Summary
Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.
Abstract
La régulation de la transcription épigénétique médiée par la 5-méthylcytosine (5mC) a joué un rôle essentiel dans le développement eucaryote. La déméthylation de ces marques épigénétiques s’effectue par oxydation séquentielle de dix-onze translocation dioxygénases (TET1-3), suivie par la thymine-DNA glycosylase dépendant base excision de réparation. L’inactivation du gène TET2 due à des mutations génétiques ou par d’autres mécanismes épigénétiques est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de divers cancers, surtout des malignités hématopoïétiques. Nous décrivons ici une purification efficace seule étape d’enzymatiquement actif non balisés humaine TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse de cations. Nous fournissons également une approche liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique). Ce test peut être utilisé pour évaluer l’activité de type sauvage et mutant TET2 dioxygénases.
Introduction
La position de C5 des bases cytosine dans dinucléotides est le site de méthylation prédominant (5mCpG) dans les génomes de mammifères,1. En outre, un certain nombre d’études récentes ont mis au jour une vaste méthylation de cytosine C5 (5mC) dans des sites non-CpG (5mCpH, où H = A, T, ou C)2,3. modification de 5MC sert un silencieux transcriptionnel rétrotransposons endogènes et gènes promoteurs3,4,5. Méthylation de l’ADN à 5mC joue également un rôle important dans l’inactivation du chromosome X, l’empreinte génétique, reprogrammation nucléaire et expression de gène de tissu-spécifique5,6,7. La méthylation de la cytosine postées sur la C5 est réalisée par ADN méthyltransférases, et mutations de ces enzymes causent des défauts importants de développement8. L’enlèvement des marques 5mC commencent par TET1-3 5mC oxydases9,10. Ces dioxygénases TET-famille convertissent 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) par oxydation séquentielle étapes11,12,13. Enfin, thymine-DNA glycosylase remplace 5FC ou 5caC de cytosine non modifiée à l’aide de la base excision repair voie11.
Le gène humain de la TET2 a été identifié comme un gène muté fréquemment dans diverses malignités hématopoïétiques dont myelodysplastic syndromes (MDS)14,15,16, MDS-syndromes myéloprolifératifs () néoplasmes MDS-MPN) et la leucémie myéloïde aiguë (AML) originaires du MDS et MDS-NPP16. Les niveaux de modification 5hmC dans la moelle osseuse ADN sont plus faibles chez les patients présentant des mutations de TET2 par rapport à ceux qui ont le type sauvage (wt)-TET214. Un certain nombre de groupes ont développé des modèles de souris de TET2-knockout pour élucider leur rôle dans l’hématopoïèse normale et transformation myéloïde17,18,19,20. Ces souris avec des mutations dans le gène de TET2 ont été initialement normale et viable, mais qui se manifeste de diverses malignités hématopoïétiques comme ils âgés causant leur mort prématurée. Ces études ont montré le rôle important joué par la wt-TET2 dans la différenciation hématopoïétique normale. Dans ces modèles de souris hétérozygotes de cellules souches hématopoïétiques (TET2+/- CSH) et l’homozygote TET2- / - CSH avait un avantage concurrentiel sur les homozygotes wt-TET2 CSH à repeupler les lignées hématopoïétiques comme les deux TET2+/- et TET2- / - CSH développé diverses malignités hématopoïétiques17,18. Ces études démontrent que Sim1 de TET2 dioxygénase altère le développement des CSH et se traduit par des malignités hématopoïétiques.
Semblables à des souris présentant des mutations dans le gène TET2, la plupart des patients de leucémie manifestent Sim1 TET2 dioxygénase dactivité. Ces mutations somatiques hétérozygotes pour la plupart comprennent mutations cadre-Maj et non-sens dispersées dans tout le corps de gène de TET2 tandis que des mutations faux-sens qui sont les plus groupés dans le domaine de dioxygénase12. A ce jour, peu caractérisation de wt - et mutant-TET2 est rapportée dans la littérature principalement en raison de difficultés liées à la production de TET2 dioxygénase et son dosage21. Nous rapportons ici une simple purification seule étape de native TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse d’ions. En outre, un test quantitatif de la LC-MS/MS a été optimisé et utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de native TET2 dioxygénase.
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Protocol
1. le clonage et la Purification de TET2 humaine non balisés Dioxygenase
- Clonage humain TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) dans le vecteur de destination de pDEST14 à l’aide de la technique de recombinaison site-spécifique comme décrit précédemment22.
Remarque : Les études antérieures ont démontré que le domaine C-terminal TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) est les minimes domaine catalytiquement active21,23. Afin d’exprimer le domaine de dioxygénase TET2 non balisé à l’aide du vecteur pDONR221, séquences Shine Dalgarno et Kozak ont été incorporées dans l’amorce vers l’avant pendant l’ACP (tableau 1). - Pour la transformation bactérienne, ajouter 1 µL de vecteur d’expression pDEST14 recombinant contenant non balisés humaine TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) à 100 µL de chimiquement compétent e. coli BL21 (DE3) de cellules dans un tube de 1,7 mL. Garder le mélange sur la glace pendant au moins 15 minutes suivi d’un choc thermique à 42 ° C pendant 30 s dans un bain d’eau.
- Immédiatement après un choc thermique, garder les cellules retour sur la glace pendant au moins 2 min. Suite à cela, ajouter 250 µL de bouillon super optimal avec la répression catabolique (S.O.C médias) aux cellules. Incuber les cellules bactériennes pendant 1 h à 37 ° C dans un agitateur.
- Après incubation, tournez en bas les cellules par centrifugation du tube à 9 000 x g pendant 1 min. jetez 70 % surnageant de pipetage et dissoudre le culot à gauche sur les médias.
- Étendre la suspension de cellules sur une gélose de bouillon (LB) de Luria contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.
- Choisir une colonie isolée et il inoculer dans 10 mL de médias LB-ampicilline dans un tube de 50 mL. Incuber les tubes à 37 ° C dans un agitateur pour la nuit. Par la suite, utiliser 100 µL de la culture du tube de 50 mL pour ensemencer 100 mL de médias LB-ampicilline. Incuber le ballon à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min et l’utiliser comme culture primaire. Lendemain, permet d’ensemencer 15 flacons, chaque média 600 mL LB-ampicilline contenant 6 mL de chaque culture primaire. Maintenant, Incuber 15 flacons à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min.
Remarque : Pour la vérification des clones transformées, effectuez digestion de séquençage ou de restriction de l’ADN avec l’ADN de plasmide isolé. - La densité de culture bactérienne, mesurez son OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint une densité de 0,8 à OD600, induit l’expression de la protéine TET2 avec 300 µL de 1 M (concentration finale de 0,5 mM de 600 mL) IPTG dans chaque fiole et accroître davantage la culture pendant 16 h à 17 ° C.
- Après 16 h, transférer la culture bactérienne à la centrifugeuse bouteilles. Centrifuger la culture bactérienne exprimant l’enzyme TET2 à 5 250 g pendant 45 min. utilisation le culot bactérien pour la purification de TET2.
Remarque : Effectuez toutes les étapes de purification des protéines restantes sur la glace ou à 4 ° C. - Resuspendre le culot bactérien dans 100 mL de 50 mM MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide) buffer, pH 6 et laisser agir pendant 5 x 30 s à la puissance 20 avec refroidissement intervalles de 60 s.
- Spin le lysat à 5 250 g pendant 45 min. récupérer le surnageant contenant l’enzyme TET2 soluble et traverse de 0,45 µm filtre avant du charger sur un système FPLC.
Remarque : Dans ces expériences, l’enzyme TET2 était très stable, mais si nécessaire une protéase inhibiteur cocktail contenant 1 mM benzamidine-HCl, fluorure de sulfonyle de 1 mM (PMSF) et 0,5 mM 1,10 -o- phénanthroline peut être ajouté à la cellule lysate de prévenir la dégradation des enzymes TET2. Évitez d’utiliser des EDTA ou EGTA dans l’inhibiteur cocktail car ceux-ci peuvent interférer avec la chromatographie échangeuse de cations suivantes. - Pack de 30 mL de résine échangeuse de cations forts dans une colonne FPLC. Equilibrer la colonne avec 10 volumes de lit du tampon de lavage (tampon MES 50 mM, pH 6) au débit constant de 0,3 mL/min à l’aide d’un système FPLC.
- Charger le clarifié lysat sur la colonne préalablement équilibré et lavage avec des volumes de lit ∼10 de tampon de lavage jusqu'à ce que le débit devient clair.
- Éluer les TET2 à l’aide d’un 0-100 % dégradé de la mémoire tampon de lavage dans la mémoire tampon d’élution (tampon MES 50 mM, pH 6, 1 M NaCl) en 15 volumes de lit suivie d’exploitation au tampon d’élution de 100 % pour les volumes de deux lits.
NOTE : Prélever des échantillons (100 µL) de cellule lysat avant et après la colonne de chargement ainsi que toutes les fractions d’élution et analyser sur 10 % solution SDS-PAGE. - Mettre en commun les fractions contenant des protéines TET2, geler sec, dissoudre la palette d’enzyme dans 10 mL d’eau et conserver à-80 ° C.
2. 5mC oxydation par TET2 Dioxygenase
- Effectuer toutes les réactions de déméthylation en triple avec 3 µg de substrat (ADN bicaténaire 25-mer, tableau 2).
- Ajouter 100 µg d’enzyme purifiée de TET2 dans 50 µL de tampon de réaction totale contenant 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-cétoglutarate) et l’ascorbate de 2 mM et incuber à 37 ° C pendant 1 h21.
- Étancher TET2 catalysé les réactions d’oxydation 5 µl de 500 mM EDTA.
- Après la trempe des réactions TET2, préparer les échantillons pour analyse LC-MS/MS en séparant l’ADN du mélange réactionnel de TET2 à l’aide de colonnes de purification oligo.
- Ajouter 100 µL de tampon de liaison oligo à 55 µL de réaction trempée.
- Suite à cela, ajouter 400 µL d’éthanol à 100 % au mélange. Passez ce mélange à travers une colonne de liaison oligo.
- Lavez l’ADN lié avec 750 µL de tampon de lavage et éluer dans 20 µL d’eau.
- Digérer l’ADN isolé avec 2 unités de DNase I et 60 unités de nucléase S1 à 37 ° C pendant 12 h pour produire des nucléosides-monophosphates individuels.
- Après digestion, ajoutez 2 unités de la phosphatase alcaline intestinale de veau (CIAP) dans les échantillons et incuber pendant plus de 12 h à 37 ° C, à supprimer les groupes de phosphate terminal de nucléoside-monophosphates d’obtenir des nucléosides.
- Quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, en utilisant la méthode CL-SM/SM décrite ci-dessous.
3. quantitative analyse LC-MS/MS-based Development
- Préparer la solution mère de 100 µM de tous les nucléosides modifiés cytosine [5-méthyl-2′-désoxycytidine (5mdC), 5-hydroxyméthyl-2′-désoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2′-désoxycytidine (5fdC) et 5-carboxy-2′-désoxycytidine (5cadC)] et ADN normal des bases (adénine, thymine, cytosine et guanine) en eau de qualité CLHP pour l’élaboration de la méthode CL-SM/SM.
- Optimiser les paramètres de MS/MS de nucléoside dépendant en infusant des solutions mères, un à la fois, dans le spectromètre de masse à un débit de 10 µL/min en EMS mode de balayage. Optimiser les paramètres suivants : Declustering de potentiel (DP), entrée potentielle (EP), Collision cellule entrée potentielle (CEP), l’énergie de Collision (EC) et Collision cellule sortie potentielle (CXP) pour chaque nucléoside d’ADN en utilisant automatisé optimisation quantitative fonction du logiciel.
- Optimiser les paramètres MS/MS dépend de la source en injecter 10 µL de solution utilisant un gradient avec 25 % de solvant B à un débit de 0,3 mL/min où solvant A est l’acétate d’ammonium de 10 mM (pH 4,0) et solvant B est de 20 % d’acétonitrile avec de l’acétate d’ammonium 10 mM (pH 4,0). Optimiser les paramètres suivants : rideau de gaz (ACTU) : 10-50, température : 0-600 ° C, débit de gaz 1 (GS1) : 0-50, débit de gaz 2 (GS2) : 0-50, Dissociation activée par collision (CAD) : basse-moyenne-haute, Ion pulvérisateur tension (IS) : 4000-5500 pour chaque nucléoside d’ADN à l’aide de manuel fonction d’optimisation quantitative du logiciel en mode FIA (Flow Injection Analysis).
- Pour séparer tous les nucléosides d’ADN huit, effectuer la chromatographie en phase liquide en utilisant le gradient suivant : 0 % solvant B (0-2 min), 0-20 % de solvant B (2-5 min), 20-60 % de solvant B (5-9 min), solvant de 60-0 % B (9-10 min) et ensuite équilibrer avec solvant A pendant 5 min pour un débit de 0,3 mL/min sur une colonne C18 (granulométrie : 5 µm, taille des pores : 120 Å).
- En utilisant les paramètres de MS/MS optimales (étape 3.2 et 3.3) couplés avec le gradient susmentionné de chromatographie en phase liquide (étape 3.4), déterminer la linéarité de la réponse, limite de détection (LD) et le seuil de quantification (PPQM) en utilisant un double dilution en série d’un mélange standard de 100 µM, contenant tous les huit nucléosides. Dessiner des courbes standard pour tous les huit nucléosides de l’ADN.
- Détecter et quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, produites à l' étape 2.4 à l’aide de la méthode LC-MS/MS et les courbes d’étalonnage.
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Representative Results
Modification dynamique de 5mC dans l’ADN par TET-famille dioxygénases joue un rôle important dans les règlements transcriptionnelles épigénétiques. TET2 dioxygénase est fréquemment muté dans diverses malignités hématopoïétiques12. Afin d’étudier le rôle de l’enzyme de TET2 dans le développement normal et la maladie, nous avons cloné son domaine catalytiquement actif minimal sans n’importe quelle balise d’affinité dans le vecteur de pDEST1422. La dioxygénase TET2 non balisé a été produite à ∼5 % des protéines solubles totales par analyse SDS-PAGE de bactéries e. coli BL21 (DE3) des cellules. Étant donné que le domaine catalytique de TET2 a un point isoélectrique relativement élevé (∼7.49), par rapport aux autochtones plus e. coli protéines24,25,26, un processus de purification efficace utilisant un cation chromatographie d’échange a été développée. Cette purification a donné > 90 % pure TET2 enzyme en une seule étape (Figure 1).
Afin de séparer et quantifier les différents deoxycytidines dérivés et autres quatre bases de l’ADN naturels suite à la réaction enzymatique TET2, un test sensible de LC-MS/MS-basé a été optimisé. La chromatographie en phase liquide utilisé des colonnes C18 phase inversée. Les courbes standards ont été dessinées en utilisant des dilutions successives d’un mélange contenant tous les nucléosides (Figure 2). Le dégradé utilisé pour chromatographie en phase liquide, décrit dans la procédure expérimentale, a été en mesure de résoudre tous les huit nucléosides (Figure 3). La rétention de LC temps t (r) pour tous les huit nucléosides sont décrites dans le tableau 3. Nous avons optimalisé la détection MS de chaque nucléoside d’ion parent (Q1), l’ion de produit plus intense (Q3) en déterminant leur potentiel declustering (DP), potentiel d’entrée (EP), collision cellule entrée potentielle (du papier SCEP), énergie de collision (CE), limite de détection et le seuil de quantification (PPQM) (tableau 3). Enfin, on a développé une méthode LC-MS/MS qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique) (Figure 3).
L’activité de non balisés TET2 dioxygénase a été déterminée à l’aide d’un ADN double brin 25-mer contenant un 5mC dans une île de CpG dans chaque brin d’ADN (tableau 2). Après TET2 des réactions enzymatiques, oligonucléotides d’ADN ont été purifiées et convertis en nucléosides. Puis ces nucléosides sont soumises à analyse LC-MS/MS. Dans les réactions sans l’enzyme TET2 (témoin négatif), seuls pics dA, dT, dG, dC et 5mdC ont été observés. Toutefois, dans la réaction de contrôle positif, qui contenait le TET2 dioxygénase, deux nouveaux pics correspondant à d5hmC et d5fC ont été observés. Nous n’étions pas en mesure de détecter la formation de nucléoside d5caC probablement en raison de ses niveaux de détection pauvre (Figure 2). Ces résultats démontrent que la non balisé dioxygénase TET2 purifié dans cette procédure est catalytiquement actif et peut être utilisé pour caractériser l’enzyme wt-TET2 et ses mutants cliniques.
La figure 1. Analyse de SDS-PAGE de purifiée TET2 dioxygenase d’e. coli BL21 (DE3) des cellules. Lane A indique le marqueur en voie que b indique TET2 protéine purifiée à l’aide de résine d’échange ionique SP sepharose. La taille totale de la dioxygénase TET2 sans balise est ∼54 kDa, comme indiqué par la flèche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Les courbes standards était match nul pour quatre nucléosides naturels de l’ADN et les dérivés de la cytosine différents, qui ont ensuite été utilisés pour leur quantification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Chromatographie en phase liquide (en bas) et MS/MS, (méthode utilisée pour séparer et caractériser quatre nucléosides naturels de l’ADN et de la cytosine différents dérivés ci-dessus).
| Nom de l’apprêt | Séquence d’amorce | |||
| TET2 amorce vers l’avant | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Reverse Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tableau 1 : Séquence des amorces ADN utilisés pour l’amplification PCR du domaine catalytique d’untagged humaine TET2 dioxygénase.
| Nom de l’apprêt | Séquence d’amorce |
| Brin sens | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Brin antisens | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tableau 2 : Séquence de l’oligonucléotide ADN double brin de 25-mer sens et anti-sens utilisé comme substrat TET2 pour in vitro les réactions d’oxydation.
| Nucléosides | 1ER TRIMESTRE | Q3 | tr (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | QMD | R2 | |
| 2'-désoxyadénosine | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0,198 | 0,997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0,999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268,2 | 152,1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0,999 | |
| 2'-désoxycytidine | 228,1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0,1 | 0,33 | 0,998 | |
| 5-méthyl-2'-désoxycytidine | 242,2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0,1 | 0,998 | |
| 5-hydroxyméthyl-2'-désoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1.98 | 0,993 | |
| 5-formyl-2'-désoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0,66 | 0,998 | |
| 5-carboxy-2'-désoxycytidine | 272,2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0,993 | |
Tableau 3 : Paramètres optimisés de LC-MS/MS de quatre nucléosides naturels de l’ADN et de dérivés de cytosine différents sous mode d’ions positifs. Pour chaque nucléoside d’ion parent (Q1), l’ion de produit plus intense (T3) a été détectée.
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Discussion
Des mutations du gène TET2 sont quelques-uns des changements génétiques plus souvent détectés chez les patients atteints de divers cancers hématopoïétiques. À ce jour des centaines de différentes mutations TET2, incluent un non-sens, cadre-Maj et mutations faux-sens, ont été identifiées dans les patients de12. Les patients présentant des mutations de TET2 montrent des niveaux faibles de génomique 5hmC dans la moelle osseuse, comparée à ceux qui wt-TET214. Mutant TET2 knock-in expériences ont récapitulé les effets de ces mutations sur les niveaux de 5hmC dans les cellules transfectées14. Résultats de modèles de souris knockout-TET2 ont démontré que niveau de l’enzyme TET2 inversement corrélée avec la progression des tumeurs malignes hématopoïétiques17,18,19,20. Constamment, Zhang et coll. a récemment démontré que vers le bas-règlement de TET2 niveaux d’expression est un biomarqueur potentiel de pronostique et prédictif dans la leucémie myéloïde aiguë cytogénétique normale27.
En dépit de plus en plus évident que la TET2 joue un rôle fondamental dans l’hématopoïèse normale et transformation myéloïde, caractérisation biochimique de wt - et mutant TET2 restent stade rudimentaire en raison de difficultés liées à la production de TET2 actif et son dosage. La plupart des études ont produit système de baculovirus recombinant TET2 soit à l’aide de beaucoup de temps dans des cellules d’insecte14, ou comme une glutathion S-transférase affinité balise cellules bactériennes qui exige le retrait d’affinité tag21.
Dans cette procédure expérimentale, nous avons décrit le clonage d’untagged humaine TET2 dioxygénase domaine catalytique utilisant une technique de recombinaison site-spécifique et son expression efficace utilisant le vecteur de destination (pDEST14) chez e. coli. Parce que le point isoélectrique de TET2 sans balise est relativement élevé (∼7.49) par rapport à des protéines d’e. coli plus indigènes, nous avons développé un processus de purification efficace utilisant une chromatographie échangeuse de cations ce qui donne > 90 % pure non identifié TET2 enzyme en une seule étape.
En outre, des défis existent dans la quantification de l’activité dioxygénase TET2 wt - et mutant. Pour ces expériences, la plupart des études sont sont appuyés sur des tests de base d’anticorps comme dot-blot14,28, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)29, etc. car ces tests utilisent généralement qu’un seul anticorps, par exemple, 5hmC ou or5caC 5FC, pour la détection de modification 5mC en substrat ADN, ils ne fournissent pas une image complète de la réaction catalytique par TET isoformes. Pour ces raisons, le LC-MS/MS-based test est apparu comme le seul test pour quantifier la cytosine différentes modifications. À cet égard, nous avons développé une nouvelle méthode par chromatographie liquide qui permet de séparer les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine modifiés (5mC, 5hmC, 5 fC et 5caC).
Afin de quantifier les huit nucléosides de TET2 catalysées par des réactions, nous avons couplé à notre méthode de chromatographie en phase liquide améliorée avec la spectrométrie de masse. Cette analyse LC-MS/MS sensible a été ensuite utilisée pour déterminer l’activité de l’enzyme TET2 recombinante humaine non balisé. L’approche décrite ici permettra d’améliorer grandement l’évaluation des activités de dioxygénase TET2 wt - et mutant.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier à déclarer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le département américain de la défense sous la forme d’un Idea Award (W81XWH-13-1-0174), l’anémie aplastique & la MDS subvention de la Fondation, et grant UMRB de M.M. Authors remercie Mohit Jaiswal et Subhradeep Bhar clonage initiale de TET2 dans le vecteur pDEST14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
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