Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Full lengde personlige proviral sekvenser (vende) gir en effektiv og høy gjennomstrømming metode for forsterkning og sekvensering av enkeltrom, nær full lengde (intakt og defekt) HIV-1 proviruses og gir mulighet for fastsettelse av sitt potensial replikering-kompetanse. KNIPSER overvinner begrensninger av tidligere analyser for sekvens latente HIV-1 reservoaret.

Abstract

Full-Length personlige Proviral sekvensering (vende) analysen er en effektiv og høy gjennomstrømming metode utviklet for å forsterke og sekvens singel, nær full lengde (intakt og defekt), HIV-1 proviruses. VENDER tillater fastsetting av genetiske sammensetningen av integrert HIV-1 i cellen innbyggere. Gjennom identifiserer mangler innen HIV-1 proviral sekvenser som oppstår under omvendt transkripsjon, for eksempel store interne sletting, skadelige stopp kodon/hypermutation, frameshift mutasjoner og mutasjoner/slettinger i cis opptrer elementer nødvendig for virion modning, kan KNIPSER identifisere integrert proviruses stand til replikering. FLIPS analysen kan brukes til å identifisere HIV-1 proviruses som mangler disse feilene og er derfor potensielt replikering kompetente. FLIPS protokollen innebærer: lysis av HIV-1-infiserte celler, nestede PCR av nær full lengde HIV-1 proviruses (bruker primere rettet mot HIV-1-5' og 3' LTR), DNA rensing og kvantifisering, bibliotek forberedelser for neste generasjons sekvensering (NGS), NGS, de novo montering av proviral contigs, og en enkel prosess med eliminasjon identifisere replikering kompetente proviruses. KNIPSER gir fordeler fremfor tradisjonelle metoder for sekvensen integrert HIV-1 proviruses, som enkelt-proviral sekvenser. KNIPSER forsterker og sekvenser i nærheten fulle proviruses slik at replikering kompetanse være bestemt, og bruker også færre forsterkning primere, forebygge konsekvensene av primer uoverensstemmelser. VENDE er et nyttig verktøy for å forstå genetisk landskapet av integrert HIV-1 proviruses, spesielt i latente reservoaret, men dens utnyttelse kan utvide til programmer som genetiske sammensetningen av integrert HIV-1 er nødvendig.

Introduction

Genetisk karakteristikk av det latente HIV-1-reservoaret, som vedvarer i individer på langsiktige antiretroviral terapi (ART), er viktig å forstå at fleste integrert proviruses er defekt og replikering-inkompetente1 , 2. under prosessen med omvendt transkripsjon, feil er innført i integrert proviral sekvensen. Noen mekanismer som genererer defekt proviral sekvenser inkluderer den feilutsatte HIV-1 revers transkriptase enzym3, mal bytte4og/eller APOBEC-indusert hypermutation5,6. To nyere studier har funnet at ca 5% av HIV-1 proviruses isolert fra individer på langsiktige ART genetisk intakt, og potensielt replikering kompetente, og kan bidra til rask oppsving i HIV-1 Plasmanivåer ved opphør av kunst 1 , 2 , 7. forrige studier har identifisert at replikering kompetente HIV-1 proviruses vedvarer i naiv og hvile minne CD4+ T celle delsett (inkludert central, overgang og effektor minne T celler), som indikerer viktigheten av målretting disse cellene i fremtiden utrydding strategier2,8,9.

Tidlig innsikt i distribusjon, dynamikk og vedlikehold av latent HIV-1 reservoaret ble oppnådd gjennom utnyttelse av enkelt-proviral sekvenser (SPS) metoder som karakteriserer genetisk sub-genomisk regioner av HIV-1 genomet10 ,11,12,13. SPS er et allsidig verktøy, kunne sekvens en enkelt HIV-1 provirus fra i én infisert celle. SPS er imidlertid ikke fastslå replikering-kompetansen til proviruses, siden det bare sekvenser sub-genomisk regioner og savner proviruses som inneholder store slettinger i primer bindende områder. En tidligere studie har vist at SPS overvurderer størrelsen på Replikasjons-kompetent reservoaret av 13 - til 17 ganger gjennom selektivt sekvensering intakt sub-genomisk regioner2.

Å løse begrensningene for SPS, Ho et al. 4 og Bruner et al. 1 utviklet analyser sekvensen i full lengde HIV-1 proviruses. Dette tillot frekvensen av genetisk intakt, og potensielt replikering-kompetent, HIV-1 proviruses i individer på langsiktige kunst bestemmes. Disse analyser forsterket og sekvensert (via Sanger sekvensering) sub-genomisk områder som da var forsamlet for å få en sekvens (intakt eller defekt) HIV-1 provirus. Tre begrensninger av denne tilnærmingen er: 1) bruk av flere sekvensering primere øker risikoen for utilsiktet innføre defekter i proviral sekvensen, 2) primer uoverensstemmelser kan hindre forsterkning av bestemt proviruses, og 3) ofte den hele proviral sekvensen kan ikke løses på grunn av teknisk på disse metodene.

