Summary
Um protocolo para melhorar os sinais de íon de carboidrato em espectrometria de massa MALDI por reformas estruturas cristalinas durante os processos de preparação de amostra é demonstrado.
Abstract
Preparação da amostra é um processo crítico na análise de espectrometria de massa (MS) de hidratos de carbono. Apesar de dessorção/ionização de laser assistida por matriz (MALDI) MS é o método de escolha na análise de hidrato de carbono, reprodutibilidade de dados e sinal pobre do íon de amostras de hidrato de carbono continuam a ser problemas graves. Para análise quantitativa de hidratos de carbono, um protocolo eficaz analítico, oferecendo qualidade superior dos dados é necessário. Este vídeo demonstra os protocolos de preparação de amostra para melhorar a intensidade do sinal e minimizar a variação de dados de carboidratos em MALDI-MS. Após a secagem e cristalização de gotas da amostra, a morfologia do cristal é reformada por metanol antes da análise de espectrometria de massa. A melhoria no sinal de hidrato de carbono é examinada com espectrometria de massa MALDI imagem (IMS). Resultados experimentais mostram que a reforma de cristal ajusta estruturas cristalinas e redistribui os analitos de hidrato de carbono. Em comparação com o método de preparação de gotas secas em convencional MALDI-MS, reforma morfologias de cristal de hidrato de carbono com metanol mostra significativamente melhor intensidade de sinal, distribuição de imagem de íon e estabilidade de dados. Desde os protocolos demonstrados neste documento não implicam mudanças na composição da amostra, eles são geralmente aplicáveis aos vários hidratos de carbono e matrizes.
Introduction
Análise de carboidratos é um assunto importante e desafiador. Carboidratos e seus derivados desempenham importantes funções no vivendo organismos1,2,3. Estas moléculas têm complicado estruturas e são propensas a se decompor. Muitos deles não podem ser claramente caracterizados devido às dificuldades de separação e deteção. Apesar do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização espectrometria (MS) foi aplicada a análise de uma ampla gama de biomoléculas, devido à sua sensibilidade e resultados compreensíveis4, analisar carboidratos usando MALDI-MS continua para ser um grande desafio devido a eficiência de ionização baixa de tais moléculas5. Derivatização química é uma maneira comum para melhorar a eficiência de ionização de hidratos de carbono6,7, mas tais procedimentos são tempo e consumo de amostra. Além disso, a eficiência de ionização pyrazole hidratos de carbono é ainda menor do que de proteínas. Assim, o desenvolvimento de métodos para melhorar o sinal do hidrato de carbono em MALDI-MS sem procedimentos complicados é necessário.
A aplicação de MALDI-MS para análise quantitativa é um outro assunto desafiador. Um grande problema de MALDI-MS é que sua sensibilidade e dados reprodutibilidade depende criticamente protocolos de preparação de amostra e parâmetros experimentais. Em muitos casos, a análise quantitativa por MALDI-MS é confiável devido morfologias amostra heterogênea e distribuição do analito. Um exemplo bem conhecido é amostras preparadas com uma matriz MALDI (DHB) ácido benzoico-2,5. Quando DHB se cristaliza lentamente sob ambiente ambiental, a extensão da incorporação do analito em cristais de matriz é imprevisível, porque resultantes amostras mostram morfologias irregulares. Tais amostras são geralmente compostos por cristais em forma de agulha e bem grandes. Quando DHB é preparado usando um solvente volátil e/ou uma placa da amostra aquecida, um processo de secagem rápido resulta em cristais bem mais homogêneas e melhor resultados quantitativos8,9,10. Essa técnica é conhecida como "recristalização" de amostras MALDI. A melhoria é atribuída a melhor incorporação de analitos cristais matriz bem durante o processo de rápida cristalização. Também demonstrámos que ajustar o ambiente de preparação de amostra reduzida a heterogeneidade de sinal de hidrato de carbono e melhoria de resultados quantitativos11,12. Os achados nestas obras sugerem que a morfologia da amostra é um fator crítico na determinação de qualidade de sinal do hidrato de carbono. Para desenvolver uma estratégia geral para análise diária, um método de reforma de amostra eficiente proporcionando sensibilidade melhorada de carboidratos é necessário.
Examinámos, sistematicamente, a correlação entre sensibilidade de morfologia e hidrato de carbono de amostra em MALDI-MS em um recente relatório13. Os resultados obtidos usando vários carboidratos importantes e matrizes de mostrar que o melhor acessório de sinal é cumprido por recristalização secas amostras MALDI. A morfologia das amostras preparadas usando o método convencional da gota secos (DD) é reformada por recristalização rápida com metanol (MeOH). Os protocolos de preparação de amostra detalhada são demonstrados aqui. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo amostra placa pré-condicionamento, deposição de amostra e recristalização e análise de espectrometria de massa. Os carboidratos utilizados incluem sialyl-lewis (SLeA) e maltoheptaose (MH). DHB é usado como uma matriz de modelo. Os resultados mostram que intensidade de sinal do hidrato de carbono e distribuição espacial aumentou consideravelmente após a recristalização. Esse método pode ser aplicado para amostras com outras matrizes populares, incluindo 2.4.6-trihydroxyacetophenone (THAP) e α- cyano-4-hidroxicinâmicos ácido. Este método serve como uma abordagem geral que pode ser facilmente integrada na rotina do laboratório para análise de carboidratos.
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Protocol
1. placa pré-condicionamento da amostra
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Limpeza da placa de amostra
- Use luvas de nitrilo para evitar a contaminação da placa da amostra durante a limpeza.
- Lave a placa da amostra com 100,0 mL de solução de detergente (1,0 mg/mL).
- Lave a placa da amostra com água destilada-deionizada (DDW).
- Enxague a superfície da placa de amostra com 30,0 mL de MeOH.
- Colocar a placa de amostra em um béquer de 600 mL e preenchimento com DDW até a placa da amostra está totalmente imerso em água.
- Coloque o copo em um ultra-som do banho (ver tabela de materiais) e proceda à sonicação a placa da amostra por 15 min (200 W, 40 kHz).
- Retire a placa da amostra e explodir em gotas de água usando nitrogênio pressurizado.
- Depósito de 0,2 µ l de MeOH na placa de amostra para verificar se o MeOH se espalha para outros pontos.
Nota: Se MeOH funde-se com outros pontos, repita as etapas 1.1.3-1.1.5; Se não, prossiga para a próxima etapa.
-
Regulação da temperatura da câmara de secagem
- Use uma câmara de secagem em condições estáveis para secar as gotas, conforme descrito anteriormente,11,12,13. Em particular, use o procedimento detalhado descrito nos passos 2.1-2.5 de UO, Y.-M. et al. 201612. Brevemente:
- Limpe a câmara de secagem por nitrogênio de temperatura em uma taxa de fluxo constante para manter um ambiente de baixa umidade relativa.
- Manter a amostra placa temperatura constante a regular - (25 ° C) ou condições de secagem rápida (50 ° C), regulamentada por um bloco de cobre de controlo de temperatura na câmara de secagem.
- Use uma câmara de secagem em condições estáveis para secar as gotas, conforme descrito anteriormente,11,12,13. Em particular, use o procedimento detalhado descrito nos passos 2.1-2.5 de UO, Y.-M. et al. 201612. Brevemente:
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Preparação de soluções de matriz e analito
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Preparação das soluções-matriz
- Dissolver DHB em 50% acetonitrila (ACN): 50% DDW para preparar uma solução 0,1 M.
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Preparação de analitos de hidrato de carbono
- DissolvaA de SLe em DDW para preparar uma solução de M-4 10.
- Dissolva o MH em DDW para preparar uma solução de 10-4 M.
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Preparação das soluções-matriz
2. amostra de deposição e recristalização
Nota: Os procedimentos otimizados para analisar quantidades pequenas e regulares de amostras são descritos aqui. Certifique-se de que a temperatura da placa de amostra é estabilizada na temperatura desejada, antes de depositar as soluções. Se a amostra se espalha sobre uma área grande para cobrir outros pontos de amostra durante a recristalização, preparar uma nova amostra ou repita o passo 1.1.
-
Para a análise de uma pequena quantidade (0,1 µ l) de amostra
Nota: as etapas a seguir foram desenvolvidas para minimizar o consumo de amostra e tempo. É apropriado para análise quantitativa de amostras reais com uma quantidade limitada ou IMS rápida para análise de quantificação.- Premix 0,25 µ l de solução de DHB e 0,25 µ l de SLeA ou MH solução em um tubo de microcentrifugadora.
- Vórtice a solução mista usando um misturador do vortex para 3 s.
- Spin para baixo a solução mista em uma centrífuga mini por 2 s (2000 x g).
- Use uma pipeta para retirar 0,1 µ l da solução pré-misturada e imediatamente depositá-lo na placa de amostra.
Nota: Quando depositar uma pequena quantidade de amostra, Não manter a solução pré-misturada na ponta da pipeta para mais de 10 s. - Espere para o exemplo para secar. Tempos de secagem típicos estão listados na tabela 1.
- Use uma pipeta para depositar 0,2 µ l de MeOH direita até o ponto de amostra seca. A amostra vai ficar molhado e secar imediatamente.
Nota: Certifique-se de que o processo de deposição é terminado em 3 s para evitar a evaporação significativa perda de MeOH. - Examine a amostra usando um microscópio. Se as morfologias de cristal não são como eu esperava (ver Figura 1 , por exemplo dos resultados desejados), repita os passos 2.1.1-2.1.6 para preparar uma nova amostra.
- Usar luvas de nitrilo e Retire cuidadosamente a placa da amostra da câmara de secagem.
-
Para a análise de uma quantidade regular (1 µ l) de amostra
Nota: As etapas a seguir são desenvolvidas para maximizar a homogeneidade das amostras de hidrato de carbono com a quantidade de amostra utilizada normalmente MALDI. O processo é adequado para a rotina e análises quantitativas. O processo de recristalização redistribui as amostras e matrizes uniformemente para áreas maiores.- Premix 2,5 µ l de solução de DHB e 2,5 µ l SLeA ou MH solução em um tubo de microcentrifugadora.
- Vórtice a solução pré-misturado com um misturador do vortex para 5 s.
- Spin para baixo a solução mista em uma centrífuga mini por 2 s (2000 x g).
- Use uma pipeta para retirar 1,0 µ l da solução pré-misturada e imediatamente depositá-lo na placa de amostra.
Nota: não uso o restante pré-misturado solução novamente após depositar as amostras. - Espere para o exemplo para secar. Tempos de secagem típicos estão listados na tabela 1.
- Use uma pipeta para depositar 1,5 µ l de MeOH direita até o ponto de amostra seca. A amostra vai ficar molhado e secar imediatamente.
Nota: Em casos com temperatura de placa de alta da amostra (50 ° C), a etapa de recristalização deve ser feita dentro de 5 s para minimizar a evaporação de MeOH na ponta da pipeta. - Examine a amostra usando um microscópio. Se as morfologias de cristal não são como eu esperava (ver Figura 1 , por exemplo dos resultados desejados), repita os passos 2.2.1-2.2.6 para preparar uma nova amostra.
- Usar luvas de nitrilo e Retire cuidadosamente a placa da amostra da câmara de secagem.
3. dados de espectrometria de massa aquisição e análise
Nota: A análise é executada usando um comercial tempo-de-voo espectrômetro de massa (Tabela de materiais) equipado com uma fonte de íon MALDI. O instrumento é operado pelo software de controle específicos (Tabela de materiais) com energia de laser e atraso de extração previamente otimizada. Espectros são gravados na modalidade linear com uma escala em massa de m/z = 0 – 1500. A potencial de placa da amostra é ± 25 keV e cada espectro em média 10 tiros de laser. Os usuários devem realizar a otimização do instrumento e análise de amostras usando o software compatível e siga as instruções do fabricante do instrumento.
- Abra o software de controle de instrumento (ver Tabela de materiais).
- Insira a placa da amostra o espectrômetro de massa.
- Selecione o método de aquisição de dados previamente otimizada no software.
- Registre-se a região de toda a amostra para IMS usando o software de imagem (consulte a Tabela de materiais).
Nota: Ignore este passo se não fazendo o IMS. - Inicie a aquisição de dados em modo em lote do software controle.
- Plotar as imagens de iões utilizando o software de imagem após a conclusão da aquisição de dados.
- Analisar usando software de análise de espectros de massa (veja a Tabela de materiais) se os dados são registrados sem uma imagem de íon.
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Representative Results
Imagens SEM representante de SLeA misturado com DHB preparado usando DD e métodos de recristalização são mostrados na Figura 1. Uma morfologia típica de DHB como preparado pelo método DD é grandes cristais em forma de agulha na borda e estruturas cristalinas bem no centro dos pontos de amostra. Os comprimentos típicos de tais cristais em forma de agulha são ~ 100 µm. Após a recristalização por MeOH, a amostra tem uma maior área coberta uniformemente com cristais de floco-como bem. Os comprimentos dos cristais "floco" são aproximadamente 20-50 µm. Recrystallized amostras fornecem áreas de superfície eficazes maiores do que aqueles produzidos por amostras DD convencionais.
Os resultados IMS indicam que o floco-como cristais geralmente resultam em maior intensidade de sinal do hidrato de carbono e uma distribuição espacial mais homogênea. Amostras DD convencionais, sinais de íon do hidrato de carbono estão distribuídos principalmente na periferia das manchas da amostra. A Figura 2 mostra os resultados do IMS de SLeA e MH com e sem recristalização MeOH. Após a recristalização, a distribuição de SLeA e MH sinais coincidir com a imagem do brilhante-campo de pontos da amostra. Também, todas as amostras de hidrato de carbono recrystallized mostram melhorias significativas na intensidade de sinal sobre os resultados obtidos com amostras DD. Devido à maior intensidade de sinal e homogeneidade, recristalização marcadamente melhora a qualidade de dados em análise quantitativa.
O aumento da intensidade de sinal do hidrato de carbono por recristalização é eficaz para ambos os modos de iões positivos e negativos. A Figura 3 compara a intensidade do sinal de sodiated (modo de íon positivo) e deprotonado (modo de íon negativo) hidratos de carbono de recrystallized amostras com relação do DD amostras. Em média, recristalização de SLeA e amostras de MH aumenta sinais de sodiated por fatores de 3,9 e 3.3, respectivamente. Para deprotonado SLeA, sinal de íon tipicamente é aumentada por um fator de aproximadamente 4.7 após a recristalização.
Figura 1. Imagens SEM de SLeA preparados com matriz DHB. As amostras são preparadas com métodos secos de gotículas e recristalização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultados representativos de espectrometria de massa de imagem de SLeum e MH prepararam com secas da gota e recristalização métodos. Imagens de íon representam distribuições de sodiated ou deprotonado analitos. Todas as imagens de campo brilhante e íon são exibidas na mesma escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Intensidades de sinal de hidrato de carbono obtidos com métodos de preparação de amostra diferente. Barras de preto: sodiated SLeA (m/z: 843); barras vermelhas: deprotonado SLeA (m/z: 819); azul bares: sodiated MH (m/z: 1175). Barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | Placa da amostra temperatura (° C) |
Quantidade de amostra (Μ L) |
Amostra de secagem tempo (s) |
MeOH secagem tempo (s) |
Área de amostra adequada expansão após recristalização (%) |
| SLeA | 25 | 0.1 | 100-150 | < 5 | 0-200 |
| 1 | 300-350 | < 10 | |||
| MH | 0.1 | 100-150 | < 5 | ||
| 1 | 200-350 | < 10 | |||
| SLeA | 50 | 0.1 | < 5 | < 5 | |
| 1 | < 10 | < 10 | |||
| MH | 0.1 | < 5 | < 5 | ||
| 1 | < 10 | < 10 |
Tabela 1. Parâmetros experimentais e secagem as condições de amostra diferente placa temperatures.x
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Discussion
Heterogeneidade da amostra é que um problema crucial no DD MALDI-MS. é o mais usado método de preparação de amostra, mas os cristais resultantes são altamente heterogêneos. Tais exemplos mostram reprodutibilidade pobre sinal de tiro-ao-shot e amostra-para-amostra. Portanto, procurando por "sweet spots" em áreas de amostra durante a aquisição de dados é um procedimento comum em experimentos MALDI. Tais amostras heterogêneas são impróprias para quantificação em análises de rotina.
No estudo atual, morfologia de amostra MALDI é otimizada por recristalização. A melhoria na intensidade de sinal do hidrato de carbono e estabilidade de dados por recristalização é atribuída à incorporação melhorada entre matrizes e hidratos de carbono. Por causa das propriedades hidrófilas da maioria dos hidratos de carbono e matrizes, MeOH eficientemente pode desintegrar-se hidratos de carbono e cristais MALDI. Observação mostra que a deposição e evaporação rápida de MeOH reformas grandes cristais DHB em forma de agulha em pequenas estruturas cristalinas floco. Este processo também minimiza a segregação de amostra e aumenta a área de superfície. De acordo com dados do IMS, os reformada cristais fornecem um microambiente melhor para ionização de hidrato de carbono. Nomeadamente, a utilização da câmara de secagem é proporcionar uma condição de referência precisamente controlados parâmetros experimentais. Para análise de rotina, usuários em geral MS podem seguir os protocolos sob um ambiente para alcançar resultados semelhantes de realce.
Reforço de sinal por recristalização pode também ser devido a um aumento na área de superfície eficaz, desde que MALDI é dominado por reações químicas superficiais14,15. A correlação entre a intensidade do sinal e a área de superfície eficaz de cristais MALDI tem sido estudada, preparando as amostras sob placa de amostra diferentes temperaturas11,12. Em comparação com uma grande mudança no tamanho de cristal usando o método de recristalização, ajuste fino do tamanho de cristal pode ser conseguido regulando a temperatura da placa de amostra durante o processo de secagem de droplet. Ao usar THAP como uma matriz, o tamanho médio dos cristais em forma de agulha de THAP reduz 10-fold quando a temperatura da placa de amostra reduz em 40 ° C. Observações mostram que a intensidade do sinal de hidrato de carbono aumenta quando diminui de tamanho de cristal13. No entanto, reduzindo a temperatura da placa de amostra é inadequado para análise de rotina, porque não pode mudar a morfologia da DHB eficientemente e necessita de tempos de preparação longa.
Para garantir o melhor resultado de recristalização, processos de preparação devem ser realizados com cuidado. Em primeiro lugar, as misturas de amostra fresca fornecem o melhor acessório de sinal usando o método de recristalização. Uma vez que soluções pré-misturado são expostas ao meio ambiente, pré-cristalização ocorre na solução, que muda o tamanho de cristal final e morfologia. Uma tal mudança de morfologia é presumivelmente devido a uma alteração da relação de analito/matriz. As observações mostram aquela recristalização de tais amostras não podem fornecer o melhor acessório de sinal. Portanto, o procedimento de pipetagem deve ser utilizado com eficiência elevada para proteger a gota de amostra de pré-cristalização dentro a ponta da pipeta. Em segundo lugar, uma quantidade adequada de MeOH deve ser aplicada a amostras de reforma completamente. Durante o processo de recristalização, MeOH deve ser depositado na superfície da amostra mais rapidamente possível para evitar a evaporação considerável perda. Cristais de amostra MALDI não dissolvem-se completamente se o volume de MeOH depositado não é suficiente. Em contraste, um grande volume de MeOH irá espalhar-se e reduzir a densidade das amostras. Recomenda-se observar as morfologias de amostra sob um microscópio para garantir que as morfologias de cristal são reformadas corretamente antes da análise do MS. Se morfologias de cristal não são totalmente alteradas (ver Figura 1 e tabela 1 para a referência), é necessário preparar uma amostra de nova com os mesmos procedimentos.
A melhor abordagem de análise quantitativa em MALDI-MS está analisando amostras reformadas com IMS. Embora a reforma minimiza significativamente a heterogeneidade da amostra, a intensidade do sinal de analitos em diferentes áreas ainda pode variar (Figura 2). Em comparação com o exame manual de posições de amostragem, análise de áreas de toda a amostra com IMS nivela as incertezas e variação de dados. As observações mostram aquela recristalização de amostras preparadas com um regular quantidade (solução de amostra de 1,0 µ l) fornece a homogeneidade de amostra de hidrato de carbono superior na análise quantitativa (passo 2.2). No entanto, análise IMS de tais amostras consome mais tempo de análise, que o método de análise manual. Para realizar a análise rápida do IMS, preparar amostras utilizando 0,1 µ l amostra soluções (passo 2.1) pode produzir áreas de pequena amostra e reduzir o tempo de análise.
Recristalização de amostras MALDI prevê morfologia amostra superior sensível e análise quantitativa em MALDI-MS. O princípio básico por trás deste método é claramente demonstrado. Os processos experimentais desenvolvidos neste trabalho são convenientes e eficazes para condições experimentais. Estes processos experimentais podem ser facilmente aplicados a análises de rotina sem extra custo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores têm sem agradecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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