Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57836
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 5, 3, 1,2,3, 1,2
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Summary

Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол изучать белок белковых взаимодействий между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Этот метод подходит для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы на гипоксии.

Abstract

Низкой кислорода (гипоксии) вызывают различные меры адаптационного реагирования с гипоксией индуцибельной фактор 1 (HIF-1) комплекс, действуя в качестве главного регулятора. HIF-1 состоит из кислорода регулируется α субъединица гетеродимерная (HIF-1α) и конститутивно выразил β-субъединица (HIF-1β) также известен как арил углеводородов рецептор ядерной вступают (ARNT), регулирующие генов, участвующих в различных процессах, включая ангиогенеза , эритропоэза и гликолиз. Идентификация HIF-1 взаимодействуя протеины является ключом к пониманию гипоксии, сигнальный путь. Помимо регулирования HIF-1α стабильности гипоксия также вызывает ядерной транслокации многих факторов транскрипции, включая HIF-1α и ARNT. В частности большинство нынешних методов, используемых для изучения таких взаимодействий протеин протеина (ИЦП) основаны на системах, где уровни белка искусственно увеличить через гиперэкспрессия белка. Гиперэкспрессия белка часто приводит к не физиологические результаты, вытекающие из временных и пространственных артефактов. Здесь мы описываем модифицированных co иммунопреципитация протокола после лечения гипоксии с использованием эндогенного ядерных белков и как доказательство концепции, чтобы показать взаимодействие между HIF-1α и ARNT. В этом протоколе гипоксических клетки были собраны в гипоксических условиях и Дульбекко физиологический Phosphate-Buffered (DPBS) мыть буфер был также предварительно уравновешенной гипоксические условия перед использованием смягчения последствий деградации белка или комплекс белков диссоциация во время реоксигенацию. Кроме того ядерная фракций впоследствии были извлечены сконцентрироваться и стабилизировать эндогенного ядерных белков и избежать возможных ложных результатов, часто видели во время гиперэкспрессия белка. Этот протокол может использоваться для демонстрации эндогенных и родной взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях.

Introduction

Гипоксия происходит, когда недостаточно кислорода поступает в клетки и ткани тела. Она играет важную роль в различных физиологических и патологических процессах дифференцировки стволовых клеток, воспаление и рака1,2. Гипоксия индуцибельной факторов (HIFs) функции гетеродимерами состоит из кислорода регулируется α-субъединицы и конститутивно выраженной β-субъединица также известен как ARNT3. К настоящему времени было выявлено три изоформ субблоков HIF-α (HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α) и три HIF-β-субъединиц (ARNT/HIF-1β, ARNT2 и ARNT3). HIF-1α и ARNT повсеместно выражается, тогда как HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 и ARNT3 имеют более ограниченный выражение модели4. Комплекс белков HIF-1 является ключевым регулятором ответ гипоксии. В гипоксических условиях HIF-1α стабилизируется, затем translocates в ядро и последнего с ARNT5. Впоследствии этот комплекс связывается с конкретным нуклеотидов, известный как гипоксия реагировать элементов (HREs) и регулирует выражение генов-мишеней участвует в различных процессах, включая ангиогенеза, эритропоэза и гликолиз6. Помимо этого «канонической» ответ, гипоксия сигнальный путь также известен уровень помех с несколькими клеточный ответ, сигнальные пути как вырезка и ядерного фактора Каппа B (NF-κB)7,8,9.

Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для лучшего понимания гипоксии, сигнальный путь. В отличие от ARNT, которая нечувствительна к уровень кислорода и конститутивно выраженной, уровни белка HIF-1α плотно регулируется клеточного кислорода. В normoxia (21% кислорода) HIF-1α белки являются быстро деградированных10,11. Короткий период полураспада HIF-1α на normoxia представляет конкретные технические проблемы для обнаружения белка от выдержек клетки, а также для идентификации HIF-1α-взаимодействия белков. Кроме того несколько факторов транскрипции, в том числе HIF-1 комплекса перемещают в ядре при гипоксических условий12,,1314. Большинство нынешних методов, используемых для исследования PPI выполняются с использованием не физиологические гиперэкспрессия белков. Сообщается, что такие гиперэкспрессия белка причиной различных клеточных дефекты через несколько механизмов, включая перегрузки ресурсов, нейтро дисбаланс, неразборчивый взаимодействия и пути модуляции15,16. С точки зрения исследований PPI гиперэкспрессия белка может привести к ложный положительный, или даже ложные отрицательный, результаты в зависимости от свойства белков и функции гиперэкспрессия белка. Таким образом нынешние методы PPI исследований должны быть изменены для того, чтобы выявить физиологически соответствующих ИЦП в гипоксических условиях. Ранее мы продемонстрировали взаимодействие между HIF-1 и Ets семьи транскрипционный фактор GA-связывающий белок (GABP) в гипоксических P19 клеток, что способствует ответ промоутер Hes1 гипоксии17. Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол для изучения ИЦП между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Взаимодействие между HIF-1α и ARNT показано как доказательство концепции. Этот протокол предназначен для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях, включая, но не ограничиваясь идентификации HIF-1 взаимодействуя белками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол раздел, который использует человеческих эмбриональных почек 293A (HEK293A) клеток, s соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человеческого в Nanyang технологический университет, Сингапур.

1. индукция гипоксии в HEK293A клетках

  1. Подготовить четыре блюда 10 см и семян 3 – 5 x 10-6 HEK293A клетки за блюдо в 10 мл Дульбекко изменение орла среднего (DMEM, 4,5 г/Л глюкозы) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, пируват натрия 110 мг/Л, 100 ед/мл пенициллин и 100 мг / Мл стрептомицина. Культура клетки в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
    Примечание: Заполнение ячейки должны осуществляться в биологической безопасности кабинета (BSC). С 70% этанол следует протереть поверхности всех материалов, чтобы быть помещены в BSC.
  2. 24 ч после посева, когда клетки достигли 80 – 90% confluency, положить два блюда в subchamber гипоксии в инкубатор бардачком (см. Таблицу материалы) с 1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C и держать два других блюд в normoxia (21% O 2, 5% CO2 при 37 ° C) для 4 ч. использовать один набор нормоксические и гипоксии клетки для оценки лечения гипоксии на западной помарке и использовать другой набор ячеек для co иммунопреципитация экспериментов.
    Примечание: Уровни кислорода могут быть установлены в 0 – 5% и продолжительность лечения гипоксии может изменяться в зависимости от типа клеток и изучить цели.

2. вся ячейка и ядерной добыча

Примечание: См. таблицу 1 для получения информации о буферы, используемые в настоящем Протоколе.

