Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at producere en bispecific antistof GPC3-S-Fab i Escherichia coli. Renset GPC3-S-Fab har potent cytotoksicitet mod GPC3 positive leverkræft celler.
Abstract
Denne protokol beskriver opbygningen og funktionelle studier af en bispecific antistof (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs kan genkende to forskellige epitoper gennem deres to forskellige våben. bsAbs er blevet aktivt undersøgt for deres evne til at direkte rekruttere immunceller til at dræbe tumorceller. I øjeblikket, er fleste af bsAbs produceret i form af rekombinante proteiner, enten som Fc-holdige bsAbs eller som mindre bsAb derivater uden regionen Fc. I denne undersøgelse, var GPC3-S-Frederiksen, et antistof fragment (Fab) baseret bispecific antistof, designet af sammenkædning Fab af anti-GPC3 antistoffer GC33 med en anti-CD16 enkelt domæne antistof. GPC3-S-Fab kan være udtrykt i Escherichia coli og renset af to affinitet chromatographies. Renset GPC3-S-Fab kan specifikt binder til og dræbe GPC3 positive leverkræft celler ved at rekruttere natural killer celler, hvilket tyder på en potentiel anvendelse af GPC3-S-Fab i leverkræft terapi.
Introduction
Monoklonale antistoffer er nu bredt anvendt for kræft behandling1. På grund af fleksibiliteten af antistoffer, har forskellige antistof-baserede formater været aktivt udforsket. Sammenlignet med monoklonale antistoffer, har bsAbs to forskellige antigen bindende moduler, så de kan genkende to forskellige mål effektivt og samtidig udløse ansættelse af immun effektor celler til at målrette og dræbe tumor celler2.
Nuværende rekombinante bsAb formater kan tildeles generelt til to klasser: Fc-holdige bsAbs og bsAbs uden en Fc region. Sammenlignet med Fc-holdige formater, der er for det meste produceret i pattedyrceller, bsAbs uden en Fc region har fordele i mindre størrelser, mere let fremstilles i mikroorganisme udtryk systemer, og kan trænge tumor væv mere effektivt 3.
bsAbs uden en Fc region dannes normalt ved at sammenkæde individuelle bindende fraspaltning, single-kæde variable fragmenter (scFvs) eller funktionelle luftrumsblokke3. Uden de stabiliserende domæner, har bsAbs baseret på scFv fragmenter ofte kompromitteret termisk stabilitet, lav opløselighed eller et større potentiale for sammenlægning4,5. Derimod er Fab-baserede bsAbs mere stabil på grund af heterodimerization af CH1 og CL i native Fab gruppe4,6.
Variabel domæne fra heavy chain kun antistoffer (VHHs, også kaldet enkelt domæne antistoffer) er den aktive antigen-bindende fragment af naturlig tunge kæde antistoffer7. VHHs har de særlige kendetegn ved høj affinitet, specificitet af konventionelle IgGs8, lav immunogenicitet og høje udbytter i bakteriel udtryk9. Sammenlignet med Fv fragmenter, har VHHs højere termisk stabilitet10. Sammenlignet med Fab fraspaltning, har VHHs mindre størrelser på grund af manglende CH1 og CL. Således var S-Frederiksen, formatet bsAb opnås ved at sammenkæde Fab med et enkelt domæne antistof, VHH, designet og undersøgt for dets anti-tumor effekt11,12.
I denne undersøgelse, blev konstruktion af GPC3-S-Fab ved at sammenkæde Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 beskrevet. GPC3-S-Fab kan effektivt produceret af periplasmic udtryk i Escherichia coli (E. coli). Funktionelle studier af GPC3-S-Fab foreslog, at GPC3-S-Fab er en lovende strategi for leverkræft terapi. Fordele ved GPC3-S-Fab over alternative teknikker med relevante henvisninger til tidligere undersøgelser omfatter således let produktion og rensning og mere stabile bsAbs.
