Summary
Her presenterer vi en protokoll for en effektiv enkeltsteg rensing av den aktive ukodede menneskelige ti-elleve translokasjon-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase ion-exchange kromatografi og dens analysen med en flytende kromatografi-tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS)-tilnærming.
Abstract
Epigenetic transkripsjon regulering formidlet av 5-methylcytosine (5mC) har spilt en avgjørende rolle i eukaryote utvikling. Demethylation disse epigenetic merkene oppnås ved sekvensiell oksidasjon av ti-elleve translokasjon dioxygenases (TET1-3), etterfulgt av thymine-DNA glycosylase-avhengige base excision reparasjon. Inaktivering av TET2 genet genetiske mutasjoner eller av andre epigenetic mekanismer er forbundet med en dårlig prognose hos pasienter med ulike kreftformer, spesielt blodkreft malignancies. Her beskriver vi en effektiv enkeltsteg rensing av enzymatisk aktive ukodede menneskelig TET2 dioxygenase bruker cation exchange kromatografi. Videre tilbyr vi en flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) tilnærming som kan skille og kvantifisere fire vanlige DNA baser (A, T, G og C), samt fire modifisert cytosine baser (5-metyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl). Denne analysen kan brukes til å evaluere vill type og mutant TET2 dioxygenases.
Introduction
C5 plasseringen av cytosine baser innenfor CpG dinucleotides er den dominerende metylering nettstedet (5mCpG) i pattedyr genomer1. I tillegg en rekke studier har avdekket omfattende C5 cytosine metylering (5mC) i ikke-CpG nettsteder (5mCpH, hvor H = A, T, eller C)2,3. 5mC endring fungerer som transcriptional lyddemper på endogene retrotransposons og gene arrangører3,4,5. DNA metylering på 5mC spiller også viktige roller i X-kromosom inaktivering, gene preging, kjernefysiske omprogrammering og vev-spesifikke genet uttrykk5,6,7. Metylering av cytosine C5 der utføres av DNA methyltransferases og mutasjoner i disse enzymene forårsake betydelige utviklingsmessige defekter8. Fjerning av 5mC merker er initiert av TET1-3 5mC oxidases9,10. Disse TET-serien dioxygenases konvertere 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) av sekvensiell oksidasjon trinn11,12,13. Endelig erstatter thymine-DNA glycosylase 5fC eller 5caC til uforandret cytosine ved hjelp av base excision repair pathway11.
Menneskelige TET2 genet ble identifisert som en ofte muterte genet i ulike blodkreft malignitet inkludert AML syndromer (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative neoplasms ( MDS-MPN), og akutt myelogen leukemi (AML) fra MDS og MDS-MPN16. 5hmC endring i beinmargen DNA er lavere hos pasienter med TET2 mutasjoner sammenlignet med vill-type (wt)-TET214. Flere grupper har utviklet TET2-knockout musen modeller for å belyse sin rolle i normal hematopoiesis og myelogen transformasjon17,18,19,20. Disse musene mutasjoner i genet TET2 var opprinnelig normal og levedyktig, men manifestert mangfoldig blodkreft malignitet som de alderen forårsaker deres tidlig død. Disse studiene viste de viktige rollene spilt av wt-TET2 i normal blodkreft differensiering. I disse musen modeller, heterozygote blodkreft stamceller (TET2+ / HSCs) og homozygous TET2- / - hadde HSCs et konkurransefortrinn over homozygous wt-TET2 HSCs i repopulating blodkreft linjene som begge TET2+/- og TET2- / - HSCs utviklet mangfoldig blodkreft malignitet17,18. Disse studiene viser at haploinsufficiency av TET2 dioxygenase endrer utviklingen av HSCs og resultater i blodkreft malignancies.
Ligner mus mutasjoner i genet TET2, de fleste leukemi pasienter manifestere haploinsufficiency TET2 dioxygenase aktivitet. Disse meste heterozygote somatiske mutasjoner omfatter ramme-shift og tull mutasjoner spredt over hele TET2 gene kroppen mens eks. missense mutasjoner som er mest i den dioxygenase domene12. Hittil er lite karakterisering av wt - og mutant-TET2 rapportert i litteraturen skyldes problemer med produksjon av TET2 dioxygenase og sine analysen21. Her rapporterer vi et enkelt enkeltsteg rensing av innfødte TET2 dioxygenase bruker ionebytte kromatografi. Videre var en kvantitativ LC--MS-/ MS analysen optimalisert og brukes til å måle den enzymatiske aktiviteten av innfødte TET2 dioxygenase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning og rensing av ukodede menneskelig TET2 Dioxygenase
- Klone menneskelig TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) i pDEST14 destinasjon vektor med områdespesifikke rekombinasjon teknikk som beskrevet tidligere22.
