Summary
Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.
Abstract
Descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção como um modelo geral para avaliação não invasiva da angiogênese. O modelo também é relevante para o direcionamento de glaucoma neovascular, uma visão ameaçadora complicação da retinopatia diabética. Este método baseia-se na indução da resposta vascular de íris por uma série de furos da Úvea autovedante em camundongos BALB/c e aproveita a maturação pós-parto da vasculatura ocular do mouse. Filhotes de rato passam por punções da Úvea do dia pós-natal 12.5, quando os filhotes naturalmente abrirem seus olhos, até o dia pós-natal 24,5. Devido a transparência da córnea, vasculatura íris pode ser analisada facilmente através do tempo por métodos não invasivos na vivo . Além disso, a íris semitransparente de camundongos BALB/c pode ser flatmounted para immunohistologic detalhada análise com coloração de fundo mínimo de não-específica. Neste modelo, angiogênese é impulsionado principalmente pela inflamatória e plasminogênio Ativando sistemas. O modelo induzida por punção é o primeiro para induzir a neovascularização da íris em pequenos roedores e tem a vantagem de permitir a análise directa não invasivo na vivo do processo angiogênico. Além disso, o modelo pode ser combinado com substâncias modulando angiogênico, que destaca seu potencial no estudo da angiogênese com uma perspectiva na vivo .
Introduction
A íris, juntamente com o corpo ciliar e a coroide, compreende a Úvea, que é o tecido mais vascularizado do olho. Vasculatura Iris é essencial na manutenção da homeostase na câmara anterior do olho. Como resultado de abundantes conexões anastomótica entre artérias e veias, os vasos sanguíneos de íris fornecer nutrientes e o suprimento de oxigênio não só a íris em si, mas o todo segmento anterior do olho1.
A formação de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese de pre-existentes, é fundamental em processos fisiológicos, tais como desenvolvimento e2de cicatrização de feridas. Angiogênese é finamente regulada por uma multiplicidade de factores canônicas, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e inibidor de ativador de plasminogênio (PAI), bem como vários fatores inflamatórios, e um desequilíbrio desses fatores pode levar a patológica angiogênese3.
No olho, a neovascularização é a causa de doenças fatais vista, tais como a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e glaucoma neovascular (NVG). Nestas doenças oculares, a neovascularização focal geralmente está localizada em tecidos da retina, no entanto, o desequilíbrio em inflamatória e fatores angiogênico em ambos as anteriores e posteriores oculares câmaras do olho tem sido associada com rubeosis iridis, o termo clínico para íris neoangiogênese patológica4. Estas patologias indicam a capacidade da íris adulta submeter-se a angiogênese. Em camundongos, sistema vascular ocular é imaturo, após o nascimento e continua a maturação pós-parto. Esta peculiaridade do desenvolvimento é explorada no modelo do rato da retinopatia induzida pelo oxigênio, um modelo que imita pròxima o quadro clínico de retinopatia da prematuridade5. Além disso, angiogênese e inflamação desempenham um papel crucial em mecanismos6de cicatrização de feridas, e para ferir a cura em si tem sido associada a angiogênese modelos7.
Neste estudo, descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção. Da Úvea punções são realizadas perto do limite exterior do limbo, que induzem a neovascularização da íris por acionar a sistema de cicatrização de feridas. Devido a transparência da córnea, a vasculatura de íris pode ser analisado facilmente na vivo por métodos não-invasivos. Furado olhos apresentam um aumento do leito vascular na íris, que tem sido associada com um aumento da ativação do plasminogênio e marcadores inflamatórios8. O modelo apresentado tem um grande potencial como uma nova ferramenta para estudar a angiogênese e triagem angiogênico compostos e permite a visualização direta no vivo dos processos angiogênico.
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Protocol
Filhotes de rato BALB/c, de ambos os sexos foram utilizados em conformidade com a instrução para o uso de animais em oftalmológico e Vision Research, e os protocolos foram aprovados pela Comissão de Estocolmo para a ética Animal de investigação. Os ratos foram alojados em ninhadas, juntamente com a mãe que amamenta, com um ciclo de dia/noite de 12 h, livre acesso à comida e água e monitorados diariamente.