For å overvinne begrensninger av eksisterende full lengde HIV-1 proviral sekvensering analyser, utviklet vi Full -Llange jegndividual Proviral Sequencing (vende) analysen. VENDE er en neste generasjons sekvensering (NGS)-basert analysen som forsterker og sekvenser i nærheten full lengde (intakt eller defekt) HIV-1 proviruses i en høy gjennomstrømming og effektiv måte. KNIPSER gir fordeler over tidligere analyser, som begrenser antall primere brukt; Derfor reduserer det sjansen for primer konflikter, noe som kan begrense befolkningen i proviruses fanget eller utilsiktet innføre defekter i en viral sekvens. VENDE er også mindre teknisk utfordrende enn tidligere analyser og innebærer 6 hovedtrinn: 1) lysis av HIV-1-infiserte celler, 2) forsterkning av enkelt HIV-1 proviruses via nestede PCR på begrense fortynning bruker primere bestemt av høyt konservert HIV-1 5' og 3 U5 LTR regionen (figur 1A), 3) rensing og kvantifisering av forsterket produkter, 4) bibliotek utarbeidelse av forsterket proviruses for NGS, 5) NGS, og 6) de novo montering av sekvensert proviruses å få contigs av hver Personlige provirus.

Sekvenser generert av FLIPS kan gjennomgå en strenge elimineringsprosess å identifisere dem som er genetisk intakt og potensielt replikering kompetente (figur 1 c)2. Genetisk intakt proviruses mangler alle kjente defekter som føre generasjon av en replikering-inkompetente provirus. Disse feilene inkluderer: inversjon sekvenser, store interne slettinger, hypermutation/skadelige stopp kodon, frameshifts eller mutasjoner i de 5' emballasje signal eller større skjøte donor (MSD) nettsted.

Figure 1
Figur 1: avgjørende skritt i full lengde personlige proviral sekvenser (vende) analysen. (A) HIV-1 DNA genomet med primer bindende områder i 5' og 3 U5 LTR områder brukes av FLIPS for å forsterke nær full lengde (defekt og intakt) HIV-1 proviruses via nestede PCR. (B) Layout av en 96-brønns PCR plate som inneholder 80 eksempel brønner (20 brønner for hver fortynning), 4 negativ kontroll brønner og 1 positiv kontroll godt. (C) elimineringsprosess brukes til å identifisere genetisk intakt, og potensielt replikering-kompetent, HIV-1 proviruses. Dette tallet har blitt endret fra Hiener et al. 2 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene ved University of California, San Francisco og Western Sydney lokale helse-distriktet, som inkluderer Westmead Institutt for medisinsk forskning.

1. lysis av HIV-1-infiserte celler

Merk: Celler kan være isolert fra perifert blod, leukapheresis prøver, bein margtransplantasjon biopsi eller vev biopsi. Celle populasjoner kan sorteres bruke fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS).

  1. Forberede en lyseringsbuffer inneholder 10 mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Tween-20, og 0,3 mg/mL proteinasen K. Cellen pellets, legge 100 µL av lyseringsbuffer per 1 x 106 celler. Pipetter opp og ned for å blande. Inkuber ved 55 ° C i 1 time etterfulgt av 85 ° C i 15 min til lyse cellene og slipp genomisk DNA for PCR forsterkning.
    Merk: Cellen lysis er tilstrekkelig for å oppnå genomisk DNA for forsterkning. Ingen DNA isolasjon eller rensing er nødvendig. Protokollen kan pauses på dette punktet og genomisk DNA kan lagres på 20 ° C på ubestemt tid.

2. forsterkning av enkelt HIV-1 DNA Proviruses via nestede PCR

  1. Bland reagensene i første runde PCR (PCR1) i tabell 1 (se Tabell for materiale). Legge til 38 µL av master mix 85 brønner (80 prøver, 4 negative kontroller, 1 positiv kontroll) av en 96-brønns PCR plate (Følg oppsettet i figur 1B). Angi denne platen 'PCR1'.
Reagens Siste konsentrasjon Volum for PCR1 plate (µL) Volum for PCR2 plate (µL)
Fremover Primer 1 ΜM 32,3 23.8
Omvendt Primer 1 ΜM 32,3 23.8
Buffer (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95,2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 64.6 47.6
DNA polymerase (5 U/µL) 0.025 U/ΜL 16.2 11.9
Ultrapure H2O 2632.5 1939.7

Tabell 1: Reagenser og volumer for PCR master mikser.

Merk: Grunning brukes for PCR1 er:
BLOuterF: 5-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3 "(HXB2 plasser 623-649)
BLOuterR: 5-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3 "(HXB2 plasserer 9662-9686)

  1. Etter å forberede master mix, flytte PCR1 plate til en ren området for tillegg av genomisk DNA.
    1. Serielt fortynne genomisk DNA fra 1:3 til 1:81 med Tris-HCl (5 mM, pH 8), forbereder 45 µL hver fortynning (nok 20 brønner for hver fortynning). Legge til 2 µL av utvannet genomisk DNA i hvert eksempel godt og 2 µL av Tris-HCl (5 mM, pH 8) å hver negativ kontroll godt (Følg oppsettet i figur 1B). Forsegle alle brønnene av PCR1 plate, unntatt positive kontrollere Vel, med en klar lim sel (se Tabell for materiale).
      Merk: De ovenfor anbefalte fortynninger tjener bare som en start guide for å bestemme end-point fortynning. Fortynninger avhengig av konsentrasjonen av integrert HIV-1 DNA i prøvene.
  2. Flytte til et utpekt for tillegg av positiv kontroll. Legg 2 µL av positiv kontroll (pNL4-3 utvannet til 105 Kopier/µL) til positiv kontrollen godt av PCR1 plate og forsegle platen. Kort spin PCR1 platen i PCR plate spinner eller sentrifuger (400 x g for 10 s ved romtemperatur) å trekke ned gjenværende innholdet fra sidene av brønnene.
  3. Kjøre PCR1 platen i en thermocycler: 94 ° C i 2 min; deretter 94 ° C for 30 s, 64 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 61 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 58 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min 21 sirkelstrukturer; deretter 68 ° C i 10 min (30 sykluser totalt). Hold på 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her og PCR1 platen holdt på 4 ° C for opp til 2 dager.
  4. Bland reagensene den andre runden av PCR (PCR2) i tabell 1. Legge til 28 µL 85 wells (80 prøver, 4 negative kontroller, 1 positiv kontroll) fra en ny 96-brønns PCR plate (Følg oppsettet i figur 1B). Angi denne platen 'PCR2'.