  1. Урожай клетки normoxia управления.
    1. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки с 10 мл DPBS (рН 7,0-7,2) с помощью пипетки 10 мл.
      Примечание: Не прикасайтесь к монослою клеток с пипеткой. Во время стирки, аккуратно Пипетка DPBS вниз по стене плиты культуры клеток во избежание потери клеток.
    2. Пипетка 5 мл ледяной DPBS в пластину и циклюют клетки с поверхности пластины в ледяной PBS с скребок ячейки.
    3. Передача суспензию клеток в 15 мл конические трубы и держать на льду.
  2. Урожай клетки культивировали в гипоксических условиях.
    1. Предварительно сбалансировать DPBS гипоксических условий, поместив открытая 100 эксперимент стекла реагентов мл заполнены с DPBS в subchamber гипоксии (1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C) за 24 часа заранее.
    2. Примерно 1 час до уборки лечение гипоксии клетки, поместите лед окно, содержащее льда в камеру обработки бардачком, который сбалансирован для 1% O2 и 5% CO2. Передача флакон, содержащий предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS от гипоксии subchamber в камеру обработки и поместите его на льду.
    3. 4 h после лечения гипоксии, передачи клетки от гипоксии subchamber в камеру обработки, которая была предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2.
    4. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки один раз с 10 мл ледяной предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS с 10 мл Пипетка.
    5. Добавьте 5 мл ледяной предварительно уравновешенной DPBS с 5 мл Пипетка и выбить клетки, соскоб с скребок ячейки.
    6. Наклона пластины культуры клеток и собирать отдельные клетки, с помощью пипетки 10 мл. Перевести суспензию клеток в DPBS на 15 мл конические трубы и держать на льду.
    7. Откройте дверь между обработки и буфера палаты бардачком, оба из которых были предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2. Передача 15 мл конические трубы на льду, содержащих лечение гипоксии клетки от обработки камеры в камеру буфера. Откройте дверь в камеру буфера и полностью удалить ячейки с бардачком.
  3. Пелле как нормоксические клетки от 2.1 и гипоксии клетки от 2.2 центрифугированием на 1000 x g 5 мин при 4 ° C.
  4. Подготовьте клеточных экстрактов.
    1. Ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл буфера lysis ледяной радио иммунопреципитации пробирного (RIPA), содержащий 50 мм Trisaminomethane гидрохлорид (Tris-HCl) рН 8,0, 150 мм хлорид натрия (NaCl), 1% tergitol тип NP-40 (NP-40), 0,5% Дезоксихолат натрия, и 0,1% лаурилсульфат натрия (SDS), дополнены 1 x коктейль ингибитор протеазы (см. Таблицу материалы), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. Передача lysates клетки в новой microcentrifuge 1.5 мл пробирок и держать на льду на 30 мин с случайные vortexing.
    3. Центрифуга lysates клетки на 13 000 x g 10 мин при 4 ° C.
    4. Собирать супернатанта, аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре-80 ° C.
  5. Подготовить ядерной выдержки, с использованием ядерных добыча комплект (см. таблицу материалы).
    1. Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл NL буфера lysis дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М Дитиотреитол (DTT), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. 25 мкл моющего раствора NP суспензию клеток и вихревые для 10 s на максимальной скорости.
    3. Центрифуга на 10000 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Супернатант (цитоплазматических экстракты), аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы, собирать и хранить при температуре-80 ° C.
    5. Ресуспензируйте гранулы, содержащие клеточных ядер в 500 мкл буфера lysis NL, дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М DTT vortexing для 5 s на максимальной скорости.
    6. Центрифуга на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и сохранить ядерный Пелле.
    7. Ресуспензируйте ядерной Пелле в 50 мкл извлечения буфер NX1 дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль закупорить Пелле вверх и вниз несколько раз.
    8. Инкубируйте 30 минут на льду, vortexing для 10 s каждые 5 минут на максимальной скорости.
    9. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C.
  6. Опреснения ядерной экстрактов.
    1. Соберите супернатант от шага 2.5.9 и передаче в устройства мини-диализа с максимальный объем 100 мкл на единицу.
    2. Крышка устройства мини-диализа и поместите их в устройство флотации.
    3. Поставьте устройство флотации в стакан, содержащий 500 мл буфера предварительно охлажденные диализа (20 мм трис-HCl рН 7,4, 20% глицерина, 100 мм хлористый калий (KCl), 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,2 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и 0,5 мм DTT) и Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C с мягким перемешиванием.
      Предупреждение: PMSF опасных. Избегайте прямого контакта с кожей или вдыхания.
    4. Сбор образцов от угла мини диализа устройств и передачи в новые трубы microcentrifuge 1,5 мл.
    5. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C, аликвота 25 мкл каждого супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубку и хранить при температуре-80 ° C.

3. Оценка лечения гипоксии, обнаружение выражения протеина и внутриклеточных локализации HIF-1α

  1. Определите концентрацию белка всей ячейки или ядерных/цитоплазматических экстрактов, используя Гонав assay bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного комплекта согласно инструкции производителя18.
  2. Разбавить lysates клетки в 1 буфер образца x Laemmli, содержащих 5% 2-меркаптоэтанол и варить при 95 ° C за 5 мин.
    Предостережение: Не прикасайтесь к поверхности Отопление блока, так как это может вызвать ожоги.
  3. Отделить белки, электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE).
    1. Загрузите равных количеств белка (25 мкг) в каждую лунку градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%), наряду с 3 мкл маркер молекулярного веса.
    2. Побегите гель в управлении буфер, содержащий 2,5 мм трис, 19.2 мм глицин, 0,01% SDS, PH8.3 на 30 мин в 200 V.
  4. Передать нитроцеллюлозные мембранные белки от геля.
    1. Соберите передачи сэндвич (Бумага фильтровальная бумага гель мембраны фильтр) с гелем на стороне анода и мембраны на стороне катода кассеты.
    2. Установите кассету в передачи бак заполнен буфер передачи, содержащий 2,5 мм trisaminomethane (Tris), 19.2 мм глицин и 20% метанола.
      Предупреждение: Метанол легковоспламеняющихся и должны храниться внутри Легковоспламеняющиеся жидкость хранения кабинета.
    3. Осуществлять передачи для 1 h 100 V в холодной комнате.
  5. Блокировать пятно в 10 мл блокирующий буфер, содержащий 50 мм трис-Cl (рН 7,6), 150 мм NaCl, 0.1 анимации 20 и 5% обезжиренное молоко за 1 ч при комнатной температуре на шейкер.
  6. Инкубировать блот с анти HIF-1α антитела (1/500 разрежения) в тот же блокирующий буфер на ночь при 4 ° C.
  7. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  8. Инкубировать блот с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело (1/1000 разрежения) в 10 мл TBS-T содержащие 5% обезжиренное сухое молоко, за 1 ч при комнатной температуре.
  9. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  10. Смесь 500 мкл каждого расширения chemilumescent (ЭСЛ) реагента A и B в пробки microcentrifuge 1,5 мл и вихревой кратко.
  11. Применить ECL субстрата к пятно и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  12. Захват хемилюминесцентный сигналов с помощью зарядовой (связью ПЗС) системы на основе камеры.
    1. Слейте излишки ECL субстрата, прикоснувшись край мембраны с папиросной бумаги и мембраны в лист протектор.
    2. Поместите мембраны образца поддон CCD камеры-на основе изображений системы.
    3. Запуск программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалы) и захвата изображения со следующими параметрами: файл → новый протокол → → на один канал протокола установки → гель изображений (приложение: Панджаб; Область изображения: Био-Rad готов лари; Imaging экспозиции: Программное обеспечение будет автоматически оптимизировать время экспозиции для интенсивных полос) → запустить протокол
      Примечание: Время экспозиции можно вручную задать для достижения оптимального изображения.