Nota: Para o procedimento cirúrgico, os ratos foram mantidos sob anestesia com isoflurano voláteis. Pomadas oculares são desencorajadas durante procedimentos oculares, como eles podem interferir com tratamentos e substâncias utilizadas. Se necessário, para evitar o olho seco, uma gota de solução salina normal estéril pode ser aplicada. Apesar da Úvea punções são self-healing, cuidado foi tomado durante punções da Úvea para garantir a esterilidade com instrumentos cirúrgicos. Tratamento pós-cirúrgico incluiu a hidratação com solução salina normal por via subcutânea e analgesia com a administração tópica ocular de cloridrato de tetracaína. Os filhotes foram autorizados a recuperar a prostração esternal sobre uma almofada de aquecimento antes de ser devolvido para a mãe que amamenta, em uma gaiola limpa. Ninhadas foram mantidas com a mesma mãe de enfermagem para evitar o estresse.
1. anestesia
- Prepare a câmara de indução de anestesia, para administrar o isoflurano anestésico e certifique-se de que uma máscara pequena do mouse também é acoplada.
Nota: Realize experimentos todos os animais de acordo com todas as licenças éticos aplicáveis. - Prefill câmara de indução com 3-4% de isoflurano voláteis no ar atmosférico.
Nota: Diferentes substâncias anestésicas que isoflurano podem ser utilizadas, de acordo com autorizações de éticas. Procedimentos anestésicos voláteis devem ser realizados uma campânula ventilada de banco ou emanações. - Coloca um filhote de rato BALB/c de 12,5-dias de idade pós-natal (P) na câmara de indução. Confirme que o aparelho de anestesia está pronto para entregar isoflurano para a câmara de indução.
Nota: Filhotes de rato são frágeis e melhor manipulado pela nuca. Manter os filhotes juntos como uma ninhada ou com a mãe de enfermagem para evitar o estresse. - Permitir que o filhote ser totalmente anestesiado.
- Delicadamente, pega o filhote de rato pela nuca.
Nota: Manter a câmara de indução fechada em todos os momentos para indução segura e estável. - Transferi o mouse para a máscara de roedor. Certifique-se de mudar o fluxo anestésico da câmara de indução para a máscara ao mover o mouse.
- Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a anestesia.
2. perfure o procedimento sob estereoscópio cirúrgico
- Posicione o mouse na posição lateral de prostração. Confirme que a máscara está bem posicionada para que o olho do rato é no campo de visão do estereoscópio.
- Assim que o olho está virada para cima em direção ao estereoscópio, Rode suavemente a cabeça de rato.
Nota: O foco claro do olho deve ser alcançado sob o estereoscópio. Posicionamento, é recomendável uma ampliação de 16x, enquanto 40 X deve ser usado para realizar o procedimento cirúrgico. Se ética autorizações permitem, aparar a ponta dos bigodes pode facilitar a visualização do olho. - Usando pequenas pinças subordinante, cuidadosamente se projetam olho do filhote aplicando uma pressão para baixo para as pálpebras, dorsais e ventrais ao olho.
- Segure um suave mas firme da tampa do olho do filhote, com pequenas pinças.
Nota: Recomenda-se realizar a protusão do olho e tampa segurando com a mão não dominante, como a mão dominante deve executar o procedimento de punção. - Use o estereoscópio para localizar ao limbo da córnea. Limbo de Albino BALB/c pode ser facilmente identificado, o plexo vascular circular posterior da córnea.
- Com uma agulha chanfrada de diâmetro (30 G) de 0,25 mm, realize uma pequena punção da Úvea, perto do limite de estroma posterior da Úvea. Use apenas a ponta da agulha, e não mais da metade do bisel (equivalente a 0,5 mm), punção da Úvea. Se executado corretamente, os furos da Úvea são auto-selante, ainda injeção intra-ocular de substâncias de estudo pode ser administrada através do mesmo ferimento.
Nota: Se experimentou com anatomia ocular do mouse, a punção da Úvea é executada entre o corpo ciliar e ora serrata. Deve ter cuidado ao executar a punção da Úvea para evitar a ruptura da lente. - Realize a punção da Úvea segunda no site do oposto do olho do primeiro local de punção. Otimizar a distância e a posição das punções; Considere o 12 e punções de 06:00, com 12:00 sendo tão dorsal quanto possível.
- Repita o procedimento de punções da Úvea em quatro dias até P24.5. Antes de cada punção da Úvea sucessiva, monitore animais status especial atenção à presença da catarata traumática devido a dano da lente durante a punção da Úvea, ou pressão ocular diminuição óbvia. Aponte para executar punções repetição às mesmas posições como punções anteriores para efeitos de ideais.
3. não-invasiva na Vivo de monitoramento
- Antes da punção ou injeções em cada dia experimental, anestesia o mouse como realizada acima.