Merk: Grunning brukes for PCR2 er:
275F: 5-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3 "(HXB2 plasser 646-666)
280R: 5-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3 "(HXB2 plasser 9650-9676)

  1. Kort spin PCR1 platen i PCR plate spinner eller sentrifuger (400 x g for 10 s ved romtemperatur) å trekke ned gjenværende innholdet fra sidene av brønnene. Legge til 80 µL av Tris-HCl (5 mM, pH 8) i hver brønn av PCR1 plate.
    1. Overføre 2 µL av PCR1 plate til PCR2 plate med en flerkanals pipette. Sikre prøver overføres også til godt (dvs. 2 µL fra godt A1 av PCR1 plate overføres til godt A1 av PCR2 plate). Forsegle PCR2 platen med en klar lim sel (se Tabell for materiale).
    2. Kort spin PCR2 platen i PCR plate spinner eller sentrifuger (400 x g for 10 s ved romtemperatur) å trekke ned gjenværende innholdet fra sidene av brønnene. Forsegle PCR1 platen med en varme tetting film for langtidslagring på 20 ° C (se Tabell for materiale).
  2. Kjøre PCR2 platen i en thermocycler: 94 ° C i 2 min; deretter 94 ° C for 30 s, 64 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 61 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 58 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 3 sykluser; 94 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 68 ° C i 10 min for 31 sykluser; deretter 68 ° C i 10 min (40 sykluser totalt). Hold på 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her og PCR2 platen holdt på 4 ° C for opp til 2 dager.
  3. Kort spinne PCR2 platen i PCR plate spinner eller sentrifuger å trekke ned gjenværende innholdet fra sidene av brønnene. Legg til 60 µL av Tris-HCl (5 mM, pH 8) i hver brønn ved å en flerkanals pipette.
    1. Kjøre 15 µL av hver brønn på 2 x 48-vel precast 1% agarose gelé som inneholder ethidium bromide (0.1\u20120.3 µg/mL, se Tabellen for materiale). Bruke en stige med en rekkevidde opp til 10 kb (se Tabell for materiale). Visualisere for å identifisere brønnene som inneholder forsterket produktet og omtrentlig størrelsene. Lagre gel bildet.
      NOTE Sikre positiv kontrollen inneholder godt forsterket produktet. Hvis negativ kontroll brønnene inneholder forsterket produktet, vurdere forurensning og ignorere plate.
  4. Bestemme fortynning der mer enn 30% av brønnene er positivt for forsterket produktet.
    Merk: Dette er end-point fortynning som inneholder et flertall (80%) av forsterket produktet fra én enkelt mal. Dette fortynning bør være forberedt og brukes i påfølgende PCRene for å skaffe ytterligere proviral amplicons. Registrere omtrentlig størrelsen på hver forsterket produktet.

