Summary
Tumor-buscando terapêuticas tronco células mesenquimais (MSCs) mostram a promessa como um tratamento para glioblastoma invasiva. Transplante de ideal envolve entrega de MSCs na cavidade de ressecção do tumor em andaimes. Aqui, pré-clínicos técnicas para estudar o tratamento de MSC do glioblastoma são fornecidas incluindo: ressecção de tumor guiada por imagem; implantação do MSC-semeado andaimes; e terapia pós-operatória de rastreamento.
Abstract
Glioblastoma (GBM), o câncer de cérebro primária mais comum e agressivo, carrega uma expectativa de vida de 12 a 15 meses. A expectativa de vida baixa é devida em parte à incapacidade do tratamento atual, que consiste da ressecção cirúrgica seguida de radioterapia e quimioterapia, para eliminar focos de tumor invasivo. Tratamento destes focos pode ser melhorado com tumoricidal humana células tronco mesenquimais (MSCs). MSCs apresentam tropismo tumor potente e podem ser projetados para expressar terapêuticas proteínas que matam células tumorais. Avanços em modelos pré-clínicos indicam que a ressecção cirúrgica induz a perda prematura da MSC e reduz o efeito terapêutico. Eficácia do tratamento de MSC pode ser melhorada por semeadura MSCs em um andaime biodegradável poly(lactic acid) (PLA). Entrega MSC na cavidade de ressecção cirúrgica em um andaime PLA restaura célula retenção, persistência e matança de tumor. Para estudar os efeitos da implantação de PLA MSC-semeado na GBM, é necessário um modelo preciso pré-clínicos. Aqui nós fornecemos um pré-clínicos protocolo cirúrgico para ressecção do tumor guiada por imagem de GBM em camundongos imune deficiente seguido pela implantação de andaime MSC-semeado. MSCs são projetados com construções Lentivirus constitutivamente expressa e secretam ligante de indução de apoptose de TNFa-relacionados de terapêutica (pista), bem como a proteína verde fluorescente (GFP) para permitir o rastreamento fluorescente. Da mesma forma, as células do tumor u-87 são projetadas para mCherry express e luciferase de vaga-lume, proporcionando dupla fluorescente/luminescentes de rastreamento. Enquanto atualmente utilizados para a investigação de células estaminais mediada entrega da terapêutica, este protocolo pode ser modificado para investigar o impacto da ressecção cirúrgica em outras intervenções GBM.
Introduction
Glioblastoma (GBM) é o câncer de cérebro primário mais comum em adultos, com uma sombria sobrevida média de apenas 12-15 meses1,2,3,4,5. Sobrevivência não melhorou significativamente desde 2005, quando o atual padrão clínico de máxima ressecção cirúrgica seguida de radioterapia e quimioterapia de temozolomide concomitante e adjuvante foi adoptada a6,7. Enquanto este tratamento fornece pacientes com um alívio temporário dos sintomas, padrão de tratamento invariavelmente resulta em recorrência como focos de câncer invasivo evade ressecção e são protegidos de terapias sistêmicas pela barreira hemato - encefálica (BBB). Estratégias que têm como alvo os focos de tumor invasivo enquanto contornando o BBB são urgentemente necessários para ganhar tração contra esta doença debilitante e agressiva.
Células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) mostram a promessa como droga veículos de entrega para GBM devido ao seu tumor nativo tropismo8,9. MSCs possuem receptores para e migrar para fatores solúveis que tumores secretam, incluindo 1 α fator derivado de células do estroma (SDF-1 α), matriz metaloproteinase-1 (MMP-1) e monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1), entre outros10, 11 , 12 , 13. engenharia MSCs para expressar e secretam drogas citotóxicas que lhes permite ser aproveitada como tumor-homing veículos de entrega de drogas. MSCs projetados mover em direção a focos de tumor invasivo e fornecer proteínas terapêuticas. Esta abordagem demonstrou a viabilidade em uma variedade de pré-clínicos GBM modelos9,14. No entanto, a grande maioria destes modelos não inclui ressecção cirúrgica apesar da relevância clínica deste componente. Emergentes estudos utilizando novos modelos de ressecção revelaram que a remoção cirúrgica do tumor reduz a persistência de células-tronco que são injetados diretamente na cavidade cirúrgica15. Perda da viabilidade resultou em eficácia reduzida, provavelmente devido a diminuição da dose e duração da droga entregues para os focos de tumor invasivo.