- Com o mouse na posição lateral de prostração, projetam-se suavemente o olho.
- Concentre-se na vasculatura de íris com o estereoscópio cirúrgico.
- Tire uma foto da vasculatura íris com uma câmera equipada para o estereoscópio cirúrgico.
Nota: Apesar de não haver necessidade, induzindo a meiose pode ser útil para normalizar a área de íris por animal. Considere éticas licenças quando selecionando um agente indutor de meiose. Cuidado foco da vasculatura íris facilitará ainda mais a análise quantitativa. Recomenda-se uma magnitude de 40 X.
4. no pós-operatório cuidados
- Remover o filhote BALB/c da máscara de roedores e suavemente, transferi-lo para uma almofada de aquecimento em camadas com uma esteira cirúrgica.
- Aplique uma gota de solução de tetracaína 1% aos olhos perfurados.
Nota: Outras soluções analgésicas podem ser usadas, de acordo com autorizações de éticas. - Hidrate o animal com uma injeção subcutânea de 200 µ l de solução salina normal estéril.
- Retorne o filhote para a mãe que amamenta em uma gaiola limpa do mouse.
- Monitore o processo de recuperação. O filhote deve ser capaz de deambulate e voltar para a maca.
5. olho Enucleação
- Eutanásia do animal por deslocamento cervical. Execute Enucleação e dissecação sob um estereoscópio para melhor visualização do procedimento.
Nota: Os procedimentos de eutanásia diferentes podem ser usados. Recomenda-se a aderir às autorizações de éticas. - Separe as pálpebras para melhorar a exposição aos olhos.
- Fazer um pequeno corte (cerca de 0,5 cm) perto do canto do olho das pálpebras com uma tesoura de olho Bonn curva.
- Use o espaço periocular expostas para inserir micro fórceps subordinante atrás (do globo sob) na órbita.
- Pegue o tecido circundante do olho e puxe delicadamente para cima. Evitar a exploração sobre o globo ocular, usar os tecidos circundantes mais próximo ao soquete do olho.
- Inserir a tesoura de olho Bonn curva atrás do globo do olho na órbita.
- Corte os tecidos circundantes, até que o olho é liberado do soquete.
Nota: Esta técnica de dissecação mantém a anatomia do olho e beneficia a análise subsequente. - Proceda à remoção do tecido externos do olho. A remoção de tecido estranho pode ser executada após a fixação, se preferirem.
Nota: Camundongos BALB/c são melanina deficiente, portanto, para aumentar o contraste, é recomendado um fundo escuro para facilitar o processo de dissecação. - Brevemente enxaguar o olho inteiro em uma placa de Petri preenchida com solução salina tampão fosfato (PBS).
- Transfira o olho para um tubo de 2 mL contendo 1,5 mL de solução de formol tamponado de 4%.
- Fixar o olho durante 6 h à temperatura ambiente.
Nota: Fixação confere a rigidez do tecido e facilita a dissecação da íris. Tempo de fixação deve ser testado e ajustado para diferentes aplicações.
6. Iris dissecação procedimento sob estereoscópio
- Remover a solução fixador do tubo com uma pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (ou similar) e enxágue os olhos três vezes com PBS fresco.
- Coloque o olho fixo em uma superfície lisa seca (carrinho de dissecação) com câmara anterior voltado para cima.
- Com uma agulha 30G chanfrada, realize um ponto de entrada posterior ao limbo.
- Segurando o segmento anterior com pequenas pinças subordinante, insira uma ponta do Clayman-Vannas para reta na abertura criada anteriormente.
Nota: Recomenda-se controlar a pinça com a mão não dominante e a tesoura com o dominante. - Enquanto roda o olho com a pinça subordinante, corte em torno ao limbo para remover o segmento posterior do olho.
Nota: Efectuar cortes parciais permitirá a ponta interna da tesoura para continuar no tecido e grandemente facilita o processo. - Posicione o segmento anterior voltada para baixo, expondo a lente.
- Remova a lente cuidadosamente agarrando-o com pequenas pinças e puxando para cima.
Nota: Uma agulha chanfrada pode ser usada para perfurar e puxe a lente. - Posicione o segmento anterior com a córnea virado para baixo e o corte perpendicular ao campo de visão.
- Pegue delicadamente o tecido posterior ao corpo ciliar com a pequena pinça subordinante.
- Com uma tesoura reta Clayman-Vannas, prosseguir para aparar só anterior do corpo ciliar para remover a malha trabecular e isolar a íris. Confirmar que a malha trabecular é removida; a íris deve mover-se dentro da córnea.