3. DNA rensing og kvantifisering

  1. Kort spinne PCR2 platen i PCR plate spinner eller sentrifuger å trekke ned gjenværende innholdet fra sidene av brønnene. Overføre 40 µL fra brønnene som inneholder forsterket produktet (på eller under end-point fortynning) til en ny 96-brønns midi-plate (med et godt volum på 0,8 mL, se Tabellen for materiale).
    Merk: Skriv ned originale og nye godt plasseringen av hver forsterket produktet i et regneark som en av hver forsterket produktet som ble sekvensert.
  2. Rense forsterket DNA produkter med en magnetisk perle basert PCR rensing kit (se tabell for materiale) fjerne primere, nukleotider, enzymer, oljer og salter. Før du starter, bringe magnetiske perler til romtemperatur og forberede frisk 80% etanol. Bruk nye pipette-spisser behov for å unngå kryss-kontaminering av DNA-prøver.
    1. Vortex magnetiske perler å sikre de er grundig resuspended. Bruker en flerkanals pipette, legge til 40 µL av perler på 40 µL av forsterket produktet i 0,8 mL 96-brønns midi plate. Pipetter forsiktig opp og ned 10 ganger å blande. Alternativt, bland løsningen forsegle platen så rister på en microplate shaker på 1800 rpm for 2 min. Incubate ved romtemperatur for 5 min.
    2. Sted plate på en magnetisk står (se Tabell for materiale) for 2 min. fjerne og slette supernatant.
    3. Vask perler ved å legge til 200 µL av 80% etanol hver brønn med platen på stativet. Inkuber ved romtemperatur for 30 s. fjerne og kast nedbryting. Gjentas én gang. Bruker en flerkanals pipette med fine tips, fjerne alle overflødig etanol etter andre vask. Med platen på stativet, tillate perler til luft tørr i 15 min.
    4. Fjerne platen fra stativet. Legge til 30 µL av elueringsbufferen (se Tabell for materiale) i hver brønn. Pipetter forsiktig opp og ned 10 ganger å blande. Alternativt, bland løsningen forsegle platen så rister på en microplate shaker på 1800 rpm for 2 min. Incubate ved romtemperatur i 2 minutter.
    5. Platen på magnetiske standpunkt for 2 min. med en flerkanals pipette, overføre 25 µL av nedbryting (renset DNA) til en ny 96-brønns PCR plate. Sikre at prøvene overføres godt-å-godt (dvs. nedbryting av godt A1 i 0,8 mL plate overføres til godt A1 av nye 96-brønns plate).
      Merk: 5 uL på eluted utvalget er igjen å sikre at ingen overføring av gjenværende rensing perler.
  3. Finne og registrere omtrentlig konsentrasjonen av hvert forsterket DNA produkt etter rensing med et spektrofotometer (absorbans ved en bølgelengde på 260 nm).
    Merk: Måle omtrentlig konsentrasjonen av hver forsterket produktet er nødvendig på dette stadiet å sikre ikke prøver går tapt under rensing trinnene og at omtrentlig konsentrasjonen er innenfor rekkevidde av standardkurve brukes i den neste scene ( 0,001-1 ng/µL DNA i 100 µL av volum). Protokollen kan pauses her og renset prøver kan lagres på 20 ° C i opptil 6 måneder.
  4. Kvantifisere konsentrasjonen av DNA av hvert renset produkt med en dsDNA kvantifisering kit (se tabell for materiale).
    Merk: Dette medfører benytter en standardkurve for å bestemme konsentrasjonen av dsDNA i et utvalg. Kit inkluderer buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), en lamda dsDNA standard og en fluorescerende farge. Holde reagenser på is. Dekk røret med fargestoff med folie å unngå eksponering for lys. Måle konsentrasjonen av hver forsterket produktet i tre eksemplarer.
    1. Fortynne buffer til 1 x i sterilt DNase gratis H2O. legge 99 µL av buffer til et passende antall tomme brønner (3 ganger antallet forsterket produkter skal måles, se tabell 2 for et eksempel oppsett) av en flat bunn vev kultur plate. Legg 100 µL bufferen 3 tomt brønner.
    2. For hver forsterket produktet skal måles, legge 1 µL av renset DNA (fra trinn 3.2.5) i tre eksemplarer til hver godt som inneholder bufferen (se tabell 2 for et oppsett for eksempel).
    3. For å forberede standarder, fortynne lamda dsDNA 10-fold fra 2 ng/µL til 0,002 ng / µL. Legg 100 µL av hver dsDNA standard 3 brønner.
      Merk: Følgende trinn 3.4.4, siste konsentrasjonen av standarder vil variere fra 1 til 0,001 ng/µL
    4. Fortynne fluorescerende farge 1:200 med buffer. Raskt legge 100 µL til hver med godt utvalg, mellomrom og standarder. Bland opp og ned med en pipette. Dekk platen med folie å unngå kontakt med lys.
    5. Lese fluorescens utslipp på en microplate leser (eksitasjon på 480 nm, utslipp på 520 nm). Posten resultater i et regneark.
    6. Bestemme konsentrasjonen av dsDNA i hvert utvalg bruker fluorescens målingene registrert. Trekk fluorescens målt i tomme brønner fra eksempelet og standarder. Bestemme den gjennomsnittlige fluorescensen for hver utvalget og standard fra triplicates. Tegne en standardkurve basert på fluorescens målinger av standarder. Bestemme konsentrasjonen av prøvene i forhold til standarden.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomme
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
B Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomme
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
C Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomme
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffer
D Eksempel 1: Eksempel 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Eksempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
E Eksempel 1: Eksempel 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Eksempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
F Eksempel 1: Eksempel 2: Eksempel 3: Eksempel 4: Eksempel 5: Eksempel 6: Eksempel 7: Eksempel 8: Eksempel 9: Eksempel 10: Eksempel 11: Eksempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer 1 mL DNA + 99 mL buffer
G
H

Tabell 2: Eksempel oppsett av 96-brønns plate for kvantifisering av dsDNA.

  1. Fortynn hver renset produkt (innhentet i trinn 3.2.5) med H2O til 0,2 ng/µL.

4. sekvensering biblioteket forberedelse

  1. Forberede forsterkes og renset proviral DNA NGS bruker en NGS DNA biblioteket forberedelse kit (se Tabell for materiale). Følg produsentens instruksjoner for alle tagmentation, PCR forsterkning og opprydding skritt [bortsett fra at reaksjonen volumene inkludert inn DNA (fra trinn 3,5) kan halveres utvide bruken av biblioteket forberedelse reagenser].
  2. Normalisere biblioteker manuelt ved hjelp av en qPCR-baserte NGS biblioteket kvantifisering kit (se Tabell for materiale) for å bestemme personlige konsentrasjonen av provirus. Kombinere individuelle provirus biblioteker ekvimolare utgjør en siste konsentrasjon av 4 nM, eller som angitt av leverandøren av sekvenser.
    Merk: Protokollen kan pauses her og gruppert biblioteket lagret på 20 ° C.
  3. Kvantifisere siste grupperte biblioteket ved hjelp av samme dsDNA kvantifisering kit brukte i trinn 3.4. Følg instruksjonene fra produsenten. Bestemme gjennomsnittlig fragment lengder ved å kjøre 1 µL av grupperte biblioteket på en automatisert geleelektroforese system med en riktig kit (se Tabell for materiale). Bruk konsentrasjonen og gjennomsnittlig fragment lengder for å bestemme molarity av grupperte biblioteket.
  4. Kombiner 5 µL av grupperte biblioteket med 5 µL av 0,2 N NaOH til denature biblioteket. Legge til 5 µL av 200 mM Tris-HCl å nøytralisere. Fortynne siste biblioteket til 12 5 pM med kjølt hybridisering buffer (tilgjengelig med DNA biblioteket forberedelse kit) umiddelbart før sekvensering.
  5. Utføre 2 x 150 nukleotid (nt) sammen-end sekvensering på en passende NGS plattform (se Tabell for materiale).
    Merk: Når 96 proviral biblioteker blir indeksert per kjørt, dette gir ca 20 millioner sammen-end leser per kjøre eller 200.000 leser per personlige provirus bibliotek for analyse etter de-multipleksing. Trinn 4.4 og 4.5 utføres vanligvis av en sekvensering anlegget.

