Summary
नमूना तैयारी प्रक्रियाओं के दौरान क्रिस्टलीय संरचनाओं के सुधार के द्वारा मालदी मास स्पेक्ट्रोमेट्री में कार्बोहाइड्रेट आयन संकेतों को बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है ।
Abstract
नमूना तैयारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) कार्बोहाइड्रेट का विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है । हालांकि मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization (मालदी) एमएस कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण में पसंद की विधि है, गरीब आयन संकेत और कार्बोहाइड्रेट नमूनों की डेटा reproducibility गंभीर समस्याओं होना जारी है । कार्बोहाइड्रेट के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक प्रभावी विश्लेषणात्मक बेहतर डेटा गुणवत्ता प्रदान प्रोटोकॉल आवश्यक है । इस वीडियो नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को दर्शाता है संकेत तीव्रता में सुधार और कार्बोहाइड्रेट के डेटा भिंनता मालदी में कम-एमएस । सुखाने और नमूना बूंदों के क्रिस्टलीकरण के बाद, मेथनॉल द्वारा बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण से पहले के रूप में स्फटिक आकृति सुधार है । मालदी इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) के साथ कार्बोहाइड्रेट सिग्नल में बढोतरी की जांच की जाती है । प्रयोगात्मक परिणाम बताते है कि क्रिस्टल सुधार क्रिस्टलीय संरचनाओं समायोजित कर देता है और कार्बोहाइड्रेट analytes पुनर्वितरित । पारंपरिक मालदी-MS में सूखे छोटी बूंद तैयारी विधि के साथ तुलना में, मेथनॉल के साथ कार्बोहाइड्रेट क्रिस्टल morphologies सुधारना काफी बेहतर संकेत तीव्रता, आयन छवि वितरण, और डेटा स्थिरता से पता चलता है । चूंकि प्रोटोकॉल का प्रदर्शन इस के साथ साथ नमूना संरचना में परिवर्तन शामिल नहीं है, वे आम तौर पर विभिंन कार्बोहाइड्रेट और मैट्रिक्स के लिए लागू होते हैं ।
Introduction
कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण एक महत्वपूर्ण और चुनौतीपूर्ण विषय है । कार्बोहाइड्रेट और उनके डेरिवेटिव जीव1,2,3रहने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन अणुओं जटिल संरचनाओं है और विघटित होने की संभावना है । उनमें से कई स्पष्ट रूप से जुदाई और पता लगाने में कठिनाइयों के कारण विशेषता नहीं हो सकती । हालांकि मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption/ionization (मालदी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), अपनी संवेदनशीलता और सुबोध परिणाम4के कारण, के लिए एक विस्तृत श्रृंखला के विश्लेषण के लिए लागू किया गया है मालदी-MS का उपयोग कर कार्बोहाइड्रेट का विश्लेषण जारी ऐसे अणुओं की कम ionization क्षमता के कारण एक प्रमुख चुनौती हो5. रासायनिक derivatization कार्बोहाइड्रेट6,7की ionization दक्षता में सुधार करने के लिए एक आम तरीका है, लेकिन इस तरह की प्रक्रियाओं समय और नमूना लेने हैं । इसके अलावा, derivatized कार्बोहाइड्रेट की ionization क्षमता अभी भी प्रोटीन की तुलना में कम है । इस प्रकार, जटिल प्रक्रियाओं के बिना मालदी-MS में कार्बोहाइड्रेट संकेत को बेहतर बनाने के लिए विधियों का विकास आवश्यक है ।
मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मालदी-MS के आवेदन एक और चुनौतीपूर्ण विषय है । मालदी-MS की एक प्रमुख समस्या यह है कि इसकी संवेदनशीलता और डेटा reproducibility नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक मापदंडों पर गंभीर रूप से निर्भर करता है । कई मामलों में, मात्रात्मक विश्लेषण द्वारा मालदी-MS विषम नमूना morphologies और analyte वितरण के कारण अविश्वसनीय है । एक अच्छी तरह से ज्ञात उदाहरण के एक 2, 5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) मालदी मैट्रिक्स के साथ तैयार नमूनों है । जब DHB परिवेश वातावरण के तहत धीरे से सघन है, मैट्रिक्स क्रिस्टल में analyte निगमन की हद तक अप्रत्याशित है, क्योंकि परिणामी नमूने अनियमित morphologies दिखाते हैं । ऐसे नमूने आम तौर पर बड़े सुई के आकार का और ठीक क्रिस्टल से मिलकर बनता है । जब DHB एक अस्थिर विलायक और/या एक गर्म नमूना प्लेट, अधिक सजातीय ठीक क्रिस्टल और बेहतर मात्रात्मक परिणाम8,9,10में एक तेजी से सुखाने प्रक्रिया परिणाम का उपयोग कर तैयार किया जाता है । इस तकनीक को मालदी नमूनों के "पुनर्क्रिस्टलीकरण" के रूप में जाना जाता है । सुधार तेजी से क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के दौरान ठीक मैट्रिक्स क्रिस्टल में analytes के बेहतर शामिल करने के लिए जिंमेदार ठहराया है । हम यह भी दिखा दिया है कि नमूना तैयारी पर्यावरण समायोजित कार्बोहाइड्रेट संकेत और बेहतर मात्रात्मक परिणाम11,12के विविधता कम । इन कार्यों में निष्कर्षों का सुझाव है कि नमूना आकृति विज्ञान कार्बोहाइड्रेट संकेत गुणवत्ता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । दैनिक विश्लेषण, बेहतर कार्बोहाइड्रेट संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए एक कुशल नमूना सुधार विधि के लिए एक सामान्य रणनीति विकसित करने के लिए आवश्यक है ।
हम व्यवस्थित हाल ही में एक रिपोर्ट13में मालदी-MS में नमूना आकृति विज्ञान और कार्बोहाइड्रेट संवेदनशीलता के बीच सहसंबंध की जांच की है । कई महत्वपूर्ण कार्बोहाइड्रेट और मैट्रिक्स का उपयोग कर प्राप्त परिणाम बताते है कि सबसे अच्छा संकेत संवर्धन सूखे मालदी नमूनों क्रिस्टलीकरण द्वारा पूरा हो गया है । पारंपरिक सूखे छोटी बूंद (डीडी) विधि का उपयोग कर तैयार नमूनों की आकृति विज्ञान मेथनॉल (MeOH) के साथ तेजी से क्रिस्टलीकरण द्वारा सुधार हुआ है । विस्तृत नमूना तैयारी प्रोटोकॉल यहां प्रदर्शन कर रहे हैं । प्रोटोकॉल तीन मुख्य चरणों, नमूना प्लेट कंडीशनिंग, नमूना जमाव और क्रिस्टलीकरण, और जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण सहित, के होते हैं । उपयोग कार्बोहाइड्रेट sialyl-लुईस ए (SLeए) और maltoheptaose (MH) शामिल हैं । DHB एक मॉडल मैट्रिक्स के रूप में प्रयोग किया जाता है । परिणाम बताते है कि कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता और स्थानिक वितरण स्पष्ट रूप से क्रिस्टलीकरण के बाद सुधार हुआ है । इस तरह की विधि 2, 4, 6-trihydroxyacetophenone (THAP) और α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड सहित अन्य लोकप्रिय मैट्रिक्स के साथ नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । इस विधि एक सामांय दृष्टिकोण है कि आसानी से कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला दिनचर्या में एकीकृत किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है ।
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Protocol
1. नमूना प्लेट कंडीशनिंग
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नमूना प्लेट की सफाई
- सफाई के दौरान नमूना प्लेट के संदूषण से बचने के लिए nitrile दस्ताने पहनें ।