Pattedyr udtryk og prokaryote udtryk systemer har været anvendt til at udtrykke forskellige formater af BsAbs. I modsætning til pattedyr udtryk systemer, E. coli-baseret protein udtryk systemer har mange fordele, herunder høje udbytter, lave omkostninger og arbejdskraft-besparelse, lethed af genetiske manipulationer og høj transformation effektivitet15. For bsAbs udtryk i E. coli, der er to grundlæggende strategier: udtryk i cytoplasma og udtryk i periplasm mellem cytoplasma og ydre cellemembraner15. I forhold til den reducerende miljø af cytoplasma, er periplasm en mere oxiderende miljø, som fremmer den korrekte foldning og co udtryk for proteiner16. Korrekte folde spiller en nøglerolle i opløselighed, stabilitet og funktion generation af bsAbs. Derfor, en signal sekvensen pelB blev tilføjet til N-terminus af S-Fab direkte sekretion til periplasm af E. coli17. For at sikre ansat korrekt falsning, opløselighed, termisk stabilitet og konformationelle stabilitet, reducere kompleksiteten og størrelsen af et antistof er ofte16. S-Fab format består af en Fab og én VHH, som er udtrykt udmærket i bakteriel systemer sandsynligvis på grund af den simple struktur og lille størrelse.
GPC3 blev valgt i denne GPC3-S-Fab bispecific antistof format. Glypican-3 (GPC3) er et medlem af heparin sulfat (HS) proteoglycan familie, der er forankret til celleoverfladen via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 er overexpressed i 70% af hepatocellulært carcinom (HCC) sager, der tegner sig for størstedelen af leverkræft19,20,21,22. Fordi GPC3 er sjældent udtryk i normale væv, er GPC3 blevet foreslået som mulige mål for HCC. Flere mus mAbs tilsagnsskrivelser mod GPC3. Dog kun GC33 udstillet begrænset anti-tumor aktivitet 22, og det lykkedes ikke at udstille klinisk effekt hos patienter. I denne undersøgelse, var GPC3-S-Fab vist at kunne rekruttere NK celler for at dræbe GPC3 tumor celler14.
For at rekruttere NK celler, blev anti-CD16 VHH brugt. CD16a er en lav affinitet IgG receptor, udtrykt hovedsagelig af naturlige dræberceller (NK) celler, makrofager, monocytter og nogle undertyper af T-celler. Det er involveret i antistof-afhængige celle cytotoksicitet (ADCC) af NK celler23. NK celler kan inddeles i to typer, CD56 - CD16 + og CD56 + CD16-. I modsætning til CD56 + CD16− NK celler, CD56-CD16 + NK celler kan frigive højere niveauer af perforin og granzyme B og dermed udgøre en stærk cytotoksicitet24. Kupffer celler (KC), udtryk for CD16a, er de fastboende makrofager i leveren. Kupffer celler spiller en vigtig rolle i undertrykkelsen af leverkræft25. BsAbs rettet mod CD16a kan således være en mere lovende strategi end engagere sig T celler mod leverkræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, herunder menneskeblod samling blev godkendt af Sun Yat-Sen Universitet etisk komité.
1. GPC3-S-Fab Design strategi
- Design GPC3-S-Fab ved at sammenkæde en Fab af anti-GPC3 (humaniseret GC3313) med en anti-CD16 VHH14 (figur 1).
- Syntetisere og klone VH-CH1-CD16-VHH og VL-CL ind i pET26b og pET21a vektorerne som tidligere rapporteret12.
2. transformation og kultur
- Tilføj 100 ng af pET26b indeholdende VH-CH1-CD16 (figur 1A) og 100 ng af pET21a indeholdende VL-CL (figur 1A) i 100 µL af kompetente BL21 (DE3) celler. Bland godt og der inkuberes i isbad i 30 min. Incubate i vandbad 42 ° C til 45-90 s, overførsel, og der inkuberes i isbad i 3-5 min.