5. De Novo montering av sekvensert HIV-1-Proviruses

Merk: For å få genetisk sekvensen av hver forsterket provirus, contigs er samlet de novo fra den sammen-end lest. Mange plattformer (f.eks, CLC Genomics Workbench14), kan utformingen av egendefinerte arbeidsflyter for de novo samlingen. Andre åpen kildekode som FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17og FLASH18 kan også benyttes for behandling leser, samt verktøy som Bowtie219 og spar20 for Les kartlegging og de novo montering. Fremgangsmåten for de novo montering av HIV-1 contigs bruker en bestemt reklamen plattform (se Tabell for materiale) er beskrevet nedenfor (figur 2). Tilpasset arbeidsflyt filen er tilgjengelig på forespørsel.

  1. Importere sekvenser og sjekk kvalitet: Import sammenkoblede sekvensen leser (i fastq.gz format) i programvaren, som deretter kombineres som enkelt sett med sammenkoblede leser. Genererer QC rapporten og undersøke kvaliteten på dataene.
  2. Kvalitetskontroll
    1. Utføre Les trimming ifølge rapporten QC. Fjern alle kort sekvenser og tvetydig nukleotider. Trimme femten 5' og to 3 terminal nukleotider. Forkast leser mindre enn 50 nukleotider i lengde. Bruk en strenge grense av 0,001 tilsvarer en QC phred score på 30.
  3. Slå sammen overlappende par
    1. Danne én utvidet leser ved å flette sammen frem og reversere leser med overlappende områder.
  4. De novo montering
    1. Bruke den opprinnelige CLC genomics de novo assembler word (eller k-mer) størrelse 30 nt og en maksimal boblestørrelse 65 nt å montere en tilfeldig subsample 10.000 ikke-overlappende sammenkoblede lyder. Den forventede dekningen for de novo samlet contig er ~ 200 x for en ~ 9 kb sekvens.
      Merk: Denne delsampling kan redusere beregningsorientert byrden slik at de fleste vanlige stasjonære datamaskiner kan håndtere samling og analyse, og clonality av hver provirus (ett bibliotek er en provirus), dette begrenser ikke mangfoldet.
  5. Å kartlegge alle leser til contigs
    1. Få siste fleste konsensus sekvensen av hver provirus, hele Les settet tilordnes de novo samlet contig. Godta bare contigs med en minimum gjennomsnittlig dekning av 1000 x og sikre den endelige contig lengden tilsvarer størrelsen på bandet på den opprinnelige agarose gel (trinn 2.8.1). Lagre siste fleste konsensus sekvensen som en .fasta fil.
      Merk: De fleste contigs kan monteres beskrevet ovenfor. Men i noen tilfeller, for en enkelt provirus, er flere contigs med en lignende dekning samlet. Slike contigs justeres til en nær full lengde (~ 9 kb) konsensus rekkefølge fra samme deltaker og manuelt samlet i en enkelt contig. Alle leser tilordnes deretter den manuelt samlet contig og den endelige konsensus akseptert hvis lese dekningen selv hele forsamlingen og ikke single nukleotid polymorfismer (SNPer) > 40% er tilstede.
  6. Ytterligere kvalitetskontroll
    1. For å sikre hver contig representerer en enkelt provirus, og er ikke på grunn av forsterkning av flere proviruses i en enkelt brønn, lese skjermen dekning og variant ringer til den endelige contig.
    2. Flere proviral maler under PCR er ofte identifisert ved ujevne Les dekning (på grunn av co forsterkningen på proviruses i forskjellige størrelser) når tilordning til en full-lengde konsensus fra samme deltakeren, eller av tilstedeværelsen av SNPs med en hyppigheten av > 40% (se representant resultater, Figur 4). Ignorer blandet populasjoner i påfølgende analyser.
  7. Justering
    1. Importere siste konsensus av hver proviral i sekvens ser programvare som molekylær evolusjonær genetikk analyse (MEGA) 721. Juster hver sekvens manuelt til HXB2 referanse sekvensen. Trim 5' og 3 ender til posisjoner 666-9650 HXB2 fjerne primer sekvenser.
    2. Eksporter listen sekvens i fasta format og deretter justere med MAFFT versjon 722, med manuell redigering der det passer å få den siste justeringen.
      Merk: Hvis noen sekvenser ikke kan rettes, tilbakeføre supplement sekvensen. Hvis rekkefølgen ikke justerer fortsatt utføre et BLAST søk sekvensen er HIV-1. Det er mulig å forsterke non-HIV-1 maler og disse kan bli identifisert på dette stadiet. Hvis sekvenser er HIV-1, men ikke kan rettes, kan du vurdere tilstedeværelsen av inversjon (se trinn 6.1).