- हाथ से धो लें १००.० मिलीलीटर के डिटर्जेंट समाधान के साथ नमूना प्लेट (१.० मिलीग्राम/एमएल) ।
- हाथ-आसुत जल (DDW) के साथ नमूना प्लेट धो लें ।
- MeOH के ३०.० मिलीलीटर के साथ नमूना प्लेट सतह कुल्ला ।
- एक ६०० मिलीलीटर चोंच में नमूना प्लेट रखो और जब तक नमूना प्लेट पूरी तरह से पानी में डूब गया है DDW के साथ भरें ।
- एक अल्ट्रासोनिक स्नान में चोंच रखो ( सामग्री की तालिका देखें) और 15 मिनट (२०० डब्ल्यू, ४० kHz) के लिए नमूना प्लेट sonicate ।
- नमूना प्लेट बाहर ले लो और पानी से उड़ा दबाव नाइट्रोजन का उपयोग कर गिरता है ।
- जमा ०.२ µ l का नमूना प्लेट पर MeOH की जांच करें कि क्या MeOH अंय स्थानों के लिए फैलता है ।
नोट: यदि MeOH अन्य स्थानों के साथ विलीन हो जाता है, तो चरण 1.1.3-1.1.5 दोहराएँ; यदि नहीं, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
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सुखाने चैंबर तापमान का विनियमन
- सूखी बूंदों को स्थिर शर्तों के तहत एक सुखाने चैंबर का प्रयोग करें, जैसा कि पहले11,12,13वर्णित है । विशेष रूप से, चरण 2.1-2.5 के Ou, Y.-M में वर्णित विस्तृत कार्यविधि का उपयोग करें । एट अल. २०१६12. संक्षिप्त:
- एक निरंतर प्रवाह की दर पर कमरे के तापमान नाइट्रोजन से सुखाने चैंबर पर्ज एक कम रिश्तेदार आर्द्रता वातावरण बनाए रखने के लिए ।
- नियमित रूप से पर नमूना प्लेट तापमान लगातार रखें-(25 डिग्री सेल्सियस) या तेजी से सुखाने की स्थिति (५० डिग्री सेल्सियस), सुखाने कक्ष में एक तापमान नियंत्रित तांबे ब्लॉक द्वारा विनियमित ।
- सूखी बूंदों को स्थिर शर्तों के तहत एक सुखाने चैंबर का प्रयोग करें, जैसा कि पहले11,12,13वर्णित है । विशेष रूप से, चरण 2.1-2.5 के Ou, Y.-M में वर्णित विस्तृत कार्यविधि का उपयोग करें । एट अल. २०१६12. संक्षिप्त:
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मैट्रिक्स और analyte समाधान की तैयारी
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मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
- भंग DHB में ५०% acetonitrile (ACN): 50% DDW एक ०.१ मीटर समाधान तैयार करने के लिए ।
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कार्बोहाइड्रेट analytes की तैयारी
- भंग SLeएक में 10-4 एम समाधान तैयार करने के लिए DDW ।
- DDW में महाराष्ट्र भंग एक 10-4 एम समाधान तैयार करने के लिए ।
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मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
2. नमूना जमाव और क्रिस्टलीकरण
नोट: नमूनों की छोटी और नियमित मात्रा का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित प्रक्रियाएं यहां बताई गई हैं । सुनिश्चित करें कि नमूना प्लेट तापमान समाधान जमा करने से पहले वांछित तापमान पर स्थिर है । यदि नमूना क्रिस्टलीकरण के दौरान अन्य नमूना स्पॉट को कवर करने के लिए एक बड़े क्षेत्र पर फैलता है, एक नया नमूना तैयार करें या दोहराएँ चरण १.१.
-
नमूना की एक छोटी राशि (०.१ µ l) के विश्लेषण के लिए
नोट: निम्न चरणों का नमूना और समय की खपत को न्यूनतम करने के लिए विकसित किया गया है । यह एक सीमित राशि या ठहराव विश्लेषण के लिए जल्दी आईएमएस के साथ वास्तविक नमूनों की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।- Premix ०.२५ µ l के DHB हल और ०.२५ µ l के SLeएक या MH हल के एक microcentrifuge ट्यूब में.