- Transferi com cuidado a viseira anterior com a pinça subordinante pequena, mantendo a córnea, a uma placa de 96 poços contendo 200 µ l de PBS.
- Continue a manter a córnea no poço e dissecar a íris por lavagem com PBS com uma pipeta.
Nota: Se o aderente de restos de íris para a córnea, uma malha trabecular pode estar presente e o bisel da agulha 30G pode ser usado para ajudar a deslocar a íris. - Retire o 96 poços com a pequena pinça subordinante da córnea e manter a íris isolada no poço para uma análise mais aprofundada.
- Armazenar amostras flutuantes íris a 4 ° C.
Nota: Apesar de ser corrigido, armazenamento a longo prazo das amostras flutuantes íris não é recomendado.
7. possíveis leituras experimentais
- Para visualizar os vasos sanguíneos em íris dissecados, use toda a montagem flutuante imuno-histoquímica coloração métodos para marcadores como a molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (PECAM) -1 ou isolectin B4. Como alternativa, use perfusão de todo o corpo com manchas vasculares, tais como dextranos fluorescente-etiquetadas alto peso molecular.
- Use na vivo não invasiva imagens para realizar em silico plana-montagem e quantificar a vasculatura íris completo com software de imagem apropriado.
Nota: O sistema vascular pode ser quantificada, tanto in vivo e em vitro, utilizando densitometria ou com vasculatura análise software9. - O processo todo globo ocular para ácidos nucleicos e extração da proteína, seguido por métodos PCR ou immunoblotting, realizar a análise molecular dos olhos perfurados.
Nota: Análise Molecular dos tecidos é melhor executada com tecido não fixa, mas dissecação da íris não fixa é extremamente desafiador, e o uso do olho todo tem processado resultados estatisticamente significativos em anteriores estudos8.
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Representative Results
Filhotes de rato Albino BALB/c em p 12.5 foram submetidas a punções da Úvea, repetidas cada quarto dia (experimental dia 0, 4, 8, 12), até P24.5. Em P27.5, os ratos foram sacrificados e íris cuidadosamente dissecado (experimental dia 15). Fotos de olhos de rato foram tiradas com uma câmera acoplada a um estereoscópio cirúrgico antes de cada série de punção em cada dia experimental para avaliar a avaliação não invasiva da resposta vascular íris. Punções da Úvea induzem uma resposta vascular da íris, provocando a ferida que cura o sistema (Figura 1). Devido a transparência da córnea e camundongos BALB/c de melanina deficiente, aumento de íris vasculatura é facilmente visível de dia experimental 4 (P16.5) e se intensifica durante toda a duração do protocolo. Imagens de imuno-histoquímica para PECAM-1 denotam um aumento na vascularização geral na íris dos olhos perfurados em comparação aos controles (Figura 2).
Figura 1: monitorização não invasiva da angiogênese induzida por punção íris. Imagens representativas do dia 0, 4, 8, 12 e 15 do controle e olhos perfurados. Resposta vascular Iris é evidente a partir do 4º dia em diante nos olhos perfurados. Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resposta vascular de Iris nos olhos induzida por punção. Imagens ilustrativas de PECAM-1 coloração da 15 íris dia, exibido como visão completa e ampliada área (quadrada), de controle e furou os olhos. Barra de escala = 400 µm (topo); 200 µm (parte inferior). Observe o aumento das ramificações vasculares na íris perfuradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente protocolo, é apresentado um novo método para a indução da resposta vascular de íris por punção da Úvea. A punção desencadeia mecanismos de cura ferida e promove respostas vasculares na íris10,11. Isto está de acordo com patologias oculares, tais como o PDR e NVG, onde respostas angiogênico exacerbada da retina no segmento posterior do olho culminaram com o quadro clínico da rubeosis iridis, uma aumento de vascularização da íris12 ,13.
A córnea é avascular e possui uma estrutura peculiar colágeno resultando em transparência. Dessa forma, angiografia do segmento anterior do olho para visualização da vasculatura íris é alcançável pela visualização direta de vasos sanguíneos de íris com vivo métodos não-invasivos13,e14. Anteriores modelos animais de neovascularização íris baseou-se em animais grandes olhos onde complexas intervenções cirúrgicas foram realizadas15,16,17, ou por injeção intra-ocular de substâncias específicas angiogênico 18 , 19. neste método, o uso de ratos BALB/c deficientes pigmento permite observação direta do íris vasculatura na vivoe permite a quantificação não-invasiva de neovascularização da íris em camundongos, proporcionando assim uma nova ferramenta para estudar vivo em angiogênese.