6. fastsettelse av potensielle replikering kompetanse i HIV-1 Proviral sekvenser

Merk: For å identifisere sekvenser av genetisk intakt, og potensielt replikering-kompetent, HIV-1-proviruses som en strenge prosess med eliminasjon er fulgt (figur 1 c). Proviral sekvenser mangler inversjon, store interne slettinger, skadelige stopp kodon / hypermutation, frameshift mutasjoner eller feil i MSD område eller pakking signalet regnes genetisk intakt og potensielt replikering kompetente.

  1. Inversjon
    1. Under justering scenen, identifisere inversjon. Inversjon er områder der rekkefølgen ikke align til referansen HXB2 hvis regionen er omvendt complemented.
      Merk: Avhengig av anvendelsen av dataene, sekvenser som inneholder inversjon må utelates fra videre analyse.
  2. Store interne slettinger
    1. Identifisere contigs med store interne slettinger (> 600 bp) i justering scenen. Hvis slettingen sitter i nef, kan rekkefølgen defineres som defekt.
      Merk: Noen sekvenser med interne sletting < 600 bp blir identifisert som Gene Cutter (trinn 6.3.1) har ufullstendig gensekvenser.
  3. Skadelige stopp kodon, frameshift mutasjoner og slettinger
    1. Sjekk alle contigs lengde > 8400 nukleotider etter skadelige stopp kodon, frameshifts og ufullstendige gensekvenser bruker Los Alamos National Laboratory HIV sekvens Database Gene kutteren verktøyet23.
      Merk: Verktøyet Gene Cutter deler proviral sekvensen i gener kneble, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, konv, og nef, og oversetter dem til aminosyrer. Gene Cutter og skjermene stopp kodon og frameshift mutasjoner (på grunn av innsettinger eller slettinger). Contigs som inneholder stopp kodon eller frameshifts i noen genet, unntatt nef24, klassifiseres som defekt. Gene Cutter identifiserer også ufullstendig gensekvenser og noen proviruses med en sletting < 600 bp i et gen enn nef kan klassifiseres som defekt på grunn av store interne slettingen.
  4. Hypermutation
    1. Generere en konsensus av gjenværende full lengde proviral sekvenser ved hjelp av Los Alamos National Laboratory HIV sekvens Database konsensus Maker verktøyet (enkel konsensus maker)25. Legge til konsensus sekvensen til toppen av en justering som inneholder bare de resterende full lengde proviral sekvensene. Bruker denne justering og Los Alamos National Laboratory HIV sekvens databasen Hypermut verktøyet26 å identifisere APOBEC-indusert G-A hypermutation i gjenværende full lengde proviral sekvenser.
  5. MSD og emballasje signal
    1. Kontroller hver av de gjenværende contigs feil i MSD og emballasje signalet (HXB2 region 670-810) som gjør den proviral sekvens defekt4. Se etter en punkt mutasjon i MSD området (sekvens GT, HXB2 744-745) eller sletting i fire stammer looper av emballasje (SL1 (HXB2 691 – 734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779), og SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

FLIPS analysen forsterker og sekvenser singel, nær full lengde HIV-1 proviruses. Protokollen inneholder 6 trinn å få nær full lengde proviral sekvenser. Disse trinnene omfatter: lysis av infiserte celler, nestede PCR full lengde (intakt og defekt) HIV-1 proviruses, DNA rensing og kvantifisering, sekvensering biblioteket forberedelse, NGS, og de novo montering av sekvensert proviruses. Slutten av hvert trinn kan betraktes som et kontrollpunkt som kvaliteten på produktet (f.eks forsterket DNA, renset DNA, sekvensering bibliotek eller sekvens) kan vurderes før neste trinn. En oversikt over vurderingen utføres på slutten av hvert trinn og forventede resultater er beskrevet nedenfor.

Følgende nestede PCR, forsterket produkter kjøres på en 1% agarose gel (Figur 3). Første kvaliteten på PCR kan bestemmes av inspeksjon av negative og positive kontroller. Negativ kontroll brønner med forsterket produktet angir forurensning og positiv kontroll brønner fraværende forsterket produktet angir utilstrekkelig forsterkning. Deretter velges brønner med forsterket produktet for sekvenser. For å unngå brønner som inneholder blandinger av flere forsterket proviruses, betraktes bare brønner som inneholder forsterket produktet kjører på sluttpunktet fortynning for sekvenser. Ifølge Poisson-fordelingen finnes end-point fortynning når 30% av brønnene er positivt for forsterket produktet. Dette fortynning, det er en 80% sjanse disse brønnene inneholder en enkelt forsterket provirus. I tillegg kan brønner som inneholder flere forsterket proviruses av forskjellige lengder visualiseres på dette stadiet som flere band vises på gel. Disse brønnene bør ikke velges for sekvensering (Figur 3).

Etter rensing av forsterket proviruses valgt for sekvensering, kvantifisering sikrer ingen proviral DNA går tapt under rensing scenen. Hvis DNA konsentrasjonen av en forsterket provirus < 0,2 ng/µL, resterende utvalget i PCR2 plate kan være renset. En lignende checkpoint oppstår etter biblioteket forberedelse, der hver enkelt bibliotek er kvantifisert. Dette sikrer personlige proviruses er riktig fragmentert, merket og forsterket før sekvensering. Personlige proviral biblioteker er gruppert i ekvimolare utgjør en siste biblioteket konsentrasjon av 4 nM (eller som angitt av leverandøren av sekvenser). Hvis konsentrasjonen av en enkelt proviral bibliotek er for lav, det kan bli ekskludert fra sekvensering biblioteket bassenget eller personlige biblioteket forberedt igjen. En siste sjekk av konsentrasjonen av grupperte biblioteket utføres før sekvensering med bekrefter gjennomsnittlig fragment lengder.