- Tilføje 500 µL af lysogeny bouillon (LB) medium ind i et rør, der indeholder BL21 (DE3) celler og derefter inkuberes ved 37 ° C, 150 rpm i 45-60 min. fordelt 100 µL af BL21 (DE3) celler på LB-agar plader der indeholder 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillin , og derefter inkuberes ved 37 ° C i 12-16 h.
- Forberede lysogeny bouillon (LB) medium: 1% wt/vol trypton, 0,5% wt/vol gærekstrakt, 1% wt/vol NaCl.
- Podes celler fra en enkelt koloni i 5 mL af super bouillon (SB) medium indeholdende 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillinog kultur ved 37 ° C, 220 rpm, natten over. Derefter, podes 1 mL af kultur i 100 mL af SB medium indeholdende 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillin og kultur ved 37 ° C, 220 rpm i 4 timer. Derefter, overføre 10 mL af kulturen i 1 L SB medium indeholdende 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillin og kultur ved 37 ° C, 220 rpm.
- Forberede super bouillon medium: 3,2% wt/vol trypton, 2% wt/vol gærekstrakt, 0,5% wt/vol NaCl.
- Når OD600 når 0,6 - tilføje 0,8, isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) til en slutkoncentration på 0,2 mM. Kultur ved 16 ° C, 180 rpm i 36-48 timer for periplasmic udtryk.
3. GPC3-S-Fab Periplasmic rensning
- Periplasmic brøkdel forberedelse
- Indsamle celler ved centrifugering på 4.000 x g, 4 ° C i 30 min, kassere mediet, og vejer cellerne.
- Resuspend celler grundigt i 4 mL iskold rørsukkeropløsning (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25% (wt/vol) saccharose og 1 mM af EDTA) pr. gram af celler, og der inkuberes i isbad i 15 min.
- Der centrifugeres ved 8.500 x g (bordplade centrifuge, fast vinkel rotor), 4 ° C for 20 min. Fjern supernatanten (saccharose brøkdel) og Gem den på is.
- Resuspend pellets i en blanding af iskoldt 5 mM af MgCl2 og 1 mM af PMSF (4 mL pr. gram celler). Tilføje 40 µL af lysozym stock (15 mg/mL) per gram, og der inkuberes i isbad i 30 min.
- Der centrifugeres ved 8.500 x g (bordplade centrifuge, fast vinkel rotor), 4 ° C i 20 min. overførsel supernatanten (den periplasmic fraktion) og gemme den på is.
- Kombinere saccharose fraktion og periplasmic fraktion, og centrifugeres ved 30.000 x g, 4 ° C i 30 min. Fjern supernatanten og gemme det i en 50 mL konisk slange på is.
- Ni-NTA affinitet rensning
- Resuspend 1 mL af Ni-NTA Agarosen ved at blande grundigt for at opnå en homogen suspension, fjerne 1 mL af Ni-NTA Agarosen til en frisk 15 mL konisk slange og tilføje 10 kolonne diskenheder (CV) ækvilibrering buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M af NaCl) til Reagensglasset.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min, og Fjern supernatanten omhyggeligt. Derefter tilføje Ni-NTA Agarosen i 50 mL tube indeholder saccharose fraktion og periplasmic fraktion. Rock ved 4 ° C i 2 timer.
- Centrifugeres blandingen på 400 x g, 4 ºC i 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten til en anden frisk iskold tube som den ubundne fraktion. Overføre Ni-NTA Agarosen i en tyngdekraft kolonne.
- Tilføje 10 CV af vask buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M af NaCl; 20 mM, 30 eller 40 mM for imidazol) til kolonnen, og indsamle elute som vask brøk.
Bemærk: Disse løsninger bør tilføjes i rækkefølge efter stigende koncentrationer af imidazol. - Tilføje 3 CV af eluering buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM af NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM eller 400 mM af imidazol) til kolonnen og indsamle elute som eluering fraktion 1, 2, 3 og 4.
