre de colorant Hoechst avec un millilitre de milieu complet L-15 et ajoutez-le à chaque puits pour colorer les noyaux.

Après avoir incubé les cellules pendant 10 minutes, remplacez le milieu par un millilitre de milieu complet L-15 complété par 20 microgrammes par millilitre de gentamicine. Imagez plusieurs positions toutes les cinq minutes à l’aide d’une fonction de mise au point automatique pour surveiller la propagation des bactéries LM à travers les monocouches HMEC-1 ensemencées sur des hydrogels de rigidité variable. Comme indiqué dans ce graphique, des mesures AFM ont été effectuées pour confirmer la rigidité exacte des hydrogels de Pa préparés à l’aide du protocole de cette vidéo.

Ici, des cellules HMEC-1 sur des matrices de rigidité différente ont été infectées par une souche LM qui exprime un marqueur fluorescent après internalisation qui ne permet que la détection de bactéries intracellulaires. Les cellules ont été contrôlées à l’aide du diagramme de dispersion vers l’avant et vers l’arrière, et une deuxième étape de déclenchement a exclu les cellules qui présentaient une autofluorescence. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que l’infection par LM était environ deux fois plus importante sur les hydrogels rigides de 70 kilopascals que sur les hydrogels de 0,6 kilopascal.

Pour tester si l’augmentation de l’adhésion du LM sur le HMEC-1, l’augmentation de l’invasion du LM dans le HMEC-1, ou les deux, étaient responsables de la susceptibilité accrue à l’infection peu de temps après l’infection par le LM exprimant constitutivement la GFP, les cellules HMEC-1 ont été fixées et les bactéries adhérentes ont été colorées avec des anticorps. Comme le montre ici, il y avait beaucoup plus de bactéries adhérant à HMEC-1 lorsque les cellules hôtes résident sur des gélules rigides par rapport aux gélules. Conformément aux données de cytométrie en flux, il y a beaucoup plus de bactéries internalisées par HMEC-1 lorsque les cellules hôtes résident sur des gélules rigides par rapport aux gélules.

Une fois maîtrisé, ce test peut être effectué en trois jours environ, car de longues étapes d’incubation sont nécessaires entre les deux. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être aussi stérile que possible pour s’assurer que les hydrogels et les cellules hôtes sont exempts de contamination. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie à force atomique peuvent également être incorporées pour répondre à des questions telles que comment la rigidité des cellules hôtes change-t-elle lors de l’infection et si cet effet dépend de la rigidité de la matrice.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mécanobiologie pour explorer le rôle des interactions biomécaniques des agents pathogènes de la cellule hôte en utilisant différentes cellules hôtes, telles que les cellules épithéliales, et différents agents pathogènes bactériens, tels que Rickettsia parkeri. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’hydrogels de rigidité réglable sur des plaques à plusieurs puits et de la façon d’effectuer le test d’infection. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes peut être dangereux.

Par conséquent, des précautions, telles que l’insertion de barrières entre le site d’entrée et l’agent pathogène, ainsi que la prévention de la génération d’aérosols, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.