Kvalitetskontroll trinn før de novo montering scenen sikrer kvaliteten av lest brukt til å montere den siste proviral contig. Disse trinnene omfatter: fjerning av kortet sekvenser, trimming av 5' og 3 nukleotider, strenge kvalitet grense, og uten hensyn kort leser. CLC Genomics Workbench kan gi kvalitetskontroll rapporter som kan brukes før å vurdere første kvaliteten av leser og innstillinger for prosjektveiledning trimming, og etter for å fastslå om trimmingen tilstrekkelig å fjerne lav kvalitet områder. I tillegg for de novo samlingen, kvaliteten på den sammensatte contigs kan vurderes for tilstrekkelig dybde (> 1000 X) og jevn dekning (figur 4A). Blandet befolkninger kan også identifiseres på dette stadiet. Blandinger av flere full lengde (~ 9 kb) proviruses er identifisert gjennom tilstedeværelse av flere SNPs med en frekvens på mer enn 40%, mens blandinger av kort (med en stor intern sletting) og full lengde proviruses kan bli identifisert av ujevn lese dekning etter tilordning til full lengde referanser fra samme deltakeren (figur 4B).

Avhengig av programmet, kan siste justeringen visualiseres ved hjelp av verktøy som ggtree tilgjengelig som en pakke i "R: A språk og miljø for statistiske computing"27. I en fersk studie, KNIPSER ble benyttet til sekvens HIV-1 proviruses fra naiv, sentral, overgang, og effektor minnet CD4+ T celler isolert fra individer på langsiktige kunst, med sikte på å identifisere hvis bestemt celle delsett viste høyere andelen genetisk intakt og potensielt replikering kompetente HIV-12. Her presenteres visuell representasjon av sekvenser isolert fra en deltaker med denne studien (deltaker 2026) (figur 5). I denne deltakeren, fleste (97%) av sekvenser var defekt, med intakt sekvenser i effektor og overgangsreglene minne CD4+ T celler. Visualisering verktøyet er nyttig for å vise antall sekvenser med stor intern slettinger og deres posisjon i genomet. Det kan kommenteres videre for å angi sekvenser med skadelige stopp kodon, frameshift mutasjoner og slettinger/mutasjoner i MSD nettstedet og/eller emballasje signal.

En anvendelse av FLIPS analysen er identifikasjonen av genetisk intakt og potensielt replikering kompetente HIV-1 proviruses. I en fersk studie av 531 sekvenser isolert fra CD4+ T celler fra 6 deltakere på langsiktige kunst, 26 (5%) genetisk intakt HIV-1 proviruses ble identifisert2. De gjenværende defekt proviruses inkludert de med inversjon sekvenser (6%), store interne slettinger (68%), skadelige stopp kodon/hypermutation (9%), frameshift mutasjoner (1%) og feil i emballasje signal og/eller mutasjoner i MSD området (11%) .

Figure 2
Figur 2: Oversikt over arbeidsflyt for de novo montering av HIV-1 proviruses. De viktigste trinnene i arbeidsflyten inkluderer: 1) sekvens lese kvalitetskontroll, 2) sammenslåing overlappende par, 3) de novo montering og 4) remapping og konsensusbygging har vært rød, blå, grønn og oransje, henholdsvis. Dette tallet har blitt endret fra Hiener et al. 2 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempel agarose gel av PCR forsterket HIV-1 proviruses. Brønner 1, 2, 3, 6, 9 og 10 inneholder forsterket HIV-1 proviruses. Vel 10 inneholder en provirus med en stor intern sletting, vel 2 inneholder co forsterkning av to HIV-1 proviruses i ulike lengder (blanding) og vel 12 inneholder positivt kontroll. Merk prosent av brønner med forsterket produktet er 60%, som er over prosenten må isolere enkelt maler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel resultatet av Les kartlegging. (A) eksempel demonstrerer selv dekning på grunn av forsterkning av en enkelt full lengde HIV-1 provirus. Etter de novo montering tilordnes den monterte contig å produsere en konsensus sekvens alle leser. Programvare-plattformen tillater den tilordnede lest undersøke for tilstrekkelig og selv dekning. (B) eksempel demonstrere co forsterkning av to HIV-1 proviruses i ulike lengder (blanding). For å bestemme blandinger, er leser tilordnet til en full-lengde (~ 9 kb) referanse sekvens fra samme deltakeren og lese tilordning inspisert. Tilstedeværelsen av ujevn dekning angir en blanding. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Qiagen14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Eksempel visualisering av HIV-1 proviral sekvenser isolert fra CD4+ T celle delsett fra en person på langsiktige kunst. Personlige HIV-1 proviral sekvenser vises som vannrette linjer. Dette tallet har blitt endret fra Hiener et al. 2 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