- भंवर मिश्रित समाधान 3 एस के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ।
- 2 एस (२००० एक्स जी) के लिए एक मिनी केंद्रापसारक में मिश्रित समाधान नीचे स्पिन ।
- मिश्रित समाधान के ०.१ µ l को आकर्षित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और तुरंत यह नमूना प्लेट पर जमा ।
नोट: नमूना की एक छोटी राशि जमा करते समय, 10 एस से अधिक के लिए पिपेट की नोक में मिश्रित समाधान नहीं रखें । - बाहर सुखाने के लिए नमूना के लिए प्रतीक्षा करें । ठेठ सुखाने बार 1 तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
- सूखे नमूने के मौके पर MeOH के ०.२ µ l को जमा करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें । नमूना गीला हो जाएगा और तुरंत बाहर सूखी ।
नोट: MeOH की महत्वपूर्ण वाष्पीकरण नुकसान से बचने के लिए जमाव प्रक्रिया 3 एस में समाप्त हो गया है कि यह सुनिश्चित करें । - नमूना एक खुर्दबीन का उपयोग कर की जांच करें । क्रिस्टल morphologies के रूप में अपेक्षित नहीं हैं, तो (देखें चित्र 1 इच्छित परिणामों के उदाहरण के लिए), एक नया नमूना तैयार करने के लिए चरण 2.1.1-2.1.6 दोहराएँ ।
- nitrile दस्ताने पहनते है और ध्यान से बाहर सुखाने कक्ष से नमूना थाली ले ।
-
नमूना के एक नियमित राशि (1 µ एल) के विश्लेषण के लिए
नोट: निम्नलिखित कदम आम तौर पर उपयोग मालदी नमूना राशि के साथ कार्बोहाइड्रेट नमूनों की एकरूपता को अधिकतम करने के लिए विकसित कर रहे हैं. प्रक्रिया नियमित और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । पुनः क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया नमूनों और मैट्रिक्स को समान रूप से बड़े क्षेत्रों में पुनर्वितरित करती है ।- Premix २.५ µ l के DHB हल और २.५ µ l SLe एक या MH समाधान एक microcentrifuge ट्यूब में ।
- भंवर मिक्सर के साथ मिश्रित समाधान 5 एस के लिए ।
- 2 एस (२००० एक्स जी) के लिए एक मिनी केंद्रापसारक में मिश्रित समाधान नीचे स्पिन ।
- मिश्रित समाधान के १.० µ l को आकर्षित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और तुरंत यह नमूना प्लेट पर जमा ।
नोट: नमूने जमा करने के बाद फिर से शेष मिश्रित समाधान का उपयोग न करें । - बाहर सुखाने के लिए नमूना के लिए प्रतीक्षा करें । ठेठ सुखाने बार 1 तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
- सूखे नमूने के मौके पर MeOH के १.५ µ l को जमा करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें । नमूना गीला हो जाएगा और तुरंत बाहर सूखी ।
नोट: उच्च नमूना प्लेट तापमान (५० डिग्री सेल्सियस) के साथ मामलों में, क्रिस्टलीकरण कदम पिपेट टिप में MeOH के वाष्पीकरण को कम करने के लिए 5 एस के भीतर किया जाना चाहिए. - नमूना एक खुर्दबीन का उपयोग कर की जांच करें । क्रिस्टल morphologies के रूप में अपेक्षित नहीं हैं, तो (देखें चित्र 1 इच्छित परिणामों के उदाहरण के लिए), दोहराएं चरण 2.2.1-2.2.6 एक नया नमूना तैयार करने के लिए ।
- nitrile दस्ताने पहनते है और ध्यान से बाहर सुखाने कक्ष से नमूना थाली ले ।
3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा प्राप्ति और विश्लेषण
नोट: विश्लेषण एक वाणिज्यिक समय का उपयोग किया जाता है-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री की मेज) एक मालदी आयन स्रोत से सुसज्जित । साधन पूर्व अनुकूलित निष्कर्षण देरी और लेजर ऊर्जा के साथ विशिष्ट नियंत्रण सॉफ्टवेयर (सामग्री की मेज) द्वारा संचालित है । स्पेक्ट्रा m/z = 0-१५०० की एक मास रेंज के साथ रैखिक मोड में दर्ज कर रहे हैं । नमूना प्लेट संभावित ± 25 कीव और हर स्पेक्ट्रम औसत 10 लेजर शॉट्स है । उपयोगकर्ताओं को संगत सॉफ्टवेयर का उपयोग साधन अनुकूलन और नमूना विश्लेषण का संचालन और साधन निर्माता के निर्देशों का पालन करना चाहिए.
- साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- मास स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना प्लेट डालें ।
- सॉफ़्टवेयर में पूर्व-ऑप्टिमाइज़ की गई डेटा प्राप्ति विधि का चयन करें.
- आईएमएस इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के लिए पूरे नमूना क्षेत्र रजिस्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
नोट: इस कदम को छोड़ अगर आईएमएस नहीं कर रहा । - नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के बैच मोड में डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें ।
- डाटा अधिग्रहण के बाद इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आयन छवियों प्लाट पूरा हो गया है ।
- विश्लेषण सामूहिक स्पेक्ट्रा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) यदि डेटा एक आयन छवि के बिना दर्ज की गई है ।
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Representative Results
प्रतिनिधि SEM SLe की छवियांएक मिश्रित DHB के साथ डीडी और recrystallizीकरण तरीकों का उपयोग कर तैयार चित्र 1में दिखाया गया है । डीडी विधि द्वारा तैयार के रूप में एक ठेठ DHB आकृति विज्ञान और नमूना स्पॉट के केंद्र में ठीक क्रिस्टलीय संरचनाओं रिम पर बड़ी सुई के आकार का क्रिस्टल है । इस तरह सुई के आकार का क्रिस्टल की विशिष्ट लंबाई ~ १०० µm हैं । MeOH द्वारा पुनः क्रिस्टलीकरण के बाद, नमूना एक बड़ा क्षेत्र ठीक परत के साथ समान रूप से कवर किया गया है-क्रिस्टल की तरह. "परत" क्रिस्टल की लंबाई मोटे तौर पर कर रहे है 20-50 µm. recrystallizीय नमूने पारंपरिक डीडी नमूनों द्वारा उत्पादित उन से बड़ा प्रभावी सतह क्षेत्रों प्रदान करते हैं ।
आईएमएस परिणाम संकेत मिलता है कि परत-क्रिस्टल की तरह आम तौर पर उच्च कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता और एक अधिक सजातीय स्थानिक वितरण में परिणाम । पारंपरिक डीडी नमूनों में, कार्बोहाइड्रेट आयन सिग्नल ज्यादातर नमूना स्थानों की परिधि में वितरित किए जाते हैं । चित्रा 2 SLe के आईएमएस परिणाम से पता चलता है और महाराष्ट्र के साथ और MeOH के बिना क्रिस्टलीकरण । पुनर्क्रिस्टलीकरण के बाद, SLeए और MH संकेतों का वितरण नमूना स्पॉट के चमकीले क्षेत्र की छवि के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है । साथ ही, सभी सघन कार्बोहाइड्रेट नमूने डीडी नमूनों से प्राप्त परिणामों पर संकेत तीव्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि दर्शाते हैं । उच्च संकेत तीव्रता और एकरूपता की वजह से, क्रिस्टलीकरण स्पष्ट रूप से मात्रात्मक विश्लेषण में डेटा की गुणवत्ता में सुधार ।
क्रिस्टलीकरण द्वारा कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता बढ़ाने सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड दोनों के लिए प्रभावी है. चित्रा 3 sodiated (सकारात्मक आयन मोड) और deprotonated (नकारात्मक आयन मोड) के संकेत तीव्रता डीडी नमूनों की है कि संबंध के साथ क्रिस्टलीय नमूनों के कार्बोहाइड्रेट की तुलना करता है । औसत पर, SLeए और MH नमूनों की recrystallizिंग क्रमशः ३.९ और ३.३ के कारकों द्वारा sodiated संकेतों बढ़ जाती है । deprotonated SLeएकके लिए, आयन संकेत आम तौर पर क्रिस्टलीकरण के बाद मोटे तौर पर ४.७ के एक कारक द्वारा बढ़ाया है ।
चित्र 1. SLeएक DHB मैट्रिक्स के साथ तैयार की SEM छवियां । नमूनों सूख छोटी बूंद और क्रिस्टलीकरण तरीकों के साथ तैयार कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. SLeएक और महाराष्ट्र की छवि मास स्पेक्ट्रोमेट्री के प्रतिनिधि परिणाम सूखे छोटी बूंद और क्रिस्टलीकरण तरीकों के साथ तैयार है । आयन छवियों sodiated या deprotonated analytes के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । सभी उज्ज्वल क्षेत्र और आयन छवियों को एक ही पैमाने में प्रदर्शित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता विभिन्न नमूना तैयारी तरीकों के साथ प्राप्त की । काली पट्टियां: sodiated SLeA (m/z: ८४३); लाल पट्टियां: deprotonated SLeA (m/z: ८१९); नीली पट्टियां: sodiated MH (m/z: ११७५) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नमूना | नमूना प्लेट तापमान (° c) |
नमूना राशि (µ एल) |
नमूना सुखाने समय (ओं) |
MeOH सुखाने समय (ओं) |
उचित नमूना क्षेत्र बाद विस्तार पुनर्क्रिस्टलीकरण (%) |
| SLeएक | 25 | ०.१ | 100-150 | < 5 | 0-200 |
| 1 | 300-350 | < 10 | |||
| महाराष्ट्र | ०.१ | 100-150 | < 5 | ||
| 1 | 200-350 | < 10 | |||
| SLeएक | ५० | ०.१ | < 5 | < 5 | |
| 1 | < 10 | < 10 | |||
| महाराष्ट्र | ०.१ | < 5 | < 5 | ||
| 1 | < 10 | < 10 |
तालिका 1. प्रयोगात्मक मापदंडों और विभिन्न नमूना प्लेट तापमान. x के तहत सुखाने की स्थिति
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Discussion
नमूना विविधता मालदी में एक महत्वपूर्ण समस्या है-सुश्री डीडी सबसे अधिक इस्तेमाल किया नमूना तैयारी विधि है, लेकिन परिणामी क्रिस्टल अत्यधिक विषम हैं । इस तरह के नमूनों में खराब शॉट-टू-शॉट और नमूना-टू-सैम्पल सिग्नल reproducibility दिखाते हैं । इसलिए, डेटा प्राप्ति के दौरान नमूना क्षेत्रों में "मीठे धब्बे" की खोज करना मालदी प्रयोगों में एक सामान्य प्रक्रिया है. ऐसे विषम नमूने नित्य विश्लेषणों में ठहराव के लिए अनुपयुक्त होते हैं.
वर्तमान अध्ययन में, मालदी नमूना आकृति विज्ञान क्रिस्टलीकरण द्वारा अनुकूलित है । कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता में सुधार और क्रिस्टलीकरण द्वारा डेटा स्थिरता कार्बोहाइड्रेट और मैट्रिक्स के बीच में सुधार करने के लिए जिंमेदार ठहराया है । क्योंकि सबसे कार्बोहाइड्रेट और मैट्रिक्स के हाइड्रोफिलिक गुण, MeOH कुशलतापूर्वक मालदी क्रिस्टल और कार्बोहाइड्रेट को विखंडित कर सकते हैं । अवलोकन MeOH सुधारों की है कि जमाव और तेजी से वाष्पीकरण बड़ी सुई के आकार का DHB क्रिस्टल छोटे गुच्छे की तरह क्रिस्टलीय संरचनाओं में दिखाता है । इस प्रक्रिया को भी नमूना अलगाव को कम करता है और सतह क्षेत्र बढ़ जाती है । आईएमएस डेटा के अनुसार, सुधारित क्रिस्टल कार्बोहाइड्रेट ionization के लिए एक बेहतर microenvironment प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, सुखाने चैंबर के उपयोग के लिए ठीक प्रायोगिक मापदंडों नियंत्रित के साथ एक संदर्भ शर्त प्रदान करना है । नियमित विश्लेषण के लिए, सामांय एमएस उपयोगकर्ताओं को एक परिवेश के तहत प्रोटोकॉल का पालन कर सकते है समान वृद्धि परिणाम प्राप्त वातावरण ।
क्रिस्टलीकरण द्वारा संकेत वृद्धि भी प्रभावी सतह क्षेत्र में वृद्धि के कारण हो सकता है, के बाद से मालदी सतह रासायनिक प्रतिक्रियाओं का प्रभुत्व है14,15. मालदी क्रिस्टल के संकेत तीव्रता और प्रभावी सतह क्षेत्र के बीच सहसंबंध अलग नमूना प्लेट तापमान11,12के तहत नमूनों की तैयारी के द्वारा अध्ययन किया गया है । क्रिस्टल आकार में एक बड़े परिवर्तन की तुलना में, क्रिस्टल आकार के ठीक समायोजन छोटी बूंद सुखाने की प्रक्रिया के दौरान नमूना प्लेट तापमान को विनियमित करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । जब एक मैट्रिक्स के रूप में THAP का उपयोग कर, THAP की सुई के आकार का क्रिस्टल का औसत आकार 10 गुना कम कर देता है जब नमूना प्लेट तापमान ४० डिग्री सेल्सियस से कम कर देता है. अवलोकन दिखाता है कि कार्बोहाइड्रेट संकेत तीव्रता बढ़ जाती है के रूप में क्रिस्टल आकार13कम हो जाती है । हालांकि, नमूना प्लेट तापमान को कम करने नियमित विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है क्योंकि यह DHB की आकृति विज्ञान कुशलता को बदल नहीं सकते और यह लंबी तैयारी के समय की आवश्यकता है ।