Bemærk: Disse løsninger bør tilføjes i rækkefølge efter stigende koncentrationer af imidazol. - Dialyse eluted fraktioner i 2 L af PBS (137 mM af NaCl, 2,7 mM af KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM af KH2PO4, pH 7,4) ved hjælp af dialyse slanger (12,4 kDa) ved 4 ° C for 2 h. kontrollere tilstedeværelsen af GPC3-S-Fab med 12% SDS-PAGE og derefter ved Coomassie blå farvning.
- IgG CH1 affinitet rensning
- Der overføres 1 mL af IgG-CH1 affinitet harpiks i en 50 mL konisk slange, og vaske perler med PBS først. Tilføj derefter de dialyzed løsning indeholdende GPC3-S-Fab efter trin 3.2.6. Rock ved 4 ° C i 2 timer.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min, 4 ° C. Omhyggeligt fjernes supernatanten til en anden frisk iskold tube, og Ionbyttermaterialet overføres til en kolonne med tyngdekraften.
- Tilføje 10 CV af vask buffer (PBS) til kolonnen, og indsamle eluering som vask brøk.
- Forberede indsamling rør ved at tilføje 1 M af Tris pH 9,0 (0,1 mL pr. mL af hver eluted fraktion). Elueres med 3 CV eluering buffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2.7), og samle den eluted fraktion; Gentag 3 gange.
- Dialyse eluted fraktioner i 2 L af PBS ved hjælp af dialyse slanger (12,4 kDa) ved 4 ° C for 2 h. gentage to gange.
- Bestemme proteinkoncentration ved ultramicrospectrophotometer (molær ekstinktion koefficient: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).
4. SDS-PAGE og Western blotting analyse
- Tag en 10 µL af prøven i 5 x SDS loading bufferen og bland godt. Kog protein blandingen ved 100 ° C i 5 min.
- Forberede 5 x SDS loading bufferen: 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromophenol blå, 50% vol/vol glycerol, 5% vol./vol. beta-mercaptoethanol.
- Forberede en SDS-PAGE gelen med laste gel (5%) og adskillelse gel (12%) som tidligere beskrevet26,27,28.
- Indlæse 10 µL af kogt protein blanding og protein markør, og køre SDS-PAGE.
- Pletten gel ved at ryste kolben i 20 min. med Coomassie strålende blå løsning, og derefter udføre affarvning.
- For western blotting efter overførsel til en PVDF membran, blokere membran med TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM af NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol skimme mælk i 1 time ved stuetemperatur under omrystning.
- Inkuber membran med primære antistoffer (anti-hans eller anti-Flag) fortyndet 1:2,000 i TBST + 5% skummetmælk til 1 h.
- Vask med TBST i 5 min ved stuetemperatur, og Gentag 3 gange.
- Inkuber membran i sekundær antistof (HRP-linked anti-mus Fc antistof) fortyndet 1:2,000 i TBST + 5% skummetmælk til 1 h.
- Vask med TBST i 5 min ved stuetemperatur, og Gentag 3 gange.
- Der tilsættes 1 mL af HPR substrat pr. film, udvikle og tage billeder.
5. gel filtrering analyse
- Brug de følgende kolonne: kolonne volumen af 24 mL; Ækvilibrering buffer af PBS pH 7,4; Strømningshastigheden af 0,5 mL/min. ved værelse tempereret; Sample volumen af 200 µL.
- Brug følgende protein volumen og koncentration: 500 µL af 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 30 min, og tage 200 µL til at indlæse.
- For protein markør volumen og koncentration, tage 100 µL af cytokrom C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL af der (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL af albumin (10 mg/mL, 66 kDa) og 200 µL af alkoholdehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) ind i et rør. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 30 min, og tage 200 µL til at indlæse.
- Før hvert løb, vask med mindst 2 CV destilleret vand med en væskehastighed på 0,5 mL/min.
- Blandingen henstår kolonnen med mindst 2 af ækvilibrering buffer (PBS, pH 7,4) med en væskehastighed på 0,5 mL/min CV.
- Automatisk injicere prøve på 0,5 mL/min. at indlæse prøven.
- Elueres med ækvilibrering buffer på 0,5 mL/min og opdage på 280 og 215 nm.
6. flow flowcytometri analyse
- Kultur HepG2 (GPC3 positive), Hep3B (GPC3 positive), Huh7 (GPC3 positive), og MHCC - 97H (GPC3 negativ) celler i 100 mm x 20 mm plastik skåle, som indeholder DMEM medium med 10% føtal bovint serum (FBS), (100 µg/mL) penicillin og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur CHO (GPC3 negativ) celler og CHO/GPC3 celler husly i fuld længde menneskelige GPC3 cDNA (GPC3 positive) i 100 mm x 20 mm plastik skåle, som indeholder RPMI 1640 medium med 10% FBS, (100 µg/mL) penicillin og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur NK92/CD16 husly i fuld længde menneskelige CD16 cDNA (CD16 positive) i 25cm2 kolbe indeholdende RPMI 1640 medium med 10% FBS, (100 µg/mL) penicillin og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Når cellerne er 70-90% sammenflydende, kassere medium og cellerne vaskes med 2 mL PBS. Der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 2-3 min. (eller indtil cellerne begynder at løsne sig fra overfladen). Der tilsættes 1 mL af den komplette vækstmediet at neutralisere trypsin og cellerne genopslæmmes af pipettering forsigtigt op og ned.
- Tælle celle tal ved hjælp af en Neubauer hemocytometer og opdage cellernes levedygtighed af Trypan blå.
- Indsamle 3 x 106 celler for hver cellelinje. Der tilsættes 1 mL PBS + 0,2% BSA til cellerne genopslæmmes. Der centrifugeres ved 200 x g, 4 ºC i 5 min. Gentag to gange.
- Der tilsættes 0,3 mL PBS + 0,2% BSA til cellerne genopslæmmes, og overføre 100 µL (ca 1 millioner) til hver 5 mL polystyren runde-nederste rør.
Bemærk: Sørg for at alle skridt herfra til rør bør holdes kold på is. Når antistoffet er bindende for celle overflade antigen, vil komplekset begynde at internalisere. Ved at holde det koldt, er processen bremset betydeligt. - Tilføje 10 µL af primære antistoffer (GPC3-S-Fab eller menneskelige IgG1, slutkoncentration 5 µg/mL) til hver tube, og der inkuberes i isbad i 1 h.
- Der tilsættes 1 mL PBS + 0,2% BSA wash, og centrifugeres ved 200 x g, 4 ºC i 5 min. Gentag tre gange.
- Genopslæmmes i 100 µL af PBS + 0,2% BSA, og derefter tilføje 0,5 µL af sekundær antistof (-anti-humant IgG(H+L)-488, endelige koncentration 10 µg/mL) og der inkuberes i isbad i 1 h. Bemærk: fra dette trin, skal du holde cellerne fra lyset.
- Der tilsættes 1 mL PBS + 0,2% BSA wash, og centrifugeres ved 200 x g, 4 ºC i 5 min. Gentag tre gange.
- Analysere cellerne af flow forskellige ifølge standardprotokol29. Erhverve celler med en 488 nm laser for excitation.
7. cytotoksiske Assays
- Forberede tumorceller.
- Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H og CHO cellelinjer, som beskrevet i trin 6.1-6.5.
- Fortyndes celler til 0,5 × 105/mL, og pladen 100 µL celler (5.000 celler pr. brønd) på 96-brønd plader. Kultur 6-8 h for at tillade cellerne til at vedhæfte.
- Forberede humant perifert blod mononukleære celler (PBMC).
- Fortynd frisk tilberedte blod med et lige saa stort volumen af PBS i en 50 mL konisk slange. For eksempel, fortyndes med 10 mL PBS 10 mL blod.
- Tage 15 mL af lymfocyt adskillelse mellem en frisk 50 mL konisk slange. Overføre den fortyndede blod på lymfocyt adskillelse medium langs røret langsomt.