Para aumentar a viabilidade de células-tronco e a entrega da droga, MSCs podem ser semeados em andaimes antes da implantação. Neste protocolo, biocompatíveis e absorvíveis electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) é usado como andaimes para o MSCs. PLA flexiona e conforma-se à forma da cavidade ressecção em cima do implante, o que maximiza a cobertura terapêutica e minimiza o distância MSCs deve percorrer para atingir as células do tumor. MSCs permanecem no andaime durante a implantação e então migram do andaime em direção a células tumorais após implantação de16,17. MSCs e as drogas citotóxicas que carregam então se acumulam nos focos de tumor. Entrega de drogas citotóxicas ao tumor requer MSC viabilidade e persistência, ambos os quais são auxiliados por implantação em andaimes.
Neste procedimento, Lentivirus vetores são usados para induzir a expressão estável de lâmpadas fluorescentes (em vitro de acompanhamento) e bioluminescentes (no vivo controle) marcadores em linhas tanto câncer e células-tronco. A linha GBM humana u-87 está infectada com mCherry e firefly luciferase (mCh-Fl u-87) e os não-terapêutico MSCs com GFP e renilla luciferase (MSC GFP-Rluc). A variante terapêutica do MSCs express TNFa relacionados apoptose induzindo ligante (MSC-TRAIL). TRILHA, uma proteína secretada constitutivamente, vincula a nas proximidades de receptores de morte sobre o câncer células e inicia a apoptose mediada por caspase18.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para pré-clínicos guiada por imagem GBM ressecção cirúrgica e a implantação do MSC-semeado andaimes. Em breve, camundongos são dadas uma craniotomia seguida três dias mais tarde por injeção estereotáxica ortotópico de u-87 mCh-Fl para estabelecer o tumor primário. O engrafted tumor cresce por um período de aproximadamente uma semana. PLA andaimes são semeados com MSCs 48 h antes da cirurgia de ressecção. O tumor é então ressecado sob orientação fluorescente e o andaime MSC-carregado é implantado na cavidade de ressecção. Sobrevivência de fardo e rato de tumor então são controladas no período pós-operatório com bioluminescência imaging (BLI). Um cronograma desses procedimentos é fornecido abaixo (Figura 1).
Figura 1: linha do tempo dos procedimentos. Ratos, inicialmente, receber uma janela cranial (dia 0). Após um período de recuperação de três dias, os tumores são implantados (dia 3) e crescer por aproximadamente uma semana. Andaimes são semeados com MSCs (dia 8), dois dias antes o processo de implantação e ressecção do tumor (dia 10). Progressão do tumor e efeito terapêutico são avaliados através de pós operatório de imagem posteriormente (dia 10 +). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da The University of North Carolina em Chapel Hill.
Nota: Este procedimento é realizado em ratos com uma craniotomia aberta, como uma versão modificada do protocolo por Mostany e Portera-Cailliau19 , onde o tecido ósseo que é cirurgicamente removido é Descartado, deixando o cérebro acessível para estabelecimento e eventual ressecção de tumores GBM. Após a craniotomia, tumores por intermédio estereotáxica implantação conforme descrito em Ozawa e James20. Nós implantamos células de mCh-Fl 1 x 105 u-87 nas seguintes coordenadas estereotáxica (em mm do bregma): (2.5, 0, -0.5).
1. celular cultura e preparação do andaime
Nota: Andaimes devem estar preparados a 48 h antes da implantação em camundongos. Os volumes seguintes são fornecidos numa base de por-andaime. Multiplica as quantidades conforme necessário para andaimes adicionais.
- Corte andaimes PLA em ressecção de cavidade de tamanho (aproximadamente 2 x 2 mm). Andaimes podem ser cortadas à mão usando tesoura ou usando um furador para repetibilidade.
- Esterilize por imersão em etanol a 70% por 15 min, seguido por imersão em PBS. Coloque o andaime no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina ao preparar células para semeadura.
- Levante o MSCs cultivadas usando tripsina 0,05% (3-5 mL para um balão de T75). Incubar a 37 ° C por 5 min. Assegure-se que as células têm levantado e, em seguida, adicione 7-10 mL DMEM no balão para inactivar a tripsina.
- Transferi o conteúdo do frasco para um tubo de centrífuga de 15 mL. Contar as células usando um hemocytometer. Pelotas 5 x 105 MSCs para cada andaime através de centrifugação a 100 x g durante 5 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspender MSCs em 5 µ l DMEM por 5 x 105 células.
- Prepare os andaimes para semeadura por afagando-los secos.