4. иммунопреципитации и обнаружение белков Immunoprecipitated

  1. Вымойте 50 мкл протеина A/G sepharose бусины в 500 мкл буфера TBS в 1,5 мл microcentrifuge трубы и Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при 4 ° C.
  2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте бисер в 100 мкл буфера TBS.
  3. 2 мкл антител моноклональных анти ARNT мыши (1,4 мг/мл) или мыши иммуноглобулина G (IgG) (1,4 мг/мл), который был подготовлен воссоздания мыши IgG 0,7 мг в 500 мкл буфера TBS.
  4. Место 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие бусины в ротатор трубки и проинкубируйте втечение 2 ч 10 об/мин в холодной комнате.
    Примечание: Осторожно обрабатывать трубы и держать суспензии, содержащей бусины в нижней части трубки.
  5. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C и отбросить supernatants.
  6. Разбавьте 200 мкг ядерных белков lysate полученные в шаге 2.6.5 в 800 мкл буфера IP, состоящий из 50 мм трис-HCl (рН 7,4), 180 мм NaCl, 20% глицерина, ингибитор протеазы NP-40 и 1 x 0,2% коктейль. Инкубировать lysate антител в сочетании бисером, полученного на шаге 4.5 на ночь при 4 ° C.
  7. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, отменить supernatants и мыть бисер 3 раза с 1 мл ледяной TBS, содержащие 0,2% NP-40.
  8. Отварите бусины в буфер образца Лэмли 50 мкл на 95 ° C за 5 мин.
  9. Центрифуга бусы на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, собирать супернатанта и отбросить бисер.
    Примечание: Супернатант может храниться при температуре 4 ° C на короткий срок или от-20 ° C в долгосрочной перспективе.
  10. Обнаружить присутствие HIF-1α от белковых комплексов immunoprecipitated, Западная помарка, как описано в шаге 3,3 года.
    Примечание: Белка количественной оценки не требуется для этого шага. Загрузить полный объем (50 мкл) в надосадке каждого образца в каждой скважине градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы оценить клеточный ответ к гипоксии, выражение были рассмотрены уровни и внутриклеточных локализации компонентов комплексного лечения следующих гипоксии HIF-1. HEK293A клетки были культивировали в гипоксических условиях для 4 h или храниться в normoxia как элементы управления. HIF-1α и ARNT белка уровнях были рассмотрены в целом ячейке или ядерных/цитоплазматических извлекает западную помарку. Как ожидается, Общая HIF-1α уровни были upregulated, гипоксия, тогда как уровни ARNT в целом сотовой лизатов не были значительно изменены (рис. 1A). Кроме того гипоксия индуцированной ядерной накопление HIF-1α и ARNT в HEK293A клеток (рис. 1B), что согласуется с предыдущими докладами, хотя цитоплазматических выражение ARNT не было обнаружено в некоторых из протестированных клеток линии19.

Далее мы продемонстрировали взаимодействие между HIF-1α и ARNT, после лечения гипоксии. Ядерные экстрактов были подготовлены от HEK293A клеток, подвергается нормоксические или гипоксических условий для 4 h. Co Иммунопреципитация эксперименты были проведены с использованием ядерных выдержки из HEK293A клеток. Как показано на рисунке 2, HIF-1α был co-immunoprecipitated вместе с ARNT от ядерной экстракты гипоксическая HEK293A клеток.

Вместе взятые, описал может успешно использоваться протокол побудить гипоксических ответ в клетках, и для дальнейшего определения физиологических белка связывание эндогенно выразил HIF-1α/ARNT комплексов в ядре.