Bemærk: Holde røret lodret. Ikke bryde overfladen af lymfocyt adskillelse medium. - Centrifugeres ved 400 x g for 35 min ved stuetemperatur med bremsen.
- Langsomt fjerne det øvre plasma lag, og tage det hvide blodlegemer lag indeholdende PBMC ved plasma-lymfocyt adskillelse medium grænsefladen.
- Fortynd PBMC med en dobbelt volumen af PBS + 2% FBS. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
- Cellerne vaskes to gange med PBS + 2% FBS. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min. tælle celle tal som beskrevet i trin 6.5.
- Forberede NK-celler.
- Forberede PBMC suspension i en koncentration på 5 x 107 celler/mL i PBS + 2% FBS, og sted dem i et 5 mL polystyren runde-nederste rør.
- Tilføje menneskelige NK celle berigelse Cocktail på 50 µL/mL af celler. Bland godt, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Resuspend den magnetiske partikler fra NK celle berigelse kit og bland godt på at sikre, at de er ensartet suspenderet af pipettering op og ned kraftigt mere end 5 gange. Overføre den resuspenderede magnetiske partikler på 100 µL/mL til cellesuspension. Bland godt, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Bringe cellesuspension op til et volumen på 2,5 mL ved at tilføje PBS + 2% FBS. Bland cellerne i røret af forsigtigt pipettering op og ned ad 2 - 3 gange. Placere røret (uden en hætte) i magneten. Lad de magnetiske perler nøjes 2,5 min ved stuetemperatur.
- Fjerne magneten. I en kontinuerlig bevægelse, inverter tube, hælde ud beriget cellesuspension ind i et nyt rør.
- Tælle celle tal som beskrevet i trin 6.5.
- Oprettet den cytotoksiske reaktion.
- Fortynd NK-celler til 5 × 105 celler/mL ved hjælp af det tilsvarende næringssubstratet. Tilføje 100 µL af NK cellesuspension til tumorcellerne belagt på en 96-brønd plade.
- Tilføje 10 µL af GPC3-S-Fab ved forskellige koncentrationer, med den højeste dosis i en endelig koncentration på 30 µg/mL, 3-fold fortynding, 9 point (tre gange).
- Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 72 timer.
- Efter 72 h inkubation, fjerne medium, og tilsæt 100 µL af DMEM medium indeholdende 10 µL CCK8 reagens til hver brønd i 96-brønd plader, og derefter inkuberes ved 37 ° C.
- Læs plade ved 450 nm ved 1, 2, 3 og 4 h efter tilsætning CCK8 reagens.
- Analysere dataene. Beregne overlevelsesraten som (OD450 GPC3-S-Fab + effektor + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100% og (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100%. Effektor celler er celler, NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab rensning
GPC3-S-Fab blev renset fra E. coli ved en to-trins affinitet rensning, først med Ni-NTA-agarosegelelektroforese, efterfulgt af IgG-CH1 affinitet rensning. Efter to-trins affinitet rensning, blev GPC3-S-Fab renset for homogenitet med de to kæder tæt på 1:1 (figur 2A). Tilstedeværelse af både VH-CH1-CD16 VHH og VL-CL polypeptider kan identificeres ved deres adskilte C-terminale tags, anti-hans for VL-CL ca 25 kDa og anti-Flag for VH-CH1-VHH ca 38 kDa (figur 2B). Efter to-trins affinitet rensning, kan ~1.2 mg protein fås fra 1 L SB kultur. For at yderligere karakterisere renset GPC3-S-Fab, blev gel filtrering udført. Baseret på de standard markører (figur 2 c), blev GPC3-S-Fab identificeret som en homogen monomer i form af en heterodimer med en molekylær størrelse af ca 63 kDa (figur 2 c).
GPC3-S-Fab bindende aktiviteter
For at vurdere, om GPC3-S-Fab genkender GPC3-positive celler og CD16-positive celler, blev flow flowcytometri analyse foretaget ved hjælp af GPC3-positive lever kræft cellelinjer HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 og GPC3-negative leverkræft cellelinie, MHCC - 97H, og CHO celler. GPC3-S-Fab kunne binde sig til alle GPC3-positive celler, men med svagere binding til Hep3B (figur 3B) og Huh7 celler (figur 3 c) end at HepG2 (figur 3A) og CHO/GPC3 (figur 2F). Ingen eller minimal binding til GPC3-negative MHCC - 97H og CHO celler blev observeret (figur 3D, 3E). GPC3-S-Fab også kunne binde sig til CD16-positive celler, NK92/CD16 celler (figur 3 g). Disse resultater er konsistente med tidligere resultater ved hjælp af andre anti-GPC3 antistoffer30, tyder på, at GPC3-S-Fab specifikt kan binde GPC3-positive cellelinjer og CD16-positive celler.
For at evaluere cytotoksicitet af GPC3-S-Frederiksen, blev tumorceller udruget med friske isolerede NK celler med forskellige koncentrationer af GPC3-S-Fab. Uden NK celler havde GPC3-S-Frederiksen ingen cytotoksicitet mod tumorceller uanset GPC3 udtryk status (figur 4). I nærværelse af NK celler, GPC3-S-Fab udløste stærk cytotoksicitet mod HepG2, Hep3B og Huh7 celler i en dosisafhængig måde men viste ingen effekt på GPC3-negative MHCC - 97 H celler (figur 4), tyder på, at cytotoksicitet af GPC3-S-Frederiksen afhænger af GPC3 udtryk på tumor celle overflade.
Figur 1. Konstruktioner af GPC3-S-Frederiksen
(A) den bakterielle udtryk konstruktioner af GPC3-S-Fab. Konstruktioner indeholder en pelB signal sekvensen, en humaniseret anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (tunge kæde), eller en VL-CL (lys kæde). For at lette registrering af protein og rensning, blev et Flag tag eller en His8 tag føjet til C-terminus. (B) Diagram af GPC3-S-Fab efter Co udtryk.
Figur 2. GPC3-S-Fab rensning fra E. coli.
(A) venstre panel, efter Ni-NTA affinitet kromatografi; Højre panel, efter anti-IgG-CH1 affinitet kromatografi; Møller, molekylvægt stigen; Coomassie blå farvning. (B) venstre panel, efter Ni-NTA affinitet kromatografi; Højre panel, efter anti-IgG-CH1 affinitet kromatografi; Møller, molekylvægt stigen; Western Blotting. (C) Gel filtrering analyse af GPC3-S-Fab. Toppanelet, standard markører; nederste panel, GPC3-S-Fab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. GPC3-S-Fab genkender GPC3 positive celler og CD16-positive celler.
Flow flowcytometri analyse af HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) og NK92/CD16 (G) celler blev udført som beskrevet i protokollen. Rød linje: tumor celler kun; Grønne linje: isotype kontrol, tumor celle + menneskelige IgG1 + -anti-humant IgG(H+L)-488; blå linje: tumor celle + GPC3-S-Fab + -anti-humant IgG (H + L)-488. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. GPC3-S-Fab fremmer celledød af GPC3-positive kræftceller.
Dosisafhængig cytotoksicitet assays blev udført som beskrevet i protokollen for HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), og MHCC - 97 H (D). Koncentrationerne af GPC3-S-Fab var fra 0.0045 µg/mL til 30 µg/mL. Dataene er gennemsnittet af tre med fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Massiv cirkel, kun GPC3-S-Frederiksen; solid square, GPC3-S-Fab+ NK, NK-celler (50.000 pr. brønd) og target-cellerne (5.000 pr. brønd). Blandingerne var inkuberes i 72 timer før cytotoksicitet måling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse, præsenterer vi en strategi for at konstruere et nyt format for bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan ansætte NK-celler rettet mod GPC3 positiv tumorceller. S-Fab er baseret på naturlige Fab format ved at tilføje en anti-CD16 VHH11,12. Sammenlignet med bsAbs indeholdende Fc region, kan GPC3-S-Fab nemt blive produceret i periplasm af bakterier på en stor skala.
Bruger den proteinekspression og -oprensning strategi er beskrevet i protokollen, opnåede vi en opløselig og funktionel GPC3-S-Fab i store mængder. For at lette periplasmic udtryk, blev en signal sekvensen pelB tilføjet til N-terminus direkte sekretion til periplasm af E. coli17. I modsætning til cytoplasma, mere oxiderende miljøet i det periplasmic rum mellem cytoplasmatisk og ydre membraner er udstyret med en række proteiner vigtigt for proteinfoldning og forsamling og dermed fremmer den korrigerende foldning og opløseligheden af rekombinante proteiner16. Men maskiner til eksport til periplasm i E. coli og proteinfoldning har begrænset kapacitet. Høj udtryk for rekombinante proteiner ofte resulterer i ophobning af uopløselige produkt i periplasm16. For at undgå den høje udtryk for protein i en kort periode, blev lav IPTG (0,2 mM) og lav temperatur (16 ° C) i nærende medium anvendt i denne protokol at undgå ophobning af uopløselige protein. I denne undersøgelse, var ~1.2 mg protein fremstillet af 1 L af medium, forbedre udbyttet mindst 2-fold sammenlignet med tidligere værker12.
For at undgå protein nedbrydning, skal alle fraktioner der indeholder GPC3-S-Fab i forskellige trin holdes på is. Med hans mærke på C-terminalen VL-CL, Ni-NTA-Agarosen blev brugt til rensning. Enkelt Ni-NTA-Agarosen rensning er imidlertid ikke tilstrækkelig til at fjerne uønskede proteiner, såsom uparret VL-CL protein. For at rense den homogene heterodimerisk GPC3-S-Frederiksen, det andet trin, blev anti-IgG-CH1 affinitet rensning, anvendt. Den renset protein havde høj renhed og to polypeptider tæt på 1:1 (figur 2A-2B).
Gel filtrering kromatografi kan bestemme Molekylær vægten af proteiner baseret på deres molekylære størrelser og figurer; analysere renhedsgraden; og afgøre, om den renset protein er en monomer dimer, eller sammensat af aggregater15. Ved gel filtrering kromatografi, blev GPC3-S-Fab identificeret med den forventede molekylære størrelse af ca 63 kDa, som er i form af en monomer med heterodimerization af GPC3-S-Frederiksen (figur 2 c).
Flowcytometri kan afgøre, om et antistof kan binde sin antigen på cellemembranen, sammenlignet med traditionelle western blotting og ELISA, som kun opdager antigen-antistof bindende reaktioner. Af analysen af handelsstrømmen flowcytometri anerkendt GPC3-S-Fab GPC3 på cellemembranen, tyder på GPC3-Fab gruppe var funktionel. Når du udfører flow flowcytometri analyse, er det afgørende at holde alle trin på is eller ved 4 ° C, når antistoffet er tilføjet. Når antistoffet binder sig til celle overflade antigen, indleder antigen-antistof kompleks internalisering. Ved at holde det koldt, er internalisering processen bremset betydeligt.
PBMC og NK-celler blev effektivt isoleret fra humant perifert blod ved centrifugering ved hjælp af lymfocyt adskillelse medium, efterfulgt af magnetisk aktiveret celle sortering strategier. GPC3-S-Fab viste potent cytotoksicitet mod GPC3 positive celler, når forholdet mellem NK celler til target-cellerne (tumorceller) var 10:1, og forholdet mellem NK celler til target-cellerne kan variere fra 50: 1 til 5:1.
Sammenfattende giver GPC3-S-Frederiksen, der kan produceres i en mikroorganisme ekspressionssystem, en ny avenue for at oprette funktionelle formater af bsAbs mod tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev økonomisk støttet af R & D planlægger i Guangdong provinsen (PR Kina) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
