Summary
إظهار الورم التماس العلاج الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وعد لعلاج جليوبلاستوما الغازية. زرع الأمثل يشمل تسليم MSCs في تجويف استئصال الورم على السقالات. هنا، يتم توفير التقنيات الإكلينيكية لدراسة ماجستير معاملة جليوبلاستوما بما في ذلك: استئصال ورم الموجهة بصورة؛ غرس السقالات المصنفة من قبل لجنة السلامة البحرية؛ والعلاج بعد العملية الجراحية التي تتبع.
Abstract
يحمل جليوبلاستوما (GBM)، سرطان الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والعدوانية، متوسط عمر 12-15 شهرا. قصيرة العمر المتوقع يعزى جزئيا إلى عدم قدرة العلاج الحالي، وتتألف من الاستئصال الجراحي متبوعاً بالإشعاع والعلاج الكيميائي، للقضاء على البؤر الورم الغازية. يمكن تحسين العلاج من هذه البؤر مع توموريسيدال البشرية الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs). MSCs يحمل انتحاء الورم قوية ويمكن إجراء هندسة عكسية للبروتينات العلاجية إكسبريس التي تقتل الخلايا السرطانية. التقدم في نماذج الإكلينيكية تشير إلى أن الاستئصال الجراحي يستحث سابق لأوانه MSC الخسارة ويقلل من الفعالية العلاجية. يمكن تحسين فعالية العلاج MSC ببذر MSCs على سقالة poly(lactic acid) القابلة للتحلل (جيش التحرير الشعبي). يعيد تقديم ماجستير في تجويف الاستئصال الجراحي في سقالة جيش التحرير الشعبي الصيني استبقاء خلية والمثابرة، وقتل الورم. ويلزم لدراسة آثار زرع جيش التحرير الشعبي الصيني المصنف لجنة السلامة البحرية في الخليج للحاسبات الآلية، نموذج دقيق السريرية. هنا نقدم بروتوكول السريري جراحي لاستئصال الورم موجهة بصورة من الخليج للحاسبات الآلية في الفئران التي تفتقر إلى المناعة متبوعاً بغرس سقالة المصنف MSC. يتم إجراء هندسة عكسية MSCs مع بنيات لينتيفيرال للتعبير عن مؤثرا وتفرز العلاجية المتعلقة ب TNFα الذي يحفز المبرمج يجند (درب) فضلا عن البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) للسماح بتتبع الفلورسنت. وبالمثل، تم تصميم الخلايا السرطانية U87 مشري صريحة ولوسيفراس اليراع، توفير المزدوج فلوري/الإنارة تتبع. بينما تستخدم حاليا للتحقيق في إيصال الخلايا الجذعية بوساطة المداواة، يمكن تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في تأثير الاستئصال الجراحي في تدخلات أخرى في الخليج للحاسبات الآلية.
Introduction
جليوبلاستوما (GBM) هو سرطان الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً في البالغين، مع متوسط بقاء كئيبة للتو 12-15 شهرا1،2،3،،من45. البقاء على قيد الحياة لم يتحسن كثيرا منذ عام 2005 عندما كان معيار السريرية الحالية من الاستئصال الجراحي القصوى متبوعاً بالإشعاع والعلاج الكيميائي temozolomide ملازم و adjuvant اعتمدت6،7. مستوى العلاج والرعاية في حين توفر هذا العلاج المرضى الذين يعانون من إغاثة مؤقتة للأعراض، دائماً النتائج في تكرار التهرب من استئصال بؤر سرطان الغازية ويحميها من العلاجات الجهازية حاجز الدم في الدماغ (BBB). الاستراتيجيات التي تستهدف البؤر الورم الغازية بينما التحايل BBB هناك حاجة ماسة اكتساب قوة دافعة ضد هذا المرض الموهن والعدوانية.
إظهار الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة (MSCs) وعد كالمخدرات وسائل إيصالها للخليج للحاسبات الآلية بسبب انتهاء الورم الأصلي انتحاء8،9. تمتلك مستقبلات ل MSCs وترحيل نحو العوامل القابلة للذوبان التي تفرز الأورام، بما في ذلك عامل المستمدة من الخلايا اللحمية 1α (قوات الدفاع الذاتي-1α)، مصفوفة أية-1 (MMP-1)، والوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) بينها10، 11 , 12 , 13-الهندسة MSCs للتعبير عن وإفراز العقاقير السامة للخلايا تسمح لهم بتسخيرها كوسائل إيصال المخدرات الورم-صاروخ موجه. التحرك في اتجاه البؤر الورم الغازية MSCs هندسيا وتقديم البروتينات العلاجية. وهذا النهج أثبت جدوى في مجموعة متنوعة من نماذج الخليج للحاسبات الآلية السريرية9،14. غير أن الغالبية العظمى من هذه النماذج لا تشمل الاستئصال الجراحي على الرغم من أهميتها السريرية لهذا المكون. تظهر الدراسات باستخدام نماذج جديدة لاستئصال كشفت أن إزالة الورم الجراحي يقلل من استمرار وجود الخلايا الجذعية التي يتم حقنها مباشرة داخل تجويف الجراحية15. أدت إلى فقدان الاستمرارية في انخفاض كفاءة، سلمت احتمالاً بسبب النقصان في الجرعة والمدة للمخدرات إلى بؤر الورم الغازية.
زيادة صلاحية الخلايا الجذعية وإيصال الأدوية، يمكن المصنف MSCs على السقالات قبل غرس. في هذا البروتوكول، متوافق حيويا وريسوربابل اليكتروسبون نانوفيبروس poly(lactic acid) (جيش التحرير الشعبي) السقالات لجيش التحرير الشعبي الصيني MSCs. تنثني ويتوافق مع شكل تجويف بتر عند الزرع، مما يزيد من التغطية العلاجية، ويقلل إلى أدنى حد المسافة MSCs يجب اجتيازها للوصول إلى الخلايا السرطانية. تبقى على السقالة أثناء غرس MSCs وثم ترحيل إيقاف السقالة تجاه الخلايا السرطانية بعد زرع16،17. MSCs والعقاقير السامة للخلايا التي يحملونها ثم تتراكم في البؤر الورم. يتطلب تقديم العقاقير السامة للخلايا للورم MSC بقاء واستمرار، اللذين يتم بمساعدة غرس على السقالات.
في هذا الإجراء، يتم استخدام ناقلات لينتيفيرال للحث على تعبير مستقر فلوري (في المختبر التعقب) وطرحه (في فيفو تتبع) علامات في خطوط السرطان والخلايا الجذعية. خط الخليج للحاسبات الآلية البشرية U87 مصاب لوسيفراس مشري ويراعه (U87 صحة الأم والطفل-فلوريدا)، و MSCs غير العلاجية مع لوسيفراس التجارة والنقل ورينيلا (MSC بروتينات فلورية خضراء-رلوك). البديل العلاجي من MSCs express المتصلة TNFα المبرمج الذي يحفز يجند (MSC تريل). درب، بروتين يفرز مؤثرا، بربط القريبة مستقبلات الموت في سرطان الخلايا ويبدأ المبرمج بوساطة caspase18.
هنا، نحن نقدم بروتوكول السريرية الموجهة بصورة GBM العمليات الجراحية استئصال وغرس السقالات المصنف MSC. بإيجاز، والفئران عارية ترد اوديما بعد ثلاثة أيام بالمناظير باستخدام الأشعة أورثوتوبيك حقن U87 صحة الأم والطفل-فلوريدا إلى إنشاء الورم الرئيسي. ينمو الورم انجرافتيد لمدة أسبوع واحد تقريبا. هي المصنف السقالات جيش التحرير الشعبي الصيني مع ح MSCs 48 قبل جراحة الاستئصال. ثم هو مستأصل الورم تحت التوجيه الفلورسنت، وهو مزروع سقالة تحميل ماجستير في تجويف بتر. يتم تعقب الورم بقاء عبء والماوس ثم قد مع الإضاءة الحيوية التصوير (BLI). فيما يلي تسلسل زمني لهذه الإجراءات (الشكل 1).
رقم 1: الجدول الزمني للإجراءات- في البداية تلقي الفئران نافذة الجمجمة (يوم 0). بعد فترة نقاهة لمدة ثلاثة أيام، أورام مزروع (3 يوم) وتنمو لمدة أسبوع تقريبا. هي المصنف السقالات مع MSCs (8 اليوم) يومين قبل إجراء استئصال وزرع الورم (يوم 10). ويجري تقييم تطور الورم والفعالية العلاجية عن طريق المنطوق بعد انتهاء التصوير بعد ذلك (يوم 10 +). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة شمال كارولاينا" في تشابل هيل.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء على الفئران مع اوديما مفتوحة، كصيغة معدلة للبروتوكول من جانب موستاني وبورترا كيليو19 حيث يتم تجاهل الأنسجة العظام التي يتم إزالتها جراحيا، ترك الدماغ موجوداً لإنشاء و في نهاية المطاف استئصال أورام GBM. بعد اوديما، تنشأ الأورام عن طريق غرس المناظير باستخدام الأشعة كما هو موضح في أوزاوا وجيمس20. ونحن زرع 1 × 105 U87 صحة الأم والطفل-فلوريدا الخلايا عند الإحداثيات التالية المناظير باستخدام الأشعة (في مم من بريجما): (2، 5، 0،-0.5).
1-خلية ثقافة وسقالة إعداد
ملاحظة: ينبغي إعداد السقالات 48 ساعة قبل غرس في الفئران. وتقدم وحدات التخزين التالية على أساس كل سقالة. مضاعفة الكميات حسب الحاجة للسقالات إضافية.
- قطع السقالات جيش التحرير الشعبي الصيني إلى قطع بتر تجويف الحجم (حوالي 2 × 2 مم). ويمكن خفض السقالات باليد باستخدام مقص أو استخدام لكمه ثقب للتكرار.
- تعقيم بتخبط في الإيثانول 70% لمدة 15 دقيقة تليها أغرق في برنامج تلفزيوني. ضع سقالة في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين-ستربتوميسين 1% أثناء إعداد الخلايا للبذر.
- رفع مثقف MSCs استخدام 0.05% التربسين (3-5 مل لقارورة T75). احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 التأكد من أن الخلايا قد رفعت، ثم إضافة 7-10 مل دميم بقارورة لإلغاء تنشيط التربسين.
- نقل محتويات قارورة إلى أنبوب الطرد 15 مل. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. بيليه 5 × 105 MSCs لكل سقالة عن طريق استخدام الطرد المركزي في 100 غ س لمدة 5 دقائق.
- نضح قبالة المادة طافية وريسوسبيند MSCs في 5 ميليلتر دميم الواحدة 5 × 105 خلايا.
- إعداد السقالات للبذور التي الربت عليها الجافة.
- إزالة سقالة من الغمر دميم بالملقط ووضعه مؤقتاً على غطاء لوحة 6-جيدا. رفع السقالة قبالة الغطاء، مخلفة وراءها قطرات دميم الزائدة.
- ضع السقالة مرة أخرى على الغطاء مرة أخرى في موقع جديد والجافة. كرر 3-5 مرات، ثم ضع سقالة المجففة جزئيا في لوحة 6-بئر جديدة للبذر. كرر كل السقالة.
ملاحظة: يوفر سقالة مجففة جزئيا الأمثل الخلية البذر النتائج. إذا كانت السقالة رطبة جداً، سوف الانزلاق خارج السقالة الخلايا والتمسك بلوحة جيدا أدناه. إذا كانت السقالة جافة جداً، لن يمتد الحبرية على سقالة كامل، الناتج في الخلية الأولى سوء التوزيع.
- استخدام ماصة، المزيج بلطف قنينة الخلايا الجذعية مجانسة التعليق كما قد استقرت بعض الخلايا للأسفل.
- ببطء "الماصة؛" 2.5 ميليلتر طازجة مختلطة تعليق ماجستير مباشرة على السقالة، إنشاء معالجة تجميعية صغيرة عبر الجزء العلوي من السقالة.
- إضافة 300 ميليلتر دميم للحواف لكل بئر. وهذا يمنع التبخر السريع من الحبرية الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، السماح للخلايا لنعلق على السقالة.
- مع الملقط، بلطف اقلب السقالات في اللوحة جيدا. بذور 2.5 تعليق ماجستير ميليلتر طازجة مختلطة (وهذا ينتج إجمالي 5 × 105 خلايا المصنف الواحد سقالة). احتضان عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، السماح للخلايا لنعلق على السقالة.
- وتغطي السقالات في دميم بإضافة 2 مل لكل بئر من لوحة 6-جيدا. رفع السقالات للسماح لوسائل الإعلام بالتدفق تحتها بلطف. احتضان عند 37 درجة مئوية في هذه الدولة عن 48 ساعة قبل جراحة زرع.
- تحقق السقالات بعد 24 ساعة وإضافة/تغيير وسائل الإعلام إذا لوحظ التبخر الزائد أو وسائل الإعلام مشوه بسبب اختلال درجة الحموضة.
2-يسترشد fluorescence استئصال وزرع السقالة
ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات قبل تهيئة عملية جراحية. إدارة التسكين الوقائي كما ورد في البروتوكول IACUC المؤسسية الخاصة بك.
- وضع الإطار ستيريوتاكسيك في مرحلة الأسفار تشريح ستيريوميكروسكوبي.
- الماوس إطار isoflurane المستنشقة في دائرة التعريفي لتخدير. بمجرد تخديره، تأمين الماوس في الإطار ستيريوتاكسيك مع إمدادات التخدير استنشاق المستمر عبر محول مخروط الآنف إيسوفلوراني. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع وسادة التدفئة و/أو التحقيق.
ملاحظة: إيسوفلوراني 4-5% ومناسبة لتحريض و 2-3% ومناسبة للصيانة، ولكن هذا يجب تكييفها ومراقبتها لكل الماوس. - تطبيق مرهم العيون إلى العيون لمنع جفاف القرنية. موقع شق فروة الرأس مع سلسلة من الكحول ثلاثة والثلاثة تدين مناديل تعقيم.
- أداء اختبار منعكس قرصه تو كل أطرافهم وتأكيد استجابة سلبية لضمان أنيسثيتيزيشن السليم. ضمان معدل التنفس مطرد في حوالي 55-65 الأنفاس في الدقيقة.
- استخدام الملقط، قرصه وترفع بلطف فروة الرأس. جعل شق خط الوسط روسترال والذيلية خطي مع المقص الجراحي. ري شق الموقع مع برنامج تلفزيوني وإزالة الدهون تحت الجلد مع قضيب نصيحة القطن في حركة دائرية الفرشاة. ترتيب الجلد مثل الإطار الجمجمة المنشأة سابقا مرئية بالكامل.
- ثقب دوراً الداخلية فقط إلى حدود الإطار الجمجمة باستخدام إبرة 18-ز لطف. كرر حتى يتتبع الشق تماما داخل الإطار.
- إزالة في بلده دوراً تقشير بعيداً باستخدام الملقط غرامة، الكشف عن حمة الكامنة والورم.
- تحديد موقع الورم صحة الأم والطفل-فلوريدا U87 قبل إيقاف تشغيل أضواء الغرفة وتشغيل الوضع ستيريوميكروسكوبي-الأسفار. التحضير لبتر بتحميل 1-200 ميليلتر ماصة تلميح إلى نهاية الأنبوب مضخة فراغ.
- تشغيل مضخة فراغ. يرسخ الورم قبل يسفط نيون الأنسجة بلطف حتى لا تزال لا توجد إشارة. قم بإيقاف تشغيل مضخة فراغ وتجاهل نصيحة ماصة. دورة fluorescence قبالة والغرفة الأضواء مرة أخرى على.
ملاحظة: للتحكم في النزيف، ري مع برنامج تلفزيوني الباردة وتطبيق ضغط ثابت مع قضيب نصيحة القطن. في أشد الحالات، تجويف بتر يمكن أيضا أن يكون مؤقتاً معبأة مع عامل مرقئ طالما يتم إزالته بعد توقف النزيف متبوعاً بآخر برنامج تلفزيوني الري. - فورا قبل غرس، تراجع ببطء سقالة جيش التحرير الشعبي الصيني المصنف ماجستير في برنامج تلفزيوني لإزالة الوسائط غير المرغوب فيها، والعناصر المرتبطة بها. زرع السقالة في تجويف الاستئصال. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميليلتر الفيبرينوجين (67-106 ملغ/مل) تليها 1 ميليلتر ثرومبين (400-625 U/mL) لتأمين السقالة في المكان.
- مع دوراً في إزالة ورفرف العظام من الجمجمة نافذة بالفعل تجاهل، ختم الجرح ببساطة عن طريق إغلاق الجلد وتطبيق الغراء الجراحي. إزالة الحيوان من مخدر المستنشقة والسماح لاسترداد على سطح ساخن.
- الماوس مرة الإسعافية، والعودة إلى القفص. إدارة مسكن على الجدول الزمني للموافقة على إياكوك. كرر الإجراء لكل الماوس.
3-المنطوق بعد انتهاء التصوير
- باستخدام حقنه الأنسولين 28-ز، حقن الفئران مع د-لوسيفرين (150 مغ/كغ داخل).
- انتظر 10 دقائق. هذا سوف يسمح لوسيفرين أن تعمم في جميع أنحاء الجسم وتتفاعل مع الخلايا السرطانية في الدماغ للحصول على ذروة التعبير التعبير عن لوسيفراس.
- تحت التخدير إيسوفلوراني (كما ذكر سابقا)، صورة الفئران في الإضاءة الحيوية نظام (BLI) لتصور الأورام التصوير. وتختلف أوقات التعرض اللازمة (ثانية إلى دقيقة) اعتماداً على حجم الورم.
- كرر الإجراء التصوير حسب الحاجة لتحديد حركية نمو الورم. الاستمرار في مراقبة صحة الحيوان.
ملاحظة: MSCs العلاجية مؤثرا عن درب، قتل خلايا السرطان وقمع نمو الورم عموما. يوفر التصوير كل 2-5 أيام تردد كافية لهذا الغرض. - عند النهاية سلفا المبينة في البروتوكول IACUC قد استوفيت، التضحية الفئران نضح ترانسكارديال وجمع الأنسجة لتحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء هندسة عكسية الخلايا السرطانية U87 مشري صريحة ويراعه لوسيفراس (U87 صحة الأم والطفل-فلوريدا) قبل الحقن، والسماح لاستئصال الموجهة بالصورة والإضاءة الحيوية تتبع (الشكل 2 أ-ج). وبالمثل كانت الخلايا الجذعية هندسيا مع تشخيص بروتينات فلورية خضراء-رلوك (ماجستير-التجارة والنقل) أو العلاجية بروتينات فلورية خضراء-المحاكمة (MSC تريل) والمصنف على السقالات جيش التحرير الشعبي الصيني لتأكيد الحجز وانتشار (الشكل 2D-F).
رقم 2: الصور التمثيلية للخلايا السرطانية الفلورسنت و MSCs المصنفة في جيش التحرير الشعبي الصيني- أ-ج) المرحلة، نيون، والجمع بين الصور، على التوالي، الخلايا السرطانية تظهر U87 هندسيا مع بنيات لينتيفيرال لعلامات التعبير عن صحة الأم والطفل-فلوريدا. د-و) إجراء هندسة عكسية الصور المقابلة للخلايا الجذعية للتعبير عن التجارة والنقل-Rl أو بروتينات فلورية خضراء تريل العلاجية المصنف على مواد السقالات جيش التحرير الشعبي الصيني. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وترد أدناه الصور الموضعية تمييز أجزاء من العملية الجراحية لاستئصال الورم وسقالة غرس (الشكل 3). أولاً الحيوان تخديره والانحياز في الصك ستيريوتاكسيك (الشكل 3A). يتم فتح الجلد، وهي مقشرة دوراً العودة. الورم هو مستأصل (الشكل 3B)، وعندما بحثت تحت الضوء الأبيض يظهر المراد إزالتها تماما. ومع ذلك، صور مضيئة للورم قبل (الشكل 3) وبعد بتر (الشكل 3D) تشير إلى حين تمت إزالة معظم الورم، يبقى مبلغ المتبقي. هذه الظاهرة تمثل الحالات السريرية الجراحين فيها غير قادر على إزالة الخلايا السرطانية التي تهاجر بسرعة بعيداً عن الكتلة الرئيسية وفي مناطق غير صالحة للعمل في الدماغ. تحرك MSCs العلاجية الكثيرة الارتحال نحو البؤر السرطانية المتبقية التي تبقى بعد الاستئصال الجراحي. لتسليم MSCs في تجويف الاستئصال، MSCs هي المصنف أولاً على جيش التحرير الشعبي الصيني، ومن ثم يوضع في بناء سقالة في تجويف بتر. وأكد وجود MSCs على السقالة بعد عملية الزرع بالتصوير فلوريسسينتلي بروتينات فلورية خضراء إشارة (رقم 3E). السابقين فيفو الدماغ كله صور تظهر الأبعاد سقالة بالنسبة إلى تجويف بتر (الرقم 3F-ح). السقالة يبدو أكبر بكثير عندما وضعت شقة، ولكن يمكن أن يكون مصبوب في شكل تجويف بتر أثناء غرس. بطلاء تجويف كامل، يتم تصغير المسافة MSCs العلاجية يجب أن تهاجر للوصول إلى بؤر الورم. بعد الجراحة، ويتم استخدام BLI لتتبع نمو الورم على مر الزمن، وتحديد فعالية لجنة السلامة البحرية-درب السقالة تسليمها.
الشكل 3: الممثل الصور الموضعية وبعد العملية الجراحية. A) الماوس تظهر سلسلة المضاعفات قبل شق. إينسيسيد ب) الماوس مع نافذة الجمجمة يكشف الورم الشامل. ج) مجال مشرق ونيون تراكب الصورة تبين موقع الورم. د) تجويف بتر بعد الجراحة مع بقايا البؤر الورم. ﻫ) المصنف سقالة "زرعها جيش التحرير الشعبي الصيني" مع MSC تريل. و) تشريحيا الدماغ الأنسجة مع سقالة مضافين. تراكب الفلورسنت ز) تسليط الضوء على الخلايا بروتينات فلورية خضراء تريل. ح) ماجنيفيد نسخة من أشرطة مقياس زاي = 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جراحة يمكن عادة تكتمل في غضون 30 دقيقة كل الماوس، نظراً لأن تؤخذ النقاط التالية في الاعتبار تحقيق أقصى قدر من الدقة، وتجنب المزالق تستغرق وقتاً طويلاً. أولاً، ضمان وضع الماوس بشكل صحيح في الصك ستيريوتاكسيك قبل بدء هذا الإجراء. حركات الرأس غير المرغوب فيها ستحد من دقة جراحية اوديما، موقع غرس الورم، ودرجة لاستئصال الورم. قبل الاستئصال، تماما إزالة الجزء من بلده دوراً يغطي الورم. دوراً صعباً، الليفي يصلب كما أنها تمنعه من خلال الاستنشاق. إذا تمت إزالة غير كامل، قد يكون دوراً تصلب الحد من تنقل نصيحة المضخة ومنع استئصال الورم كاملا. خلال الاستئصال، مستأصل الأوعية الدموية يتم غالباً دون قصد جنبا إلى جنب مع الورم، مما تسبب في نزيف كبير. الدم الزائد يقلل كثافة إشارة الفلورسنت ويحجب الورم. الحفاظ على رؤية الورم أثناء بتر يضمن القدر المناسب من بتر، ويحد من إزالة الأنسجة السليمة والنزيف الزائد. لتجاوز الهوامش أصغر، ري السفينة التالفة مع المالحة الباردة وتطبيق ضغط لطيف مع قضيب نصيحة القطن. وإذا استمر النزيف، حزمة عامل مرقئ في تجويف لمدة 2-3 دقائق ثم قم بإزالة بالملقط. ري مع برنامج تلفزيوني بعد ذلك لاستعادة الأس الهيدروجيني الفسيولوجي قبل غرس سقالة المصنف الخلية. عند الانتهاء من بتر والنزيف قد توقف، شرك النهائي إغلاق الجلد عدم كفاية الجرح. في أغلب الأحيان يحدث هذا بسبب الرطوبة الزائدة (برنامج تلفزيوني أو الدم) يمنع الغراء الجراحي من الترابط والجلد قطعي. تجنب هذا بتجفيف الجلد بلطف مع قضيب نصيحة القطن قبل تطبيق الغراء. من الممكن أيضا الصق الجلد مباشرة للجمجمة بطريق الخطأ إذا كانت الفجوة الجرح لا يعقد أولاً في موقف مغلقة مع الملقط قبل الالتصاق.
في ضوء هذه الاعتبارات، تنتج البروتوكول أعلاه متسقة وموثوق بها الخليج للحاسبات الآلية الجراحية ريسيكشنز التي تحاكي معيار العناية الدقيقة في فيفو اختبار الخلية الناشئة والعلاجات جزيء صغير. لا يزال، يمكن تعديل عدة عناصر لخدمة احتياجات تجريبية خاصة. على سبيل المثال، يمكن تعديل خصائص الورم مثل الحجم والموقع، ومدى الغزو بتغيير العدد الأولى وعمق حقن الخلايا، والوقت بين إنشاء الورم واستئصال، أو عن طريق تبديل خط خلية الورم نفسه. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء هذه الدراسة في الفئران athymic عارية النظام المناعي الشبهة التي تتسامح مع الخلايا البشرية. محصنة ضد الفئران المختصة قد يكون أكثر ملاءمة للدراسات باستخدام الماوس الخلايا.
مقارنة بنظام مغلق (أي، العظم أو ساترة هو وضع مرة أخرى)، اوديما المفتوحة القيام بها في هذا البروتوكول يقلل الضغط داخل الجمجمة (برنامج المقارنات الدولية). نظراً لزيادة برنامج المقارنات الدولية المسؤولة عن ظهور الأعراض بما في ذلك مصادرة، ستشهد الفئران إطالة أمد مصطنعة للبقاء على قيد الحياة في هذا النموذج. نماذج المستقبل بينما يتم تصغير الأثر سبب تأخير تطبيق مجموعات المراقبة والعلاج، يمكن إعادة إغلاق رفرف العظام استعادة برنامج المقارنات الدولية، وتحديد الدور الذي تؤديه في العلاج بالخلايا للخليج للحاسبات الآلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أوراق بيليغوز وباغو، وهينجتجين بالإنصاف في "المداواة فالكون" الذي رخصت جوانب الخلايا الجذعية والتكنولوجيا سقالة من UNC تشابل هيل.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بمساهمات تحريرية من د. كاثرين بيتروسيموني. جيش التحرير الشعبي الصيني السقالات صنعت بمختبر الدكتورة إليزابيث لوبا في جامعة ولاية كارولينا الشمالية. هذا العمل كان يدعمها صندوق أبحاث السرطان في جامعة مركز السرطان الشامل UNC لينبرجر ومتعدية UNC ومعهد العلوم الإكلينيكية (KL2TR001109، UL1TR001111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
References
- Adamson, C., et al. Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going. Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).
- Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E.
- Affronti, M., et al. Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy. Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).
- Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis. Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).
- Minniti, G., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients. Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Delgado-López, P., Corrales-García, E. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).
- Wu, X., et al. In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).
- Nakamizo, A., et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).
- Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro. Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).
- Park, S., et al. CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas. International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).
- Ho, I., et al. Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma. STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).
- Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. Stem cell-based therapy for malignant glioma. Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).
- Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems. Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).
- Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer. Biomaterials. 84, 42-53 (2016).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma. Biomaterials. 90, 116-125 (2016).
- Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer. Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