Merk: Tidligere studier har vist at C-terminalen TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domenet er minimal katalytisk aktive domene21,23. For å uttrykke ukodede TET2 dioxygenase domenet bruker pDONR221 vektor, ble skinne Dalgarno og Kozak sekvenser innlemmet i fremover primer under PCR (tabell 1). - Bakteriell transformasjon, legge 1 µL av rekombinant pDEST14 uttrykk vektor inneholder ukodede menneskelig TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) til 100 µL av kjemisk kompetent E. coli BL21 (DE3) celler i en 1,7 mL tube. Holde blandingen på isen i minst 15 minutter etterfulgt av heten støt ved 42 ° C for 30 s i et vannbad.
- Umiddelbart etter heten støt, holde cellene tilbake på isen i minimum 2 min. Etter å legge til 250 µL av super optimal buljong med catabolite undertrykkelse (S.O.C media) i celler. Inkuber bakterieceller 1t på 37 ° C i en shaker.
- Etter inkubasjon Nedspinning cellene av sentrifugering røret 9000 x g for 1 min. Forkast 70% nedbryting av pipettering og oppløse pellet venstre over media.
- Spre celle suspensjon på en Luria kjøttkraft (LB) agar plate som inneholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber platen i 16 h på 37 ° C.
- Velg en isolert kolonien og vaksinere det i 10 mL LB-ampicillin medium i en 50 mL tube. Inkuber røret på 37 ° C i en shaker for overnatting. Denne bruk 100 µL av kultur fra 50 mL tube for å vaksinere 100 mL LB-ampicillin media. Inkuber kolbe på 37 ° C i en shaker på 180 rpm og bruke den som primær kultur. Neste dag, bruke 6 mL hver primære kultur for å vaksinere 15 flasker, hver med 600 mL LB-ampicillin media. Nå ruge 15 flasker på 37 ° C i en shaker på 180 rpm.
Merk: For å bekrefte transformert kloner, utføre DNA sekvensering eller begrensning fordøyelsen med den isolerte plasmider DNA. - For å sjekke tettheten av bakteriell kultur, måle dens OD600 bruker et spektrofotometer. Etter kultur når en tetthet av 0,8 på OD600, induserer uttrykk for TET2 protein med 300 µL av 1 M (siste konsentrasjon på 0,5 mM i 600 mL) IPTG i hver kolbe og videre vokse kulturen 16 h på 17 ° C.
- Etter 16 h, overføre bakteriell kultur til sentrifuge flasker. Sentrifuge bakteriell kultur uttrykke TET2 enzymet 5,250 x g i 45 min. Bruk den bakterielle pellet for TET2 rensing.
Merk: Utfør alle andre protein rensing trinnene på isen eller på 4 ° C. - Resuspend bakteriell pellet i 100 mL 50 mM MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer, pH 6 og sonicate for 5 × 30 s på makt 20 med 60 s kjøling intervaller.
- Spinn lysate 5,250 x g i 45 min. samle nedbryting inneholder løselig TET2 enzymet og passere 0.45-µm filtrerer før lasting på et FPLC system.
Merk: I disse eksperimentene, TET2 enzymet var veldig stabil, men om nødvendig en protease hemmer cocktail med 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluor (PMSF) og 0,5 mM 1,10 -o- phenanthroline kan legges til cellen lysate til hindre nedbrytning av TET2 enzym. Unngå å bruke EDTA eller EGTA i inhibitor cocktail som dette kan påvirke følgende cation exchange kromatografi. - Pack 30 mL av en sterk cation exchange harpiks i en FPLC-kolonne. Equilibrate kolonnen med 10 seng mengder vaskebuffer (50 mM MES buffer, pH 6) frekvensen konstant flyt av 0,3 mL/min med en FPLC system.
- Laste den avklart lysate på pre equilibrated kolonne og vask med ∼10 seng mengder vaskebuffer til flyten gjennom blir klart.
- Elute TET2 bruker en 0-100% gradient fra vaskebuffer til elueringsbufferen (50 mM MES buffer, pH 6, 1 M NaCl) i 15 seng bind etterfulgt av holder på 100% elueringsbufferen for to soverom volumer.
Merk: Prøver (100 µL hver) av cellen lysate før og etter kolonnen lasting sammen med alle elueringsrør fraksjoner og analysere på 10% løse SDS-side. - Basseng med TET2 protein fraksjoner, fryse tørr, oppløse enzym pall i 10 mL vann og butikk på-80 ° C.
2. 5mC oksidasjon av TET2 Dioxygenase
- Utfør alle demethylation reaksjoner i tre eksemplarer med 3 µg av substrat (25-mer double-strandet DNA, tabell 2).
- Legge til 100 µg av renset TET2 enzym i 50 µL totale reaksjon bufferen som inneholder 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), og 2 mM ascorbate og Inkuber ved 37 ° C i 1 h21.
- Slukke TET2 katalysert reaksjoner med 5 µL av 500 mM EDTA.
- Etter slukke TET2 reaksjoner, forberede prøver LC--MS-/ MS analyse ved å skille DNA fra TET2 reaksjonsblandingen bruker oligo rensing kolonner.
- Legge til 100 µL oligo bindende bufferen 55 µL av Let reaksjon.
- Denne legge til 400 µL av 100% etanol blandingen. Passere denne blandingen gjennom en oligo bindende kolonne.
- Vask bundet DNA med 750 µL vaskebuffer og elute i 20 µL vann.
- Fordøye isolert DNA med 2 enheter av DNase jeg og 60 enheter av S1 nuclease ved 37 ° C i 12 h å produsere enkelte nukleosid-monophosphates.
- Etter fordøyelsen, Legg 2 enheter av kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIAP) i prøvene og ruge for tillegg 12 h på 37 ° C fjerne terminal fosfat gruppene fra nukleosid-monophosphates å få nucleosides.
- Kvantifisere alle nucleosides, spesielt modifisert cytosines, ved hjelp av LC--MS-/ MS metoden beskrevet nedenfor.
3. kvantitativ LC-MS/MS-baserte analysen utvikling
- Forberede 100 µM lager løsning av alle endrede cytosine nucleosides [5-metyl-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) og 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] og normal DNA baser (adenine, thymine, cytosine og guanine) i HPLC-grade vann for utvikling av LC--MS-/ MS metoden.
- Optimalisere nukleosid-avhengige MS-/ MS parametere av infusjonen lager løsninger, en om gangen, i masse spectrometer på en flow rate på 10 µL/min i EMS scan modus. Optimalisere følgende parametere: Declustering potensielle (DP), potensielle inngangen (EP), kollisjon celle inngangen potensielle (CEP), kollisjon energi (CE) og kollisjon celle Exit potensielle (CXP) for hver DNA nukleosid bruke automatisert kvantitative optimalisering funksjon av programvaren.
- Optimalisere kilde-avhengige MS-/ MS parametere av sprøytebruk 10 µL av lager løsning ved hjelp av en gradient med 25% løsemiddel B på en strømningshastighet på 0,3 mL/min der løsemiddel A er 10 mM ammonium acetate (pH 4.0) og løsemiddel B er 20% acetonitrile med 10 mM ammonium acetate (pH 4.0). Optimalisere følgende parametere: gardin gass (CUR): 10-50, temperatur: 0-600 ° C, gass Flow 1 (GS1): 0-50, gass strømmer 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktivert dissosiasjon (CAD): lav middels høy, Ion spray spenning (er): 4000-5500 for hver DNA nukleosid bruker manuelle funksjonen for kvantitative optimalisering av programvaren i FIA (Flow injeksjon analyse) modus.
- Separate alle åtte DNA nucleosides, utføre flytende kromatografi bruker følgende graderingen: 0% løsemiddel B (0-2 min), 0-20% løsemiddel B (2-5 min), 20-60% løsemiddel B (5-9 min), 60-0% løsemiddel B (9-10 min) og deretter equilibrate med løsemiddel A i 5 min på en strømningshastighet på 0,3 mL/min for en C18 kolonne (partikkelstørrelse: 5 µm, Pore størrelse: 120 Å).
- Med de optimale MS-/ MS parameterne (trinn 3.2 og 3.3) kombinert med ovennevnte flytende kromatografi gradient (trinn 3.4), bestemme svar linearitet, grensen for påvisning (LOD) og nedre grense for kvantifisering (LLOQ) bruker en todelt føljetong fortynning av en 100 µM standard blanding som inneholder alle åtte nucleosides. Tegne standard kurver for alle åtte DNA nucleosides.
- Oppdage og kvantifisere alle nucleosides, spesielt modifisert cytosines, produsert i trinn 2.4 LC--MS-/ MS metoden og standard kurver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dynamisk endring av 5mC i DNA av TET-serien dioxygenases spiller viktige roller i epigenetic transcriptional forskrifter. TET2 dioxygenase er ofte mutert i ulike blodkreft malignitet12. Undersøke rollen av TET2 enzym i normal utvikling og sykdom, har vi klonet sitt minimale katalytisk aktive domene uten noen affinitet tag inn pDEST14 vektor22. Den ukodede TET2 dioxygenase ble produsert på ∼5% av det totale løselig proteinet av SDS side analyse i bakteriell E. coli BL21 (DE3) celler. Siden TET2 katalytisk domenet har et relativt høye isoelectric punkt (∼7.49), sammenlignet med mest urfolk E. coli proteiner24,25,26, en effektiv renselsesprosess utnytte en cation Exchange kromatografi ble utviklet. Denne renselsen gitt > 90% ren TET2 enzym i ett enkelt trinn (figur 1).
For å skille og kvantifisere forskjellige deoxycytidines derivater og andre fire naturlige DNA baser etter TET2 enzymatiske reaksjonen, var en følsom LC-MS/MS-baserte analysen optimalisert. Den flytende kromatografi brukt snudd-fase C18 kolonner. Standard kurver var tegnet med føljetong fortynninger av en blanding som inneholder alle nucleosides (figur 2). På graderingen som brukes for flytende kromatografi, beskrevet i den eksperimentelle prosedyren, kunne løse alle åtte nucleosides (Figur 3). LC oppbevaring ganger (tr) for alle åtte nucleosides er beskrevet i tabell 3. Vi fremme optimert MS påvisning av hver forelder ion nukleosid (Q1), den mest intense produktet ion (Q3) ved å fastsette deres declustering potensial (DP), inngangen potensial (EP), kollisjon celle inngangen potensielle (CEP), kollisjon energi (CE), grensen påvisning (LOD) og nedre grense for kvantifisering (LLOQ) (tabell 3). Endelig en LC--MS-/ MS metoden ble utviklet som kan skille og kvantifisere fire vanlige DNA baser (A, T, G og C), samt fire modifisert cytosine baser (5-metyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl) (Figur 3).
Aktiviteten til ukodede TET2 dioxygenase var fast bestemt på å bruke en 25-mer dsDNA med en 5mC i en CpG øy i hver DNA strand (tabell 2). Etter TET2 enzymatiske reaksjoner, ble DNA oligonucleotides renset og konverteres til nucleosides. Disse nucleosides ble deretter utsatt for LC--MS-/ MS analysen. Reaksjonene uten TET2 enzymet (negativ kontroll), var bare dA, dT, dG, dC og 5mdC topper observert. Men i positiv kontroll reaksjonen, som inneholdt TET2 dioxygenase, ble to nye topper tilsvarer d5hmC og d5fC observert. Vi var ikke kjøpedyktig merker dannelsen av d5caC nukleosid sannsynligvis sin dårlig påvisning nivåer (figur 2). Disse resultatene viser at den ukodede TET2 dioxygenase renset i denne fremgangsmåten er katalytisk aktive og kan brukes til å karakterisere wt-TET2 enzymet og sin kliniske mutanter.
Figur 1. SDS side analyse av renset TET2 dioxygenase fra E. coli BL21 (DE3) celler. Lane A angir markøren mens lane B Angir TET2 protein renset med SP sepharose ionebytte harpiks. Den totale størrelsen på de ukodede TET2 dioxygenase er ∼54 kDa som pilens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Standard kurver var uavgjort for fire naturlige DNA nucleosides og ulike cytosine derivater, som ble deretter brukt for kvantifisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Flytende kromatografi (nederst) og MS-/ MS (over) metoden brukes til å skille og karakterisere fire naturlige DNA nucleosides og ulike cytosine derivater.
| Primer navn | Primer sekvens | |||
| TET2 fremover primer | 5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3 " | |||
| TET2 Omvendt Primer | 5-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3 " | |||
Tabell 1: Sekvensen av DNA oligonucleotide primere brukt for PCR forsterkning av katalytisk domenet til ukodede menneskelig TET2 dioxygenase.
| Primer navn | Primer sekvens |
| Følelse Strand | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3 " |
| Antisense Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3 " |
Tabell 2: Sekvensen av den forstand og anti-følelse 25-mer dsDNA oligonucleotide brukt som et TET2 substrat for i vitro reaksjoner.
| Nucleosides | Q1 | Q3 | tr (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2-deoxyadenosine | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6,29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0,1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-metyl-2-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0,1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2-deoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0,66 | 0.998 | |
| 5-carboxy-2-deoxycytidine | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tabell 3: Optimalisert LC--MS-/ MS parametere av fire naturlige DNA nucleosides og ulike cytosine derivater under positivt ion modus. For hver forelder ion nukleosid (Q1), ble den mest intense produktet ion (Q3) oppdaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutasjoner i genet TET2 er noen av de oftest har oppdaget genetiske endringene i pasienter med ulike blodkreft malignancies. Hittil hundrevis av forskjellige TET2 mutasjoner, som inkluderer tull, ramme-shift og eks. missense mutasjoner, har blitt identifisert i pasienter12. Pasienter med TET2 mutasjoner viser lave nivåer av genomic 5hmC i beinmargen sammenlignet med de med wt-TET214. Mutant TET2 bank i eksperimenter har recapitulated effekten av disse mutasjonene på 5hmC nivåer i transfekterte celler14. Resultater fra TET2-knockout musen modeller viste at nivået av TET2 enzym omvendt korrelert med utviklingen av blodkreft malignitet17,18,19,20. Konsekvent, Zhang et al. nylig vist at ned-regulering av TET2 uttrykk nivåer er en potensiell prognostiske og prediktiv biomarkør i cytogenetically vanlig akutt myelogen leukemi27.
Til tross for økende bevis for at TET2 spiller en grunnleggende rolle i normal hematopoiesis og myelogen transformasjon, biokjemiske karakterisering av wt- og mutant TET2 forblir på rudimentære stadier på grunn av problemer knyttet til produksjon av aktive TET2 og dens analysen. De fleste studier har produsert rekombinant TET2 enten bruke tidkrevende baculovirus systemet i insekt celler14, eller som en glutation S-transferase affinitet koden i bakterielle celler som krever fjerning av affinitet tag21.
I denne eksperimentelle prosedyren beskrevet vi kloning av ukodede menneskelig TET2 dioxygenase katalytisk domene ved hjelp av en områdespesifikk rekombinasjon teknikk og effektiv uttrykket bruker destinasjon vektor (pDEST14) i E. coli. Fordi det isoelectric punktet ukodede TET2 er relativt høy (∼7.49) sammenlignet med de fleste urfolk E. coli proteiner, vi utviklet en effektiv renselsesprosess utnytte en cation exchange kromatografi gir > 90% ren ukodede TET2 enzymet i ett enkelt trinn.
Videre, i tillegg utfordringene finnes i kvantifiseringen wt- og mutant TET2 dioxygenase aktivitet. For disse eksperimentene, de fleste studier har stolt på antistoff-baserte analyser som dot-blots14,28, enzym knyttet immunosorbent søk (ELISA)29, etc. fordi disse analyser bruker vanligvis bare én antistoff, eksempel 5hmC eller 5fC or5caC, deteksjon av 5mC endring i underlaget DNA, de ikke gir et fullstendig bilde av katalytisk reaksjon båret av TET isoformene. For disse grunner, har LC-MS/MS-baserte analysen framstått som eneste analysen å kvantifisere forskjellige cytosine modifikasjoner. I denne forbindelse har vi utviklet en roman flytende kromatografi metode som kan skille fire vanlige DNA baser (A, T, G og C), samt fire modifisert cytosine baser (5mC, 5hmC, 5 fC og 5caC).
For å kvantifisere de åtte nucleosides fra TET2 katalysert reaksjoner, har vi kombinert vår forbedrede flytende kromatografi metode med tandem massespektrometri. Denne sensitive LC--MS-/ MS analysen ble deretter benyttet for å avgjøre aktiviteten av rekombinant ukodede menneskelige TET2 enzymet. Fremgangsmåten beskrevet her vil kraftig forbedre evalueringen av wt- og mutant TET2 dioxygenase aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser å erklære.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av det amerikanske forsvarsdepartementet i form av en idé Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi og MDS stiftelse stipend, og UMRB grant mm Authors takke Mohit Jaiswal og Subhradeep Bhar for første kloning av TET2 i pDEST14 vektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