- Remover um andaime de imersão DMEM com fórceps e temporariamente, coloque-o sobre a tampa da placa de 6-poços. Levante o andaime a tampa, deixando para trás uma gotícula de DMEM em excesso.
- O andaime volta Coloque a tampa novamente em um novo local seco. Repita 3 - 5 vezes, em seguida, coloque o andaime parcialmente secado em uma nova placa de 6 para semeadura. Repita para cada andaime.
Nota: Um andaime parcialmente secado fornece célula ideal semeando resultados. Se o andaime é muito molhado, células irão escorregar o andaime e aderir à placa bem abaixo. Se o andaime é muito seco, a gota não espalhará sobre o andaime todo, resultando em distribuição pobre célula inicial.
- Utilizando uma pipeta, misture suavemente o frasco de células-tronco para homogeneizar a suspensão como algumas células podem se instalaram na parte inferior.
- Lentamente, pipete 2,5 µ l recém misturado suspensão MSC diretamente no cadafalso, criando uma gota pequena por cima do andaime.
- Adicione 300 µ l DMEM às bordas de cada poço. Isto evitará a evaporação rápida da gota da célula. Incube a 37 ° C por 30 min, permitindo que as células anexar para o cadafalso.
- Com a pinça, delicadamente vire os andaimes no prato bem. Semente 2,5 µ l recém misturado MSC suspensão (isso resulta em um total de 5 x 105 células semeado por andaime). Incube a 37 ° C por 30 min, permitindo que as células anexar para o cadafalso.
- Cobrir os andaimes em DMEM, adicionando 2 mL para cada poço da placa de 6-poços. Levante suavemente os andaimes para permitir que a mídia a fluir debaixo deles. Incube a 37 ° C neste estado por 48 h antes da cirurgia de implantação.
- Verificar os andaimes após 24h e adicionar/alterar a mídia se excesso evaporação ou descoloridas mídia devido ao desequilíbrio de pH é observada.
2. guiada por fluorescência ressecção e implantação de andaime
Nota: Esterilize todos os equipamentos antes de inicializar a cirurgia. Administre analgesia profilática, conforme descrito no seu protocolo IACUC institucional.
- Coloque a armação estereotáxica no palco de um dissecando o microscópio de fluorescência.
- Anestesia o mouse sob isoflurano inalado em uma câmara de indução. Uma vez anestesiado, prenda o mouse no quadro estereotáxica com anestesia inalada contínua oferta através de um adaptador de cone de nariz de isoflurano. Manter a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento e/ou sonda.
Nota: 4-5% de isoflurano é adequado para indução e 2-3% é adequado para manutenção, mas isso deve ser adaptado e monitorado para cada rato. - Aplica a pomada oftálmica nos olhos para impedir a secagem da córnea. Esterilize o local da incisão do couro cabeludo com uma série de três álcool e três lenços de betadine.
- Realizar teste de reflexo do dedo do pé beliscão em cada membro e confirmar a resposta negativa para garantir adequada anesthetization. Assegure uma constante taxa respiratória em cerca de 55-65 respirações/min.
- Usando a pinça, aperte e levante suavemente o couro cabeludo. Fazer uma incisão rostral-caudal linear com tesoura cirúrgica. Irrigar o local da incisão com PBS e remover a gordura subcutânea com um aplicador de ponta de algodão em um movimento circular de escovagem. Organize a pele tal que a janela craniana anteriormente estabelecido é totalmente visível.
- Delicadamente perfure a dura-máter só interior para as bordas da janela craniana, usando uma agulha de 18 G. Repita até que a incisão traços totalmente o interior da janela.
- Remova a dura-máter por descascar afastado usando pinça fina, revelando o parênquima subjacente e tumor.
- Localize o tumor de mCh-Fl u-87 por desligar as luzes da sala e ligar o modo estereomicroscópio de fluorescência. Prepare-se para ressecção carregando uma ponta da pipeta 1-200 µ l em final da tubulação de uma bomba de vácuo.
- Ligue a bomba de vácuo. Ressecar o tumor aspirando suavemente o tecido fluorescente até sem sinal permanece. Desligue a bomba de vácuo e descartar a ponta da pipeta. Transformar a fluorescência fora e sala de luzes.
Nota: Para controlar o sangramento, irrigar com PBS frio e aplicar uma pressão constante com um aplicador de ponta de algodão. Em casos mais graves, a cavidade de ressecção pode também ser temporariamente embalada com um agente hemostático, enquanto ele é removido após a hemorragia parou seguido por outra irrigação de PBS. - Imediatamente antes da implantação, mergulhe lentamente um andaime PLA MSC-semeado em PBS para remover mídia indesejadas e componentes associados. Implante o andaime na cavidade de ressecção. Se necessário, adicione 1 fibrinogênio µ l (67-106 mg/mL), seguido por 1 trombina µ l (400-625 U/mL) para fixar o andaime no lugar.
- Com a dura-máter removido e o retalho ósseo da janela craniana já descartados, fechar a ferida, simplesmente, fechando a pele e aplicar a cola cirúrgica. Retire o animal do anestésico inalado e permitir a recuperação em uma superfície aquecida.
- Mouse uma vez ambulatorial, retorno para gaiola. Administre analgésico na agenda IACUC-aprovado. Repita o procedimento para cada rato.
3. pós-operatório de imagem
- Utilizando a seringa de insulina 28-G, injete camundongos com D-luciferina (150 mg/kg intraperitoneal).
- Espere 10 min. Isso permitirá que a luciferina a circular por todo o corpo e reagir com as células cancerosas do luciferase-expressando no cérebro para obter a expressão de pico.
- Sob anestesia de isoflurano (como mencionado anteriormente), imagem de ratos em uma bioluminescência (BLI) sistema para visualizar os tumores de imagem. Variam de tempos de exposição como necessários (segundos a minutos), dependendo do tamanho do tumor.
- Repita o procedimento de imagem conforme necessário para determinar a cinética de crescimento do tumor. Continue a monitorar a saúde animal.
Nota: Os MSCs terapêuticos constitutivamente expressará trilha, matando as células cancerosas e suprimindo o crescimento global do tumor. Cada 2-5 dias de imagem fornece frequência suficiente para essa finalidade. - Quando os pontos de extremidade predeterminados descritos no protocolo IACUC terem sido cumpridos, sacrificar os ratos por perfusão transcardial e recolher os tecidos para análise.
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Representative Results
U-87 células de tumor foram projetadas para mCherry express e luciferase de vaga-lume (mCh-Fl u-87) antes da injeção e para permitir a ressecção guiada por imagem e bioluminescência rastreamento (Fig. 2A-C). Células-tronco foram da mesma forma projetadas com diagnóstico GFP-Rluc (MSC-GFP) ou GFP-ensaio terapêutico (MSC-TRAIL) e propagadas para os PLA andaimes para confirmar a fixação e proliferação (Figura 2D-F).
Figura 2: imagens representativas de células cancerosas fluorescente e MSCs semearam na PLA. A-C) Fase, fluorescente e combinado imagens, respectivamente, células cancerosas mostrar u-87, projetadas com construções de Lentivirus de marcadores expresso mCh-Fl. D-F) Imagens correspondentes de células-tronco projetado para expressar GFP-Rl ou terapêutico GFP-trilha semeada para o material de andaime de PLA. Escala de barras = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagens intra-operatórias são fornecidas abaixo para destacar porções do procedimento cirúrgico para ressecção do tumor e andaime implantação (Figura 3). Primeiro, o animal é anestesiado e alinhado no instrumento estereotáxica (Figura 3A). A pele é aberta, e a dura-máter é descascada de volta. O tumor é ressecado (Figura 3B), e quando examinada sob luz branca parece ser totalmente removido. No entanto, imagens fluorescentes do tumor antes (Figura 3) e depois (Figura 3D) ressecção indicam enquanto a maioria do tumor foi removida, uma quantidade residual permanece. Este fenômeno é semelhante a casos clínicos em que os cirurgiões são incapazes de remover as células do tumor que migram rapidamente longe a massa primária e em áreas inoperáveis no cérebro. Movimento de MSCs terapêutico migratório em direção a focos de tumor residual que permanecem após a ressecção cirúrgica. Para entregar o MSCs na cavidade de ressecção, os MSCs primeiro são semeados no PLA, e em seguida a construção do andaime é colocada na cavidade de ressecção. Está confirmada a existência dos MSCs no cadafalso pós-implante por fluorescente imagem sinal GFP (Figura 3E). Ex vivo todo cérebro imagens mostram andaime dimensões em relação a cavidade de ressecção (Figura 3F-H). O andaime parece significativamente maior quando colocados horizontalmente, mas pode ser moldado em forma de cavidade de ressecção durante a implantação. Revestindo toda a cavidade, a distância que terapêuticas MSCs precisam migrar para alcançar focos de tumor é minimizada. Após a cirurgia, BLI é usado para controlar o crescimento do tumor ao longo do tempo e determinar a eficácia de MSC-trilha de andaime-entregue.
Figura 3: imagens representativas intraoperatórios e pós-operatória. Rato apresentando intra-operatória série A), antes da incisão. B) incisado mouse com janela craniana, revelando o tumor em massa. C) campo claro e imagem de sobreposição fluorescente, mostrando a localização do tumor. D) cavidade de pós-cirúrgico de ressecção com focos de tumor remanescente. E) andaime PLA implantou semeado com MSC-TRAIL. F) Post-mortem do cérebro tecido com andaime sobreposto. G) fluorescente sobreposição destacando as células GFP-TRAIL. H) Magnified versão de barras da escala de G. = 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Cirurgia geralmente pode ser concluída dentro de 30 min por rato, dado que os seguintes pontos são levados em consideração para maximizar a precisão e evitar armadilhas demoradas. Primeiro, certifique-se que o mouse está posicionado corretamente no instrumento estereotáxica antes de iniciar o procedimento. Os movimentos indesejados da cabeça vão limitar a precisão cirúrgica da craniotomia, localização da implantação do tumor e grau de ressecção do tumor. Antes da ressecção, retire totalmente a parte da dura-máter cobrindo o tumor. A dura-máter resistente, fibrosa endurece como desidrata durante a aspiração. Se incompletamente removida, a dura-máter endurecida pode limitar a mobilidade de ponta de aspirador e evitar ressecção completa do tumor. Durante a ressecção, os vasos sanguíneos são muitas vezes inadvertidamente ressecados juntamente com o tumor, causando sangramento significativo. Excesso de sangue diminui a intensidade do sinal fluorescente e obscurece o tumor. Manter a visibilidade do tumor durante a ressecção garante adequada extensão da ressecção e limita a remoção de tecido sadio e sangramento excessivo. Para pequenos sangramentos, irrigar o vaso danificado com soro fisiológico frio e aplique uma pressão suave com um aplicador de ponta de algodão. Se o sangramento continua, embalar um agente hemostático na cavidade para 2-3 min e remova com a pinça. Irriga com PBS depois de restaurar o pH fisiológico antes da implantação do andaime celular-semeado. Quando a ressecção é concluída e parou de sangrar, a armadilha final é fechamento inadequado da pele ferido. Isso geralmente é causado por excesso de umidade (PBS ou sangue) que impede a ligação a incisão da pele a cola cirúrgica. Evite isso por secagem suavemente a pele com um aplicador de ponta de algodão antes de aplicar a cola. Também é possível colar acidentalmente a pele diretamente para o crânio se a lacuna da ferida não primeiro realiza-se em uma posição fechada com fórceps antes da colagem.
Com estas considerações em mente, o protocolo acima produz consistentes e confiáveis ressecções de cirúrgica de GBM que imitam o padrão de atendimento para precisos na vivo testando de célula emergente e terapias pequena molécula. Ainda, vários componentes podem ser modificados para atender necessidades experimentais particulares. Por exemplo, propriedades de tumor como tamanho, localização e extensão da invasão podem ser ajustadas alterando o número inicial e profundidade de células injetadas, tempo entre o estabelecimento do tumor e ressecção, ou alternando a própria linha de células de tumor. Além disso, este estudo é realizado em camundongos modelo cujo sistema imunológico comprometido tolera as células humanas. Imunes competentes ratos podem ser mais apropriados para estudos utilizando células de rato.
Em comparação com um sistema fechado (ou seja, o osso ou uma lamela é voltar a colocar), a craniotomia aberta realizada neste protocolo reduz a pressão intracraniana (ICP). Desde que o aumento da pressão Intracraniana é responsável para o aparecimento de sintomas, incluindo convulsões, ratos experimentará um prolongamento artificial de sobrevivência neste modelo. Enquanto o impacto é minimizado devido ao atraso aplicáveis aos grupos de controle e o tratamento, futuros modelos re-poderiam fechar o retalho ósseo para restaurar ICP e determinar o papel que ela desempenha na terapia celular para GBM.
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Disclosures
Os Drs Sheets, barsan e Hingtgen têm capital próprio na terapêutica de Falcon que licenciou-se aspectos da célula-tronco e tecnologia de andaime de UNC Chapel Hill.
Acknowledgments
Os autores reconhecem contribuições editoriais do Dr. Kathryn Pietrosimone. PLA andaimes foram fabricados pelo laboratório do Dr. Elizabeth Loboa na North Carolina State University. Este trabalho foi apoiado pela UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center Universidade Cancer Research Fund e UNC translacional e Instituto de ciências clínicas (KL2TR001109, UL1TR001111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
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