Summary
여기, 선물이 성인 Schistosoma 나무에서 체 외에서 배양된 매체에 extracellular 소포 (EVs) 격리를 설명 하는 프로토콜.
Abstract
Extracellular 소포 (EVs)는 막 소포 세포 외 microenvironment로 셀의 다양 한 발표. EVs는 누구의 크기 범위 40 1000 nm 사이 이기종 vesicles의 인구를 나타냅니다. 축적 된 증거는 EVs에 중요 한 역할 규정 호스트 병원 체 상호 작용에 표시. Schistosome EVs에 대 한 깊은 이해는 기본 schistosomiasis에 대 한 새로운 전략의 개발을 활성화 하는 schistosome-호스트 상호 작용 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 해야 합니다. 여기, 우리는 성인 Schistosoma 나무 (S. 머 위)에서 절연 및 EVs의 특성화에 대 한 프로토콜을 제시 하 여 EVs 함수 schistosomes에 진학 하고자 합니다. EVs 문화 매체 체 외에 상업 exosome 격리 키트와 결합 하는 원심 분리를 사용 하 여 격리 했다. 고립 된 미 나무 EVs (SjEVs) 일반적으로 100-400 nm의 직경을가지고 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 및 서쪽 blotting에 의해 특징입니다. 염료-표시 된 SjEVs PKH67의 사용 SjEVs 받는 사람 세포에 의해 내 면화는 설명 했다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 성인 schistosomes;에서 EVs를 격리 하기 위한 대체 방법을 제공 한다 격리 된 SjEVs 기능 분석에 적합 수 있습니다.
Introduction
Extracellular 소포 (EVs)는 작은 막 도약 소포와 다양 한 단백질, 지질, 핵 산 캡슐화의 인구. 최근 연구 보여준 EVs 셀 셀 통신에 중요 한 역할을 하 고 셀 개발, 면역 조절, 신생, 세포 마이그레이션2, 등 수많은 생리 적 프로세스의 규칙에 관련 된 3,,45. 증거를 축적 EVs, exosomes, 그리고 그들의 miRNA 화물 순환 특정 질병6의 잠재적인 생체 나타냅니다 나타냅니다.
여러 가지 원생 동물 Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, 등 Leishmania spp., EVs;를 분 비 수 표시 되었습니다 helminths 발견 되었습니다 또한7호스트 생활에 EVs를 분 비. 기생 EVs pathogenicity8, 감염과 면역 규칙9의 유지 보수에 포함 될 표시 되었습니다. 최근 두 Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 schistosomes에서 공부와 미 나무12 성인 schistosomes 분 수 있는 exosome 같은 소포 비 표명 특정 생물 학적 과정의 기능 규정에 참여.
날짜 하려면, 여러 가지 방법은 extracellular 소포, ultracentrifugation, 외13, 폴리머 기반 시 약, 크기 배제 크로마토그래피, immunoaffinity 격리의 사용을 사용 되었습니다. 이러한 다른 방법을 그들의 자신의 이점 및 제한 사항14. 일반적으로, ultracentrifugation는 소포 격리에 대 한 표준 방법으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법은 잠재적인 EV 집계14의 한계에서 고통.
Schistosomes에서 방법의 몇 가지 EV 격리에 대 한 보고 되었습니다: ultracentrifugation11,,1210 와 여러 단계 (달걀16, 상업 EV 격리 키트16 를 사용 하 여 포함 됩니다 schistosomula11, 성인 schistosomes10,,1217). Microvesicles 천 나노미터 몇 백 나노미터 크기의 넓은 범위는, 그 주어진 우리 벤치 원심 분리기, 한, 그리고 분리에서 EVs 상업 킷은 절연을 사용 하 여 결합 하는 대체 방법 개발 성인 Schistosoma 나무. 격리 된 EVs는 일반적으로 100-400 nm의 직경을 소유 하 고 성공적으로 받는 세포에 의해 내 면화 했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험 상하이 수의학 연구소, 농업 과학의 중국 아카데미의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 (허가 번호: SHVRIAU-14-0101).
1. Schistosomes 의 생체 외에서 문화
참고: Schistosomes 는 생물을 나타냅니다. 노동자 때 생물 학적 재료 관련 웜, schistosomal 정지, 또는 다른 처리 시간 라텍스 장갑을 전혀 착용 해야 한다. 뉴질랜드 토끼 복 부 노출 통해 ~ 2000 cercariae 감염 되었습니다. 간 단계에서 schistosomes 토끼 간 및 mesenteric 혈관의 관류에 의해 감염 된 후 28 일에 미 나무 cercariae 감염에서 수집 했다. 웜 컬렉션의 절차 이전 간행물 쥐18연구 보고에서 참조 되어 있다.
- 500 mL 비 커에 기생충을 수집 합니다. 그들을 철저 하 게 세척 하 고 200 mL와 함께 부드럽게 3 x preheated (37 ° C) PBS (pH 7.4).
- 각 90 mm 페 트리 접시 ~ 200 벌레 쌍을 구분 합니다. 다음 기생충을 철저 하 게 세척 하 고 50 mL와 함께 부드럽게 2 x preheated (37 ° C) 페니실린과 스의 100 mg/mL의 U 100을 포함 된 RPMI-1640 문화 매체.
- 37 ° C 미만 5% CO2 ~ 5 웜 쌍 /mL 90 mm 페 트리 h 2의 조밀도에 접시에 항생제 없이 데워 RPMI 1640 문화 매체의 40 mL에 기생충을 유지 합니다.
노트: RPMI 1640 매체 혈 청을 포함 해서는 안, 그렇지 않으면 exogenous extracellular 소포를 소개 합니다.
2. 사전 처리 상태 미디어
- 문화 매체를 수집 하 고 계란을 제거 하 고 웜 tegmental 파편 30 분 2000 × g에서 4 ° C에서 매체를 원심.
- 신선한 튜브는 상쾌한 전송 하 고 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
- Dialyzed 가방에 필터링된 솔루션을 수집 (분자량 컷오프: 3.5kD)와 다음 하룻밤 4 ° C에서 8 %PEG8000 솔루션을 사용 하 여 솔루션을 dialyze.
노트: 이 단계는 SjEVs 절연의 수율을 높이기 위한 SjEVs을 풍부 하 게 하는 것이 중요.
3입니다. SjEVs의 격리
- 새로운 튜브에 dialyzed 솔루션을 전송 하 고 총 exosome 격리 시 약의 0.5 볼륨을 추가 합니다.
- 솔루션 vortexing 또는 솔루션의 동질성을 되도록 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- 2 ° C ~ 8 ° C에 혼합물을 밤새 품 어.
- 2 ° C 8 ° c에서 1 시간을 위한 15000 × g에서 혼합물을 원심
- 발음 하 고는 상쾌한 삭제.
노트: EVs (대부분의 경우에는 표시 되지 않음) 튜브의 하단에 펠 릿에 포함 됩니다. - 2 ml PBS의 EVs 펠 릿을 resuspend 하 고 추가 분석까지-80 ° C에서 EVs 솔루션을 저장 합니다.
4입니다. 서 부 Blotting에 의해 EVs의 특성
- SjEVs 샘플, 예, BCA 분석 결과 의해의 단백질 농도 결정 합니다.
- 22.5 µ L RIPA 버퍼에 EVs의 10-20 µ g을 준비 합니다. 그런 다음 버퍼와 95 ° c.에 5 분에 대 한 열 로드 x 4의 7.5 µ L을 추가
- 12 %SDS 페이지 젤에 의해 별도 SjEVs 단백질.
- PVDF 막에는 단백질을 전송 하 고 안티-CD63 항 체 (1:1, 000 희석), 뒤에 안티-토끼 IgG-HRP (1:5, 000 희석)와 프로브와 프로브.
- 막 개발을 위한 ECL 검출 시 약을 사용 하 고 화학 이미징 시스템에 의해 신호를 감지.