Além disso, o método apresentado para dissecação de íris do mouse permite a análise de neovascularização íris induzida por punção com marcadores específicos vasculares. Aqui, íris navios illustratively foram corados com PECAM-1 anticorpos e visualizados por microscopia de fluorescência. Protocolos de imunocoloração flutuantes, toda a montagem são facilmente alcançados e bastante rotineira. Além disso, métodos de perfusão para os vasos sanguíneos podem ser executados neste modelo. Coloração específica vascular concede a avaliação da estrutura dos vasos sanguíneos de íris e, assim, a quantificação, do usuário-baseado ou software de análise, da íris neovasculature9. Como descrito anteriormente8,20, a ilustração da íris neovasculature foi avaliada no dia 15 pós-puncture-indução. No entanto, efeitos na vascularização da íris podem ser observados logo em dia 4 post-puncture-indução, sugerindo que a avaliação do modelo de neovascularização íris induzida por punção poderia realizar-se em pontos de tempo diferentes, com base em específico requisitos de experimentais.
Vale ressaltar ao estado que este protocolo apresenta alguns desafios, especialmente relacionados com o tamanho de um olhos de ratos em relação ao outro modelo animal. Extremo cuidado deve ser tomado ao executar o procedimento de punção da Úvea, para evitar toques de lente ou danos aos olhos. Observação da condição ocular é paramount e animais exibindo catarata relacionada à experimental ou queda na pressão ocular deve ser excluída e sacrificada adequadamente. Íris de mouse são extremamente frágeis e um pouco brega. Adequada dissecção e o isolamento do tecido apresenta mais um passo crítico para o protocolo. Uma correta separação da malha trabecular é necessária para o deslocamento da íris de câmara anterior. Além disso, devido à fragilidade, isolamento da íris requer fixação do tecido, que prejudica a análise molecular a jusante. No entanto, uma análise molecular de todo não fixada-olhos foi aplicada com sucesso para o método apresentado8.
Em resumo, o protocolo descrito apresenta um modelo de mouse de neovascularização íris romance induzida por punção. Este modelo tem a vantagem de permitir na vivo não invasiva visualização directa da angiogênese. Além disso, o uso de pequenos roedores processa o modelo apresentado atraente para estudos de rubeosis iridis, pois evita a utilização de animais de grandes olhos e acompanhado de restrições éticas. Além disso, o procedimento pode ser combinado com injeção de substâncias pro - ou antiangiogênico através da punção Auto-selante, realçando sua utilidade como um novo modelo de angiogênese na vivo .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Obrigado Linnea Tankred e Diana Rydholm para criação de animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn eye scissors | Bausch & Lomb | 23060 | |
| Clayman-Vannas curved scissors | Bausch & Lomb | E3383 C | |
| Clayman-Vannas straight scissors | Bausch & Lomb | E3383 S | |
| Objective adapter for camera | Handcrafted | N/A | Or any system that allows adapting a camera to the microscope |
| Heating Pad 100-110 watts | Non Applicable | N/A | Available in pet/veterinarian stores |
| Hypodermic 30g beveled needle | KDM GmBH germany | 911914 | |
| Iphone 4S | Apple | Non Applicable | Or other high resolution image acquistion device |
| Isoflurane | Baxter | KDG 9623 | |
| McPherson tying forceps | Bausch & Lomb | E1815 S | |
| Micro tying forceps | Bausch & Lomb | 63140 | |
| Minims tetracaine hydrochloride | Bausch & Lomb | N/A | 1 % (w/v) Eye Drops |
| Neutral-buffered formalin | Bioreagens | 0018-40 | |
| Normal saline solution | Fresenius Kabi | 210352 | 0.9 % (w/v) NaCl in injectable water |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | Balanced and buffered PBS pH 7.4 |
| Petri dish 10 cm | Starstedt | 83.3902 | |
| Petri dish 3 cm | Starstedt | 83.3900 | |
| Safe Seal Tube 2.0 mL | Starstedt | 72.685.200 | Or any eppendorf style tubes |
| TC plate 96-well | Starstedt | 83.3924 | |
| Transfer pipette 3.5 mL | Starstedt | 86.1171 | Or any other Pasteur pipette style |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor Limited | N/A | Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia |
| Wild M650 surgical microscope | Wild Heerbrugg | N/A | Or other surgical or magnifying stereoscope |
References
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