FLIPS analysen er en effektiv og høy gjennomstrømming metode for forsterke og sekvensering singel, nær full lengde HIV-1 proviruses. Flere faktorer og avgjørende skritt i protokollen som påvirker antallet og kvaliteten av sekvenser innhentet har blitt identifisert. Først påvirker antall celler og HIV-1 smitte frekvensen av befolkningen cellen antall proviruses forsterket. For eksempel i en tidligere publikasjon, omtrent halvparten så mange sekvenser Hentet fra samme antall naiv CD4+ T celler sammenlignet effektor minne CD4+ T celler. Dette er fordi naiv celler har vanligvis en lavere infeksjon frekvens enn effektor minne celler2. Deretter er cellen lysis å foretrekke fremfor kolonne-baserte utvinning metoder for å skaffe genomisk DNA som det er ingen risiko for å miste DNA i utpakkingen. Til slutt, som med alle PCR-baserte analysen, hindre forurensning er avgjørende. Atskilt rengjøre områder bør angis for å forberede master mikser, håndtering genomisk DNA, legge til positiv kontroller, DNA rensing og kvantifisering og biblioteket forberedelse. Dette er spesielt viktig for enkelt-kopi analyser som det som presenteres her.

Implementering av FLIPS analysen bør først ta kjører en positiv kontroll som pNL4-3 plasmider i stedet for deltaker prøver. Dette vil tillate noen feilsøking før bruk av HIV-1 positiv celler, som sekvensene innhentet kan sammenlignes referanse sekvenser for disse plasmider. Når du bruker HIV-1 positiv celler, er det viktig å vurdere HIV-1 subtype (primere designet for FLIPS gjelder undertype B) og infeksjon frekvensen av befolkningen cellen hvis liten eller ingen proviruses er forsterket. Primer sekvenser kan være endret/redesigned å matche andre undertyper. I tillegg bør en godt inneholder en positiv kontroll inkluderes i hver PCR utført.

KNIPSER har overvinne begrensningene til tidligere sekvensering analyser, inkludert SPS. Gjennom forsterke og sekvensering nær full lengde HIV-1 proviruses, kan KNIPSER finne potensielle replikering-kompetansen til HIV-1 proviruses. Dette var ikke mulig å bruke SPS, som sekvensert bare sub-genomisk regioner og derfor valgt for sekvenser med intakt primer bindende områder. Videre FLIPS løser begrensningene knyttet utnytte flere forsterkning og sekvensering primere, som ble ansatt av tidligere full lengde sekvenser analyser1,4. Gjennom to runder av PCR målretting av HIV-1 LTR kombinert med NGS FLIPS reduserer antallet og kompleksiteten i primere kreves. VENDE er derfor mindre utsatt for konsekvensene av primer uoverensstemmelser, nemlig feil identifisering av defekte proviruses og en manglende evne til å forsterke noen proviruses i en befolkning. FLIPS protokollen er også mer effektivt og gir en høyere frekvens av sekvensering enn tidligere metoder.

Tydeligvis FLIPS gir fordelene over eksisterende metoder som bestemmer den genetiske sammensetningen av HIV-1 proviruses. Det er imidlertid viktig å erkjenne begrensninger av KNIPSER. Først har FLIPS analysen ikke blitt utviklet som et verktøy for å måle størrelsen på latente HIV-1 reservoaret som analyser for å avgjøre om FLIPS forsterker hver HIV-1 provirus i en celle befolkningen ikke er fullført. VENDE er stedet nyttig for relativ sammenlikner sammensetningen av reservoaret mellom ulike celle populasjoner2. Dernest kan ikke replikering-kompetansen til intakt HIV-1 proviruses fastslås med sikkerhet uten i vivo analyser, som utføres av Ho et al. 4. det tredje FLIPS er ikke utformet til å bestemme området integrering av HIV-1 proviruses.

Mindre variasjoner av FLIPS protokollen kan øke sin søknad. For eksempel endringer i primer sekvenser kan tillate forskjellige og flere HIV-1 subtyper forsterket og sekvensielt. Sekvensering av plasma HIV-1 virions er mulig gjennom tillegg av cDNA syntese før nestede PCR. Fremtidige utnyttelse av ett molekyl sekvensering metoder vil eliminere behovet for de novo montering.

Genetisk sekvensering av integrert HIV-1 proviruses har økt vår forståelse av latent HIV-1 reservoaret. VENDE er et viktig verktøy for fremtidige studier Klargjørende sammensetning og distribusjon av latent reservoaret. Men kan anvendelsen av FLIPS utvide utover reservoaret. Fremtidige studier kan benytte FLIPS å bestemme bestemte mål for CRISPR-Cas-teknologi, eller bistå i identifiseringen av koding og ikke-koding regioner som gjør at viruset raskere å latency reversere agenter. Viral rekombinasjon kan bli bedre forstått av ute ved krysset store interne slettinger.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) å finne en kur (1U19AI096109 og 1UM1AI126611-01); en amfAR forskning Consortium på HIV utrydding (ARCHE) samarbeid forskningsstipend fra stiftelsen for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australsk senter for HIV og hepatitt virologi forskning (ACH2); UCSF-ga senter for AIDS Research (P30 AI027763); og Australian National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Vi vil gjerne takke Dr. Joey Lai, Genomics anlegget Manager ved Westmead Institutt for medisinsk forskning på sin opplæring i biblioteket utarbeidelse og bruk av sin anlegget og Ramaciotti senter for Genomics (University i New South Wales i Sydney, Australia) for å gjennomføre sekvensering. Vi erkjenner med takknemlighet deltakerne som donerte prøver for denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Genetikk problemet 140 neste generasjons sekvensering HIV-1 HIV sekvensering proviruses single-proviral HIV-DNA ventetid replikering-kompetanse antiretroviral behandling og HIV-reservoaret integrert HIV
Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter