Summary
ここで低酸素の条件の下で内因性の核蛋白質間蛋白質蛋白質の相互作用を研究する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。このメソッドは、転写因子と低酸素で転写共役因子との相互作用のデモンストレーションに適しています。
Abstract
低酸素レベル (低酸素) は、さまざまな低酸素誘導因子 1 (HIF 1) マスターの調整装置として複雑な適応応答をトリガーします。HIF 1 ヘテロ二量体酸素によって調節される α サブユニット (HIF-1 α) から成り、血管新生を含む多様なプロセスに関与する遺伝子を調節する β サブユニット (HIF 1 β) として知られている芳香族炭化水素受容体核移行因子 (ARNT) されて、赤芽球および解糖系。HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路を理解する鍵です。HIF-1 α の安定性の規則、ほか低酸素症はまた HIF-1 α ARNT など多くの転写因子の核内移行をトリガーします。特に、このようなタンパク質-タンパク質相互作用 (Ppi) を研究するために使用する現在の方法のほとんどは、タンパク質レベルは人為的に蛋白過剰発現を増加させるシステムに基づいています。多くの蛋白の過剰発現は、時空の成果物から生じる非生理的結果に します。ここで変更された co-免疫沈降を記述プロトコルの内因性の核蛋白質を使用して低酸素血症の治療の後、HIF-1 α と ARNT の相互作用を表示する概念の証拠として。このプロトコルでは低酸素細胞が低酸素の条件の下で収穫された、ダルベッコの (DPBS) Phosphate-Buffered 生理食塩水洗浄バッファーも感受タンパク質分解やタンパク質複合体を軽減するために使用する前にあらかじめ釣合い再酸素化中に解離します。さらに、核の一部分を集中、内因性の核蛋白質の安定化と蛋白過剰発現時にしばしば見られる誤った結果を避けるために抽出した後。このプロトコルは、転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子と内因性とネイティブ相互作用を実証する使用できます。
Introduction
低酸素は、細胞や体の組織に十分な酸素が供給されてときに発生します。幹細胞の分化、炎症やがん1,2など様々 な生理学的および病理学的プロセスの重要な役割を果たします。低酸素症誘引可能な要因 (HIFs) は、酸素によって調節される α サブユニットと恒常発現 β サブユニットとして知られている ARNT3から成るヘテロとして機能します。HIF α サブユニット (HIF-1 α、HIF 2α、HIF 3 α) と 3 つの HIF β サブユニット (ARNT/HIF-1 β、ARNT2、ARNT3) の 3 つのアイソ フォームは、日付に確認されています。HIF 2α、HIF 3 α、ARNT2 および ARNT3 はより表現パターン4を制限されているに対し、HIF-1 α と ARNT は表現普遍的。HIF 1 タンパク質複合体は、低酸素応答のキーのレギュレータです。低酸素の条件の下で HIF-1 α 化が安定、核に移行し、ARNT5とされています。その後、この複合体は低酸素応答要素 (HREs) として知られている特定のヌクレオチドに結合し、血管新生、赤血球、解糖系の6を含む多様なプロセスに関与する標的遺伝子の発現を調節します。この「標準」の応答に加えて低酸素シグナル伝達経路も知られているクロストークにシグナル伝達経路のノッチと核因子 κ B (NF-κ B) など複数の細胞応答と7,8,9。
小説 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路の理解にとって重要です。ARNT は、酸素濃度に鈍感と恒常発現と対照をなして HIF-1 α タンパク質レベルは細胞の酸素濃度によって堅く調整されます。常 (21% 酸素)、HIF-1 α タンパク質は急速に劣化した10,11。常に HIF-1 α の短い半減期は、HIF 1 α 相互作用するタンパク質の同定のためだけでなく、細胞抽出液からの蛋白質を検出するための特定の技術的な課題を提示します。さらに、HIF 1 複合体のそれらを含むいくつかの転写因子は、低酸素条件12,13,14下核に若し。PPI の研究のための現在の方法のほとんどは、非生理的な発現タンパク質を使用して実行されます。このような蛋白の過剰発現は、リソースの過負荷、化学量論的不均衡、無差別相互作用および経路変調15,16を含む複数のメカニズムを通して異なる携帯電話の不具合が発生する報告されています。PPI の研究面で蛋白過剰発現は偽肯定的、またはも偽陰性、タンパク質の特性と発現タンパク質の機能によって結果につながることができます。したがって、PPI の研究の現在の方法は、低酸素条件下での生理関連 PPIs を明らかにするために変更する必要。我々 は以前、HIF 1 と Ets ファミリー転写因子Hes1プロモーターの低酸素17レスポンスに貢献する低酸素の P19 細胞における GA 結合タンパク質 (GABP) との間の相互作用を実証しました。ここでは、低酸素条件下で内因性の核蛋白質間 PPIs を勉強する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。HIF-1 α と ARNT の相互作用は、コンセプトの証明として表示されます。このプロトコルは転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子間の相互作用を示す適して、HIF 1 相互作用するタンパク質の同定に限定されません。
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Protocol
人間の萌芽期の腎臓 293A を使用して、このプロトコル セクション (HEK293A) セル s ナンヤン工科大学、シンガポールの人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1 HEK293A 細胞における低酸素誘導
- 4 つの 10 cm 皿とダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM、4.5 G/L グルコース) 2 mM L-グルタミン, 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した 10 mL の皿あたり 10 の6 HEK293A 電池 × 3-5 種子準備ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L、100 U/mL ペニシリン、100 mg/mL のストレプトマイシン。37 ° C、5% CO2インキュベーターで培養します。
注: セル播種実施されなければならない生物学的安全キャビネット (BSC)。BSC に配置されるすべての材料の表面は、70% エタノールで拭いてください。 - 播種後 24 h セルが 80-90% の confluency に達したときはインキュベーターにグローブ ボックス内低酸素 subchamber に 2 つの料理を入れて (材料の表を参照) 1% O2と 5% CO2 37 ° C で他の 2 つの常 (21 %o で料理してください2、37 ° C で 5% CO2 ) 4 h 平地と低酸素細胞の 1 つのセットを使用して西部のしみによる低酸素血症の治療を評価し、co 免疫沈降実験のための細胞の他のセットを利用します。
注: 酸素レベルを設定することができます 0-5 細胞の種類に応じて変えることができます % と低酸素血症の治療の期間と目的を研究します。
2. 全細胞と核の抽出
注: このプロトコルで使用されるバッファーについては表 1を参照してください。
-
常細胞を収穫します。
- 吸引により文化メディアを取り出し、10 ml の DPBS (PH 7.0-7.2) セルを洗浄 10 mL のピペットを使用しています。
注: は、ピペットで細胞膜には触れないでください。洗濯中にセルの損失を避けるために細胞培養プレートの壁を DPBS のピペット優しく。 - 5 mL のピペット プレートに冷たい DPBS 細胞スクレーパーで氷冷 PBS でプレートの表面から細胞をこすり。
- 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送して氷の上。
- 吸引により文化メディアを取り出し、10 ml の DPBS (PH 7.0-7.2) セルを洗浄 10 mL のピペットを使用しています。
-
低酸素の条件の下で培養した細胞を収穫します。
- 事前事前に 24 h (1% O2と 37 ° C で 5% CO2 ) 低酸素血症 subchamber の DPBS でいっぱい発見100 mL 実験ガラス試薬ボトルを置くことによって感受 DPBS を平衡します。
- 扱われる低酸素細胞を収穫する前に約 1 時間は、1% O2と 5% CO2に平衡しているグローブ ボックスの処理室に氷が入っているアイス ボックスを配置します。転送処理室に低酸素 subchamber から事前平衡低酸素 DPBS の入ったボトルと氷の上に置きます。
- 低酸素症の処置に続く 4 h は 1% O2と 5% CO2にあらかじめ釣合いされている処理室に低酸素 subchamber からセルを転送します。
- 吸引により文化メディアを取り出し、10 mL で冷たい事前平衡低酸素 DPBS のピペット 10 mL で一度リンスの細胞。
- 5 mL 5 mL の冷たい事前釣合い DPBS ピペットし、細胞スクレーパーで削ってセルを追加します。
- 細胞培養プレートを傾けるし、10 mL のピペットを使用して剥離細胞を収集します。DPBS に細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送して氷の上。
- 1 %o2 と 5% CO2にあらかじめ平衡的なされている、グローブ ボックスの処理やバッファー部屋間のドアを開きます。バッファー室処理室から扱われる低酸素細胞を含有した氷の 15 mL の円錐管を転送します。バッファーの部屋のドアを開き、セルをグローブ ボックスから完全に削除します。
- 4 ° C で 5 分間 1,000 × gで遠心分離によって両方の 2.1 から培養細胞と 2.2 から低酸素細胞をペレットします。
-
全細胞抽出物を準備します。
- 50 mM Trisaminomethane 塩酸塩 (トリス-HCl) pH 8.0、150 mM 塩化ナトリウム (NaCl) 1 %tergitol 型 NP 40 (NP-40)、0.5% デオキシ コール酸ナトリウムを含む冷たいラジオ免疫検定法 (RIPA) 換散バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁しますと0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、プロテアーゼ阻害剤のカクテル × 1 と補われる (材料の表を参照) を上下に数回細胞ペレットをピペッティングによる。
- セル lysates を新しい 1.5 mL 遠心チューブに移すし、時折ボルテックスと 30 分のための氷の上を保ちます。
- 4 ° C で 10 分間 13,000 x gでセル lysates を遠心分離します。
- 1.5 mL 遠心チューブに上清の上澄み、分注 50 μ L を収集し、-80 ° C で保存
-
核抽出を用いた核エキスの準備キット (材料の表を参照してください)。
- 優しく上下に数回細胞ペレットをピペッティングで 500 μ L の換散バッファー NL プロテアーゼ抑制剤のカクテルと 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) x 1 を添加した細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液および 10 の渦に洗剤 NP の 25 μ L を追加最大速度で s。
- 10,000 x gで 4 ° C で 5 分間遠心します。
- 上澄み (細胞質抽出物)、1.5 mL 遠心チューブに上清の 50 μ L 分注を集め、-80 ° C で保存
- 500 μ L の換散バッファー 5 ボルテックスによってプロテアーゼ抑制剤のカクテルと 0.1 M DTT x 1 を添加した NL で細胞核を含むペレットを再懸濁します最大速度で s。
- 4 ° C で 5 分間、10,000 × gで遠心分離し、核ペレットを保存します。
- 50 μ L を上下に数回ペレットをピペッティングによるプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 を添加した抽出バッファー NX1 の内核のペレットを再懸濁します。
- 氷の上の 30 分、10 のボルテックス インキュベート s 最大速度で 5 分ごと。
- 4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心分離
-
核抽出液の塩分を除きます。
- ステップ 2.5.9 転送から単位あたり 100 μ L の最大音量とミニ透析機器に上澄みを収集します。
- ミニ透析機器をキャップし、浮揚装置に配置します。
- 中古冷蔵透析バッファー (20 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、20% のグリセロール、100 mM 塩化カリウム (KCl)、0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.2 mM 特異フッ化物 (PMSF) と 0.5 mM DTT) の 500 mL を含むビーカーに浮き具を入れてください。穏やかな攪拌しながら 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
注意: PMSF は危険です。皮膚または吸入との直接接触を避けます。 - ミニ透析機器の隅からサンプルを収集し、新しい 1.5 mL 遠心チューブに移します。
- 1.5 mL 遠心チューブにそれぞれの上清の 25 μ L 分注 4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心し、-80 ° C で保存
3. 蛋白質の表現および HIF-1 α の細胞内局在性の検出による低酸素症治療の評価
- セル全体またはビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キットの製造元の手順18によるとマイクロ プレート アッセイを用いた核/細胞質抽出物のタンパク質濃度を決定します。
- 5 %2-メルカプトエタノールを含む 1 x Laemmli サンプル バッファー内セル lysates を希釈し、95 ° C、5 分で沸騰します。
注意: それは火傷を引き起こす可能性がありますので、暖房のブロックの表面に触れないでください。 -
ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によってタンパク質を分離します。
- SDS-PAGE プレキャスト勾配ゲル (4-20%) の各ウェルに 3 μ L の分子量マーカーと共にタンパク質 (25 μ g) の同量を読み込みます。
- 2.5 mM トリス、グリシン 19.2 mM、0.01% SDS 200 V で 30 分間 PH8.3 を格納するバッファーのゲルを実行します。
-
ニトロセルロース膜にゲルからタンパク質を転送します。
- カセットの陰極側膜・陽極側にゲルを転送サンドイッチ (ろ紙ゲル膜フィルター ペーパー) を組み立てます。
- 2.5 mM trisaminomethane (Tris)、19.2 mM グリシンおよび 20% のメタノールを含む転送バッファーと転送満タンにカセットを配置します。
注意: メタノールは可燃性および可燃性液体収納キャビネット内に格納する必要があります。 - 低温室内で 100 V で 1 時間のための転送を実行します。
- 10 mL 50 mM Tris Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl、シェーカーに室温で 1 時間 0.1 Tween 20 と 5% 無脂肪牛乳を含むバッファーの妨害でしみをブロックします。
- 4 ° C で一晩同じブロック バッファーにアンチ HIF-1 α 抗体 (1/500 希釈) しみを孵化させなさい
- 洗うたびに 50 ml の TBS t. 5 分間 3 回しみ
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) としみを孵化させなさい-部屋の温度で 1 時間 10 mL TBS T 含む 5% 脱脂乾燥したミルクの共役二次抗体 (1/1,000 希釈)。
- 洗うたびに 50 ml の TBS t. 5 分間 3 回しみ
- ミックス 500 μ L 各 1.5 mL 遠心管と渦を簡単に強化された chemilumescent (ECL) 試薬 A と B の。
- しみに ECL 基板を適用し、室温で 1 分間インキュベートします。
-
電荷結合素子 (CCD) カメラを用いたイメージング システムを用いた化学発光信号をキャプチャします。
- ティッシュ ペーパーで膜の端に触れることによって余分な ECL 基板をドレインし、シート プロテクターで膜を配置します。
- カメラを用いたイメージング システム、CCD のサンプル トレイに膜を配置します。
- 画像処理ソフトを起動 (材料の表を参照)、次の設定を使用して画像をキャプチャ: → 新しいプロトコル → 1 チャンネル → プロトコルの設定 → ゲル画像をファイル (アプリケーション: 化学;イメージング エリア: バイオ ・ ラッドの準備ができてゲル。露出: イメージング ソフトウェアは自動的に強烈なバンドの露出時間最適化) → 実行プロトコル
注: 露光時間は、最適な画像を達成するために手動で設定できます。
4. 免疫沈降、免疫沈降されたタンパク質の検出
- 1.5 mL 遠心チューブにバッファーが TBS の 500 μ L に蛋白質 A/G セファローズ 4 b ビーズの 50 μ L を洗って、4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレット
- 上澄みを廃棄し、TBS バッファーの 100 μ L のビードを再停止しなさい。
- マウス モノクローナル抗 ARNT 抗体 (1.4 mg/mL) のマウス免疫グロブリン G (IgG) (1.4 mg/mL) 500 μ L TBS バッファーで 0.7 mg マウス IgG を再構成することによって作製した 2 μ L を追加します。
- チューブ回転でビーズを含む 1.5 mL 遠心管を置き、冷蔵室で 10 回転で 2 時間インキュベートします。
注: チューブを優しく処理、管の下部にビーズを含む懸濁液を保ちます。 - 4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレットし、培養上清を捨てます。
- 50 mM トリス-HCl (pH 7.4) 180 mM の NaCl、20% グリセロール、0.2% NP 40 と 1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテルで構成される IP バッファーのステップ 2.6.5 で 800 μ L で得られた核蛋白ライセートの 200 μ g を希釈します。4 ° C で一晩 4.5 の手順で得られた抗体結合ビーズ ライセート インキュベートします。
- 4 ° C で 2 分間 3,000 × gで遠心分離によってビーズをペレット、培養上清を破棄および 1 mL にビードを 3 回洗浄しなさい 0.2% を含む冷たい TBS NP 40。
- 95 ° C、5 分で 50 μ L 塩化物イオン サンプル バッファーのビードを沸騰させます。
- 4 ° C で 5 分間 10,000 x gでビーズを遠心、上清を収集し、ビーズを破棄します。
注: 上清は 4 ° C の短期的または-20 ° C で長期的に保存できます。 - 手順 3.3 以降で前述したように西部のしみによって沈澱タンパク質複合体から HIF-1 α の存在を検出します。
注: プロテインの定量はこのステップの必要はありません。各サンプルの上澄みの SDS-PAGE プレキャスト勾配ゲル (4-20%) の各ウェルにフル ・ ボリューム (50 μ L) を読み込む
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Representative Results
式低酸素細胞の応答を評価するためにレベルと HIF 1 複雑な次低酸素治療のコンポーネントの内局在を検討しました。4 h の低酸素の条件の下で培養の HEK293A セルまたはコントロールとして常に続けた。全細胞 HIF-1 α と ARNT のタンパク質レベルを調べたまたは西部のしみによって核/細胞質を抽出します。予想される、合計 HIF-1 α のレベル合計のセル lysates の ARNT レベルが大幅に対し、低酸素状態で誘導されるとして変更 (図 1 a)。さらに、低酸素状態における核蓄積は HIF-1 α と HEK293A 細胞 (図 1 b)、ARNT ARNT の細胞質発現テスト セル行19のいくつかの検出されなかったが過去の報告と一致しているのです。
次に、HIF-1 α と低酸素症の処置に続く ARNT の相互作用を示しました。核抽出液の調製培養 HEK293A 細胞または 4 h Co 免疫沈降実験のための低酸素の条件は HEK293A 細胞から核抽出液を使用して行われました。図 2に示すように、HIF-1 α は低酸素の HEK293A 細胞核の抽出液から ARNT と一緒に co 沈澱だった
一緒に取られて、説明されたプロトコルが正しく使用できる細胞の低酸素応答を誘導してさらに内生の生理的蛋白結合を決定する核内 HIF 1 α/ARNT 錯体を表明しました。
図 1:タンパク質発現と低酸素による HIF 1 成分の細胞内局在性の規則。(A) HEK293A 細胞における HIF-1 α または ARNT の合計式のイムノブロット解析。セルされたか常 (N) で 4 時間 (H) 低酸素にさらされています。全細胞抽出物からタンパク質は SDS-PAGE によって分離され、反 HIF-1 α、アンチ ARNT 反グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) 抗体とイムノブロット分析します。GAPDH はローディング コントロールとして使用されました。(B) 細胞 HEK293A 細胞画分における HIF-1 α と ARNT 発現のイムノブロット解析。HEK293A セルは 4 h (H) の低酸素の条件の下で培養または常 (N) で保管します。核や細胞質の抽出物からの蛋白質の 25 μ g を反 HIF-1 α、アンチ ARNT、反 yin およびヤン 1 (YY1) を用いたイムノブロット分析したと反 GAPDH 抗体。YY1 と GAPDH は核と細胞質画分のコントロールをそれぞれロードとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:低酸素の条件の下で ARNT やり取り HIF-1 α 。4 h の低酸素にさらされている HEK293A セルまたはコントロールとして常に保持されました。HEK293A 細胞から核抽出液を調製し、反 ARNT 抗体を用いた immunoprecipitations を行った。核抽出 (入力) し、免疫沈降されたタンパク質はアンチ YY1、アンチ ARNT アンチ HIF-1 α 抗体を用いたイムノブロット分析しました。YY1 は、IgG は co 免疫沈降実験のネガティブ コントロールとして使用されていた入力の読み込み制御として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ソリューション | コンポーネント | コメント |
| 透析バッファー | 20 mM トリス-HCl (pH 7.4) 20% グリセロール、100 mM KCl、0.2 ミリメートルの EDTA、0.2 mM PMSF と 0.5 mM DTT | 使用直前に PMSF と DTT を追加します。 |
| 連続したバッファー | 2.5 mM トリス-HCl (PH 8.3) 19.2 mM グリシンと 0.01% SDS | 100 mL 10 x トリス/グリシン/SDS バッファーを混ぜて 900 mL ddH2o. |
| 転送バッファー | 2.5 mM トリス-HCl (PH 8.3) 19.2 mM グリシンと 20% メタノール | 100 mL 10 x Tris またはグリシン バッファー ミックス 200 mL メタノールと 700 mL ddH2o. |
| TBS バッファー | トリス-(pH 7.6) の Cl 50 mM と 150 mM の NaCl | 100 mL 10 x TBS バッファーを混ぜて 900 mL ddH2o. |
| TBS T バッファー | 50 mM Tris Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl と 0.1% Tween 20 | ミックス 100 mL 10 x TBS バッファーを 900 mL ddH2O、Tween 20 1 mL。 |
| バッファーをブロック | 50 mM Tris Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl、0.1% Tween 20 と 5% 無脂肪牛乳 | 100 mL TBS T バッファーであぶらとり学年ブロックの 5 g を溶かします。 |
| IP バッファー | 50 mM トリス塩酸 (pH 7.4) 180 mM NaCl、20% グリセロール、0.2% NP 40 と 1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル | 使用直前にプロテアーゼ阻害剤のカクテルを追加します。 |
表 1: ソリューションの準備。
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Discussion
HIF 1 複合体細胞酸素恒常性のマスター調節因子は、低酸素に異なる細胞適応応答に関与する遺伝子の茄多を調節する.新規 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達機構を理解するために重要です。一般的に Co 免疫沈降実験 PPIs 研究細胞シグナル伝達経路の線引きされます。しかし、蛋白過剰発現はまだ広く使用されて、これは実験の成果物につながる可能性があります。さらに、HIF-1 α は非常に不安定な蛋白質および再酸素化の11の間に急速に劣化になります。さらに、低酸素血症は、HIF 1 コンポーネントほとんどの哺乳類細胞での核内移行をトリガーします。したがって、従来の co を免疫沈降プロトコルは低酸素症の処置に続く生理関連の HIF 1 相互作用の蛋白質を識別するため最適化しなければなりません。ここでは、低酸素症で HIF-1 α と ARNT の間の対話を示すために使用される変更された co を免疫沈降プロトコルについて述べる。
再酸素化に HIF-1 α の劣化を避けるためには、低酸素細胞は低酸素環境に平衡は事前をインキュベーターのグローブ ボックスの処理チャンバ内収穫されました。DPBS 洗浄バッファーは、使用前に低酸素の環境にも平衡だった。処理のため低酸素ワークステーションがない場合、低酸素細胞ことができる事前平衡低酸素 DPBS で洗浄し、その後すぐに氷の収穫します。低酸素症は HIF 1 成分の核内移行を引き起こすことができます、その蛋白の過剰発現は artefactual 結果を引き起こす可能性がありますを考えると、内因性の核蛋白質はこのプロトコルで使用されました。Co 免疫沈降プロトコルの核抽出液の使用もされて他20の報告します。全細胞タンパク質によって希釈されるから核蛋白質のチャンスを最小にできるので、それは核タンパク質間相互作用の研究のための技術的な利点を表します。さらに、核抽出液の使用役に立つかもしれません非常に豊富な無関係な細胞質蛋白質、特にからの非特定の相互作用の低減のため、核タンパク質の安定性の改善のためへの露出を最小限に抑える細胞質に存在するプロテアーゼ。HIF-1 α と内因性の核抽出液を使用してが、全体を使用していない GABPα の相互作用を検出できるだけ co 免疫沈降のため全細胞抽出物ではなく内因性の核抽出液の使用は重要な技術的な改善を示していますセルは、17を抽出します。
説明したプロトコルでは、結果を改善するためにいくつかの条件をさらに最適化できます。4 時間 1% 酸素とそれらを扱うことによって HEK293A 細胞における低酸素血症を誘発しました。しかし酸素レベルと低酸素血症の治療期間の異なる種類の細胞の変化、研究の目的に合わせて調整。例えば、HIF-1 α と HIF 2α 特異的調節できます低酸素によって細胞型固有の方法で異なった生物学的文脈で明確な役割を示します。神経芽細胞腫細胞における HIF-1 α が最もアクティブである強烈な低酸素症 (1% O2) の短い期間中に HIF 2α (5% O2) 軽度低酸素下で能動態はまたなりよりアクティブな次慢性的な低酸素症治療 (48-72 時間の一方が示されています。低酸素暴露)21。0-5% O2レベルは 1-5% 低酸素症治療体外で用い O20.1-1% O2と 0-0.1% O2はしばしば軽度として定義低酸素症、低酸素、無酸素、それぞれ22。塩分濃度は、Ppi23イオン間相互作用の重要な役割を果たしている、特に以来、最適化が必要です別のパラメーターです。核抽出液は、通常塩の高濃度を含むバッファーを使用して抽出した核蛋白質と本研究で使用されました。したがって、核抽出液が co 免疫沈降実験前に脱塩にあります。ここでは、我々 は核抽出液 100 mM、KCl を含む透析バッファーを使用して、透析のエキスを混ぜて 180 mM 比例して生理学的に類似している 150 ミリメートルに近い最終的な塩分濃度を達成するために、NaCl を含む IP バッファー脱塩細胞内の PPIs の条件。最後の塩濃度は、関心の PPIs のプロパティによって変更できます。このプロトコルの GAPDH は全細胞抽出物と細胞質画分のローディング コントロールとして使用されました。HEK293A 細胞における GAPDH の発現に有意な低酸素状態における規制影響は観測されなかった。ただし、GAPDH 以前示されている誘導をする特定の細胞型24低酸素によって。これを念頭に、必要に応じて代替適切な荷重コントロールを使用する必要があります 1 つ25。別に、ビーズまたは抗体の現在のプロトコルを発する信号の背景の重要なレベルを見ました。背景を減らすためには、1 つは、洗浄のステップ (10-15 分) を延長または、(5-10 回) 以上 3 洗浄を行います。また、洗浄バッファーのイオン強度を洗浄中に 500 mM まで 150 から塩分濃度を滴定によっても大きくできます。蛋白質 A/G セファローズ ビーズ回転 4 ° C で 1 時間インキュベートし lysates の事前削除もできます。
このプロトコルは核抽出液に限られなどがミトコンドリアや小胞体など他の細胞コンパートメント内にある Ppi の勉強に向いているかもしれません。従来の co を免疫沈降の他のプロトコルと同様に、このメソッドは使用できませんまたは PPIs が直接的または間接的なかどうかを判断するリアルタイムで Ppi を勉強します。
要約すると、新規の生理関連 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定のため変更された co を免疫沈降プロトコルを提供します。このプロトコルは、転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子との相互作用の研究にも適していますこのプロトコルは、低酸素条件下で co 免疫沈降実験のために特別設計されていますが、常対照細胞の説明のプロトコルの一部は常の条件下で核の Ppi を勉強するも使用できます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
我々 は低酸素ワークステーション用准教授罪ティオン ・ オングを感謝します。この作品は、次によって支えられた: シンガポールの教育省、南洋工科大学創業助成金 M4230003 (P.O.B.) に内科のビジネススクール、MOE2015-T2-2-087 (ワイ ・ エイ) に萌え 1T1-02/04 スウェーデン研究評議会、家族 - スウェーデンペーションアー財団、ノボ ノルディスク財団、スティヒティング af Jochnick 財団、スウェーデン糖尿病協会、スカンジア保険会社、糖尿病の研究、健康財団、バース ・ フォン ・ Kantzow、カロリンスカ研究所、アリス バレンベリー財団し ERC ERC 2013 AdG 338936-Betalmage、クヌートの糖尿病戦略研究プログラムです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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