Figure 1
Рисунок 1: Регулирование выражения протеина и внутриклеточных локализация компонентов HIF-1 от гипоксии. (A) анализ Immunoblot всего HIF-1α или ARNT выражения в HEK293A клетках. Клетки были подвержены гипоксии за 4 ч (H) или в normoxia (N). Белки из состава клеточных экстрактов были разделены SDS-PAGE и проанализированы immunoblotting с анти HIF-1α, анти ARNT и антител анти Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH). GAPDH используется как элемент управления загрузки. (B) анализ Immunoblot HIF-1α и ARNT выражения в субцеллюлярные фракций HEK293A клеток. HEK293A клетки были культивировали в гипоксических условиях для 4 h (H) или в normoxia (N). 25 мкг белка от ядерного или цитоплазматическая экстрактов были проанализированы с помощью анти HIF-1α, анти ARNT, анти Инь и Ян 1 (YY1) immunoblotting и анти GAPDH антител. YY1 и GAPDH были использованы в качестве загрузки элементов управления для ядерные и цитоплазматические фракций, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: HIF-1α взаимодействует с ARNT в гипоксических условиях. HEK293A клетки были подвержены гипоксии за 4 ч или хранится в normoxia как элементы управления. Ядерная, были подготовлены выдержки из HEK293A клеток и immunoprecipitations были выполнены с использованием антител анти ARNT. Ядерное извлекает (вводимые ресурсы) и immunoprecipitated белки были проанализированы с использованием антител анти HIF-1α, анти ARNT и анти YY1 immunoblotting. YY1 был использован как элемент загрузки для входов в то время как IgG был использован как отрицательный контроль для co иммунопреципитация экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Решение Компоненты Комментарии
Диализ буфер 20 мм трис-HCl (рН 7,4), 20% глицерина, 100 мм KCl, ЭДТА 0,2 мм, 0,2 мм PMSF и 0,5 мм DTT Добавление PMSF и DTT непосредственно перед использованием.
Идущий буфер 2.5 мм трис-HCl (рН 8.3), 19.2 мм глицин и 0,01% SDS Смешать 100 мл 10 x буфер Tris/глицин/SDS с 900 мл ddH2O.
Передача буфера 2.5 мм трис-HCl (рН 8.3), 19.2 мм глицин и 20% метанола Смешать 100 мл 10 x буфер Tris/глицин с 200 мл метанола и 700 мл ddH2O.
TBS буфер 50 мм трис-Cl (рН 7,6) и 150 мм NaCl Смешать 100 мл 10 x TBS буфер с 900 мл ddH2O.
TBS-T буфер 50 мм трис-Cl (рН 7,6), 150 мм NaCl и 0.1% 20 анимации Смесь 100 мл 10 x TBS буфер с 900 мл ddH2O и 1 мл раствора 20 анимации.
Блокирует буфер 50 мм трис-Cl (рН 7,6), 150 мм NaCl, 0.1% анимации 20 и 5% обезжиренное молоко Растворяют 5 g блокатор промокательной-класса в 100 мл TBS-T буфера.
IP буфер 50 мм трис-HCl (рН 7,4), 180 мм NaCl, 20% глицерина, ингибитор протеазы NP-40 и 1 x 0,2% коктейль Добавьте коктейль ингибитор протеазы непосредственно перед использованием.

Таблица 1: Приготовления раствора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Комплекс HIF-1-главный регулятор клеточного кислорода гомеостаза и регулирует множество генов, участвующих в различных клеточных адаптационного реагирования к гипоксии. Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для понимания гипоксических сигнала. Co Иммунопреципитация эксперименты обычно используются для исследования ИЦП для разграничения сотовой сигнальных путей. Однако гиперэкспрессия белка до сих пор широко используется, и это может привести к экспериментальных артефактов. Кроме того HIF-1α является крайне нестабильным белок и он становится быстро деградировавших течение реоксигенации11. Кроме того гипоксия триггеров ядерной транслокации HIF-1 компонентов в наиболее млекопитающих клеточных линий. Таким образом обычные co иммунопреципитация протоколы должны быть оптимизированы для идентификации физиологически соответствующих HIF-1 взаимодействуя протеины после лечения гипоксии. Здесь мы описываем модифицированных co иммунопреципитация протокол, который используется для демонстрации взаимодействие между HIF-1α и ARNT при гипоксии.

Чтобы избежать деградации HIF-1α во время реоксигенации, гипоксических клетки были собраны в камере обработки бардачком инкубатор, который был предварительно достижение равновесного уровня в гипоксических условиях. DPBS мыть буфер был также достижение равновесного уровня в гипоксических условиях перед использованием. Если Рабочая станция не гипоксии доступен для обработки, гипоксии клетки можно стирать с предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS и после этого быстро собрали на льду. Учитывая, что гипоксия может вызвать ядерный транслокации компонентов HIF-1 и что гиперэкспрессия белка может побудить артефакта результаты, эндогенного ядерных белков были использованы в настоящем Протоколе. Использование ядерных экстрактов в протоколе co иммунопреципитация также была зарегистрирована20. Он представляет собой техническое преимущество для изучения взаимодействий между ядерных белков, потому что она минимизирует вероятность ядерных белков от быть разбавлена поклеточного белков. Кроме того использование ядерных экстрактов могут быть полезны для сокращения неспецифичные взаимодействия, особенно от очень обильные нерелевантных цитоплазматических белков и для улучшения стабильности ядерных белков путем минимизации воздействия протеазы присутствует в цитоплазме. Использование внутреннего ядерного экстрактов вместо клеточных экстрактов для co иммунопреципитация показывает значительное улучшение технических, как только мы можем обнаружить взаимодействие между HIF-1α и GABPα с помощью эндогенного ядерных экстракты, но не с помощью всего клетки извлекает17.