सबसे अच्छा recrystallizीकरण परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, तैयारी प्रक्रियाओं की देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । सबसे पहले, ताजा नमूना मिश्रण क्रिस्टलीकरण विधि का उपयोग सबसे अच्छा संकेत वृद्धि प्रदान करते हैं । एक बार मिश्रित समाधान परिवेश वातावरण को उजागर कर रहे हैं, पूर्व क्रिस्टलीकरण समाधान में होता है, जो परिवर्तन के अंतिम आकार और आकृति विज्ञान । इस तरह के एक आकृति विज्ञान परिवर्तन संभवतः मैट्रिक्स/analyte अनुपात में परिवर्तन की वजह से है । टिप्पणियों से पता चलता है कि ऐसे नमूनों के पुनर्क्रिस्टलीकरण सबसे अच्छा संकेत वृद्धि प्रदान नहीं कर सकते । इसलिए, pipetting प्रक्रिया पिपेट टिप के भीतर पूर्व क्रिस्टलीकरण से नमूना छोटी बूंद की रक्षा के लिए उच्च दक्षता के साथ संचालित किया जाना चाहिए । दूसरे, MeOH के एक उपयुक्त राशि के नमूनों को पूरी तरह से सुधार करने के लिए लागू किया जाना चाहिए । क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के दौरान, MeOH पर्याप्त वाष्पीकरण नुकसान से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके नमूना सतह के लिए जमा किया जाना चाहिए । मालदी नमूना क्रिस्टल पूरी तरह से भंग नहीं अगर जमा MeOH की मात्रा पर्याप्त नहीं है । इसके विपरीत, MeOH की एक बड़ी मात्रा बाहर फैल जाएगा और नमूनों घनत्व को कम । यह एक खुर्दबीन के नीचे नमूना morphologies निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि क्रिस्टल morphologies एमएस विश्लेषण से पहले ठीक से सुधार कर रहे है की सिफारिश की है । क्रिस्टल morphologies पूरी तरह से बदल नहीं रहे हैं (देखें चित्रा 1 और संदर्भ के लिए तालिका 1 ), यह एक ही प्रक्रिया के साथ एक नया नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक है.
मालदी-MS में सबसे अच्छा मात्रात्मक विश्लेषण दृष्टिकोण आईएमएस के साथ सुधार नमूनों का विश्लेषण कर रहा है । हालांकि सुधार काफी नमूना विविधता को कम करता है, विभिन्न क्षेत्रों में analytes के संकेत तीव्रता अभी भी भिन्न हो सकते हैं (चित्रा 2). चयनित नमूना पदों की पुस्तिका परीक्षा के साथ तुलना में, आईएमएस औसत से बाहर अनिश्चितताओं और डेटा भिन्नता के साथ पूरे नमूना क्षेत्रों का विश्लेषण. अवलोकन बताते है कि एक नियमित राशि (१.० µ l नमूना समाधान) के साथ तैयार नमूनों की क्रिस्टलीकरण मात्रात्मक विश्लेषण (चरण २.२) में बेहतर कार्बोहाइड्रेट नमूना समरूपता प्रदान करता है । हालांकि, आईएमएस ऐसे नमूनों का विश्लेषण मैनुअल परीक्षा पद्धति से अधिक विश्लेषण समय का उपभोग करता है । रैपिड आईएमएस विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, ०.१ µ l नमूना समाधान (चरण २.१) का उपयोग कर नमूनों की तैयारी छोटे नमूना क्षेत्रों का उत्पादन और विश्लेषण समय कम कर सकते हैं ।
मालदी नमूनों की पुनः क्रिस्टलीकरण मालदी-MS में संवेदनशील और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेहतर नमूना आकृति विज्ञान प्रदान करता है । इस विधि के पीछे मूल सिद्धांत स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया जाता है । इस कार्य में विकसित प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं सामान्य प्रायोगिक स्थितियों के लिए सुविधाजनक और प्रभावकारी हैं । इन प्रायोगिक प्रक्रियाओं को आसानी से अतिरिक्त लागत के बिना नियमित विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
- Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
- Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
- Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
- Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
- Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
- Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
- Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
- Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
- Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
- Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
- Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409 (2016).
- Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
- Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
- Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).