5. 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 EVs의 특성
- 200 메쉬 formvar 코팅 격자를 고립 된 SjEVs의 2 µ L을 추가 하 고 실 온에서 건조를 허용.
- 1 분에 대 한 Phosphotungstic 산 2 %stain 고 실 온에서 건조.
- 전송 전자 현미경 샘플 홀더에 격자를 로드 하 고 이미지 캡처에 대 한 80 kV 전자 빔에 노출.
6. SjEVs 레이블 PKH67와 셀 이해 분석 결과
노트: 달리 명시 하지 않는 한 모든 후속 단계 온도 (20-25 ° C)에서 수행 했다.
- 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 µ g SjEVs 솔루션을 전송 및 RPMI 1640 매체를 추가 하 여 12 mL을 볼륨을 조정.
- SjEVs 펠 렛을 4 ° C에서 90 분 동안 110000 × g에서 SjEVs 원심
- 원심, 후 신중 하 게는 상쾌한 발음.
참고: PKH67 ethanolic 염료 이기종 얼룩 및 감소 된 세포 생존 능력에 발생할 것이 SjEV 펠 릿에 직접 추가할 수 없습니다. - SjEV 펠 릿;에 희석제 C의 1 mL을 추가 하 여 2 x EV 정지 솔루션 준비 완전 한 분산 되도록 부드러운 pipetting으로 resuspend.
- 희석제 C, 얼룩이 지기 전에 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에서 희석제 C의 1 mL를 PKH67 ethanolic 염료 해결책의 2 µ L을 추가 하 고 분산을 잘 혼합 하 여 신선한 2x 염료 솔루션을 준비 합니다.
- 빠르게 EV 정지 (단계 6.4) 즉시 염료 솔루션 (단계 6.5) x 2의 1 mL를 혼합 샘플 pipetting 2 x의 1 mL를 추가 합니다.
- 4 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
- FBS의 4 mL를 추가 하 여 얼룩을 중지 하 고 1 분 동안 품 어.
- 12 mL을 볼륨을 조정 하 고 다음 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심을 RPMI1640 매체를 추가 합니다.
- 제거는 상쾌한 고 RPMI1640 매체 SjEV 펠 릿을 표시 하는 PKH67 resuspend를 추가 합니다.
- 한번 세척 한 후 PBS resuspend SjEVs 펠 릿을 추가 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심.
7. SjEVs 셀 이해 분석 결과
- NCTC 같은 종자 포유류 세포 1469 셀 또는 HEK293T 셀 6 잘 플레이트 (잘 당 2 × 105 셀)에 복제 하 고 하룻밤 셀 문화.
- 5 µ g PKH67 표시 SjEVs를 추가 하 고 2-4 h 37 ° C에서 세포 문화.
- 후에 부 화, 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 두 번 세척.
- 15 분 동안 4% 포름알데히드 솔루션 셀을 수정 하 고 PBS를 가진 더 두 번 세척.
- 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 세포 핵 얼룩.
- 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 관찰 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
설명 된 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 SjEVs의 수익률을 계량, 우리는 28 일 성인 schistosomes에서 고립 된 SjEVs의 단백질 농도 액세스할 수 BCA 단백질 분석 결과 사용. 표 1에서 같이, SjEV 단백질 농도의 매체 (표 1) 100 mL 당 250 µ g을 208 µ g에서 배열 했다. 입자 크기 Malvern 나노 분석에 의해 결정 된 대로 표시 된 격리 SjEVs 100에서 240 400 nm nm, 높은 인구 약 220 nm의 크기 (그림 1). 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 SjEVs의 더 특성 직경 (그림 2)에 약 100-200 nm의 둥근 소포를 되도록 EVs를 공개 했다. 분석을 더럽혀 서는 고립된 SjEVs 인식 되었다 CD63 항 체를 사용 하 여 일반적인 EV 표식 (그림 3)은 지적 했다. 형광 현미경 관찰 표시 PKH67 표시 SjEVs NCTC 클론 1,469 세포에 의해 내 면화 했다 SjEVs는 주로 받는 사람 세포 (그림 4)의 세포질에 배포 했다.
| 샘플 | EVs/100 ml 문화 매체 |
| # 1 | 250 µ g |
| # 2 | 208 µ g |
| # 3 | 220 µ g |
표 1: SjEVs 단백질 문화 매체에서 얻은; SjEVs 문화 매체의 100 mL 당 BCA 분석 결과 액세스 ~ 500 웜 쌍, 포함 된 양을 표시 됩니다.
그림 1 : 교양된 매체에서 SjEVs 절연 배포 크기. SjEVs 솔루션의 20 µ L 1000 µ L PBS; 희석 했다 그런 다음, 혼합 고성능 두 각도 입자 및 분자 크기 분석기를 사용 하 여 분석 했다. 표시 결과 3 개의 독립적인 격리에서 데이터의 대표 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 SjEVs의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : CD63 항 체에 대 한 격리 된 SjEVs의 분석을 더럽혀 서 부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 포유류 세포에 의해 SjEVs의. SjEVs 라는 PKH 셀 핵 파란색에서 표시는 녹색에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EVs에 대 한 최근 연구는 schistosome EVs 호스트 병원 체 상호 작용3,9,,1216에 중요 한 역할을 설명 했다. 추가 주소에 그들의 규정 하는 기능 필수적 이다 schistosomes에서 EVs를 분리. 여기, 우리 SjEV 절연을 위한 다른 방법을 설명합니다. 이 메서드 생성, SjEVs의 넓은 범위 크기 100에서 400 nm nm, 성인 미 나무에. 다음 셀 이해 분석 결과 EVs 설명된 프로토콜에서 고립 된 받는 사람 세포에 의해 성공적으로 내 면 그들의 관련 된 miRNAs 잠재적으로 규제 역할17재생 표시.
EVs, 셀의 많은 다른 종류에 의해 분 비 될 수 있습니다, 다양 한 종류의 체액19에 있습니다. 따라서, SjEV 분리의 과정에서 인위적으로 exogenous EVs를 소개를 방지 하는 것이 중요 하다. 예를 들어 문화 매체에는 혈 청이 없어야 합니다. 생체 외에서 문화에 벌레 밀도 잠재적인 스트레스 반응을 최소화 하 고 벌레의 사망률을 낮출 하 이어야 한다. 또한, 그것은 서로 다른 호스트에서 schistosomes 또는 벌레의 다른 단계 다른 EVs를 제공할 수 있습니다 주목 해야한다. 따라서, 유사한 호스트 환경에서 체 외 환경에서 기생충을 유지 하는 것이 필수적 이며는 SjEV에서 격리를 수행 하는 조건에 일치 해야 합니다. 또한, 우리는 분산 SjEVs 문화 스트레스로 인 한 관련의 가능성을 배제할 수 없습니다.
여기, 선물이 성인 schistosomes 2 h 생체 외에서 문화 미디어에서 SjEVs의 격리에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜의 장점은 짧은 문화 시간 기생충 노출은 비 생리 EV 분 비에서 발생할 수 있습니다 스트레스를 최소화 한다. 또한, 우리는 고립이 프로토콜에서 설명 된 대로 SjEVs이 SjEVs이 생물학적으로 활성17에 있을 수 있습니다 제안 받는 세포에 의해 내 면 것 했다 발견. 전반적으로, 현재 프로토콜 성인에서 SjEVs의 효율적인 절연 표준 실험실 장비를 사용 하 여 웜 및 그들의 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 특성 및 셀 이해 분석 결과 수 있습니다. 격리 된 EVs 호스트 병원 체 상호 작용의 추가 특성을 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는, 일부 또는 전체, 국가 자연 과학 재단의 중국 (31472187 및 31672550) 및 농업 과학, 농업 과학의 중국 아카데미의 기술 혁신 프로그램 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