В протоколе описаны несколько условий может быть оптимизирован для улучшения результатов. Мы индуцированной гипоксии в HEK293A клетках, рассматривая их с 1% кислорода для 4 ч. Однако уровень кислорода и продолжительность лечения гипоксии могут варьируется для различных типов клеток и скорректированы в зависимости от цели исследования. Например HIF-1α и HIF-2α дифференциально регулируется гипоксии клетки типа определенным образом, указанием их различные роли в различных биологических контекстах. Было показано, что в клетках нейробластомы, HIF-1α наиболее активных в течение коротких периодов интенсивных гипоксии (1% O2), тогда как HIF-2α активен также под легкой гипоксии (5% O2) и становится более активное последующее лечение хронической гипоксии (48-72 ч гипоксического воздействия)21. 0 – 5% O2 уровни обычно используются для лечения гипоксии в пробирке , где 1 – 5% O2, 0.1-1% O2 и 0-0,1% O2 часто определяются как легкой гипоксии, гипоксии и гипоксия, соответственно22. Концентрация соли является еще один параметр, который требует оптимизации, особенно поскольку оно играет решающую роль для ионных взаимодействий в ИЦП23. Ядерные экстрактов были использованы в этом исследовании с ядерных белков, обычно извлекается с помощью буфера, содержащие высокие концентрации соли. Таким образом ядерная экстракты возможно придется обессоленной до co иммунопреципитация экспериментов. Здесь мы обессоленной ядерной экстрактов с помощью диализа буфер, содержащий 100 мм KCl и смешанные dialyzed экстрактов с IP буфер, содержащий 180 мм NaCl пропорционально для достижения окончательного концентрации соли почти 150 мм, который похож на физиологических внутриклеточные ИЦП условий. Конечная концентрация соли может быть изменен в зависимости от свойства ИЦП интерес. В этом протоколе GAPDH был использован как элемент загрузки для клеточных экстрактов и цитоплазматических фракции. Мы не наблюдали значительное гипоксия индуцированной регулирования влияет на выражение GAPDH в HEK293A клетках. Однако GAPDH ранее показало быть upregulated гипоксии в определенные типы клеток24. Имея это в виду, может потребоваться использовать альтернативную загрузку элементов управления при необходимости25. Отдельно мы наблюдали значительный уровень фонового сигнала, вытекающих из бисера или антитела, которые используются в текущем протоколе. Для уменьшения фона, можно продлить Стиральная шаги (10-15 мин) или выполнять более чем 3 стирок (5 – 10 раз). Кроме того ионной силы буфера мытья можно также увеличить путем титрования концентрации соли от 150 до 500 мм во время мойки. Лизатов может также быть предварительно одобрены инкубации с бисером протеина A/G sepharose за 1 час при температуре 4 ° C с вращением.

Этот протокол ограничивается ядерным экстрактов и как таковые не могут быть пригодны для изучения ИЦП в течение других сотовых отсеков как митохондрии и эндоплазматического ретикулума. Подобно другим протоколам обычных co иммунопреципитация, этот метод не может использоваться для изучения ИЦП в режиме реального времени или определить если ИЦП являются прямым или косвенным.

В целом мы предоставляем модифицированных co иммунопреципитация протокол для идентификации Роман физиологически соответствующих HIF-1 взаимодействуя белками. Этот протокол также подходит для изучения взаимодействия между факторами транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях. Хотя этот протокол разработан специально для co иммунопреципитация экспериментов в условиях гипоксии, часть описанных протокола для клетки normoxia управления может также использоваться для изучения ядерной ИЦП в normoxia условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим доцент Sin Tiong Онг за использование рабочей станции гипоксии. Эта работа была поддержана следующее: Сингапур министерства образования, МО 1T1-02/04 и MOE2015-T2-2-087 (чтобы ю.а.), ли Конг Чиан школа медицины, Наньянг технологический университет начальный Грант M4230003 (P.O.B.), Шведский исследовательский совет, Фонд семьи Эрлинг Перссон, Фонд Ново Нордиск, Stichting аф Йокников фонд, Шведской ассоциацией диабета, страховая компания скандия, Диабет исследований и оздоровительный фонд, Фонд причала фон Канцов, Программа стратегических исследований в диабета на Каролинского института, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage и Фонд Рауля Валленберга Алиса и кнут.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4  1st BASE 1415
Protein A/G Sepharose beads Abcam ab193262
Natural Mouse IgG protein Abcam ab198772
EDTA Bio-Rad 1610729
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
Nitrocellulose Membrane    Bio-Rad 1620112
Blotting-Grade Blocker Bio-Rad 1706404 Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS) Bio-Rad 1706435
10% Tween 20 Bio-Rad 1610781
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732
10x Tris/Glycine Buffer  Bio-Rad 1610771
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling 7076
SignalFire ECL Reagent Cell Signaling 6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Corning 21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Merck Millipore 52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody  Novus Biologicals NB100-124  Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha Antibody Novus Biologicals NB100-479 Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 Antibody Novus Biologicals NBP1-46218 Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein Kit Qiagen 37582 Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH Antibody Santa Cruz sc-47724 Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%) Sigma G5516
Potassium chloride Sigma P9541
RIPA buffer Sigma R0278
Sodium Chloride (NaCl) Sigma 71376
NP-40 Sigma 127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) Thermo Fisher Scientific 11995065
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific R0861
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270106
HEK293A cell line Thermo Fisher Scientific R70507
Methanol  Thermo Fisher Scientific 67-56-1
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets  Thermo Fisher Scientific 88660
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
QSP gel loading tip  Thermo Fisher Scientific QSP#010-R204-Q-PK 1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm Bio-Rad 1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561083
ChemiDoc XRS+ System Bio-Rad 1708265
I-Glove BioSpherix I-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader  BioTek BTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological Pipets Corning 4487
Costar 10mL Stripette Serological Pipets Corning 4488
Costar 25mL Stripette Serological Pipets Corning 4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes Corning 352095
Small Cell Scraper Corning 3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit  Gilson F167370 P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes Greiner Bio-One  616201
PIPETBOY acu 2 Pipettor INTEGRA Biosciences 155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets Justrite Manufacturing Co. 896000
Vortex mixer Labnet S0200
CO2 incubator NuAire NU-5820
Orbital shakers Stuart SSL1
Tube rotator SB3 Stuart SB3
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002470
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher Scientific 150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Thermo Fisher Scientific 69580 10K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices Thermo Fisher Scientific 69588
LSE Digital Dry Bath Heaters Thermo Fisher Scientific 1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 13-261-308
Software
Image Lab Software Bio-Rad 1709691

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

Tags

Биология выпуск 138 молекулярной биологии co иммунопреципитация белок белковых взаимодействий (ИЦП) гипоксии гипоксия индуцибельной факторов (HIFs) эндогенных белки ядерной экстракты
Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, X., Ho, C. Q. W., Zheng, X.,… More

Zheng, X., Ho, C. Q. W., Zheng, X., Lee, K. L., Gradin, K., Pereira, T. S., Berggren, P. O., Ali, Y. Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57836, doi:10.3791/57836 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter