Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Fullängds enskilda proviral sekvensering (VOLTER) ger en effektiv och hög genomströmning metod för förstärkning och sekvensering av singel, nära fullängds (intakt och defekta) HIV-1-proviruses och möjliggör bestämning av deras potential replikering-kompetensen. FLIPS övervinner begränsningarna i tidigare analyser för att sekvensera reservoaren latent HIV-1.

Abstract

Fullängds enskilda Proviral sekvensering (VOLTER) analysen är en effektiv och hög genomströmning metod som syftar till att förstärka och sekvens singel, nära fullängds (intakt och defekt), HIV-1 proviruses. FLIPS tillåter bestämning av den genetiska sammansättningen av integrerad HIV-1 inom en cell befolkning. Genom att identifiera defekter inom HIV-1 proviral sekvenser som uppstår under omvänd Transkription, såsom stora interna borttagningar, skadliga stop kodon/hypermutation, frameshift mutationer och mutationer/borttagningar i cis agerar element krävs för virion mognad, kan VOLTER identifiera integrerade proviruses oförmögna att replikering. FLIPS analysen kan användas för att identifiera HIV-1-proviruses som saknar dessa defekter och är därför potentiellt replikering-behöriga. FLIPS protokollet innebär: lys av HIV-1 infekterade celler, nästlade PCR av nära fullängds HIV-1 proviruses (använda primers riktade till HIV-1 5' och 3' LTR), DNA-rening och kvantifiering, bibliotek förberedelse för nästa generation Sequencing (NGS), NGS, de novo montering av proviral contigs, och en enkel process för eliminering för att identifiera replikering-behöriga proviruses. FLIPS ger fördelar jämfört med traditionella metoder avsedda att sekvensen integrerade HIV-1 proviruses, såsom enda-proviral-sekvensering. FLIPS förstärker sekvenser nära fullängds proviruses aktivera replikering kompetensen att vara beslutsamma och använder också färre förstärkning primers, förebygga följderna av primer mismatches. VOLTER är ett användbart verktyg för att förstå genetiska landskap av integrerade HIV-1 proviruses, särskilt inom latent reservoaren, dock kapacitetsutnyttjande kan förlänga för alla program där den genetiska sammansättningen av integrerad HIV-1 krävs.

Introduction

Genetisk karakterisering av den latenta HIV-1-behållare, som framhärdar i individer på långsiktiga antiretroviral terapi (ART), har varit avgörande för förståelsen att majoriteten av integrerade proviruses är defekta och replikering-inkompetent1 , 2. under processen för omvänd Transkription, fel införs i den integrera proviral sekvensen. Några mekanismer som genererar defekta proviral sekvenser inkluderar den felbenägna HIV-1 omvänt transkriptas enzym3, mallen byta4och/eller APOBEC-inducerad hypermutation5,6. Två nya studier har funnit att cirka 5% av HIV-1 proviruses isolerade från individer på långsiktiga konst är genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, och kan bidra till den snabba uppgången i HIV-1 plasmanivåerna vid upphörande av konst 1 , 2 , 7. tidigare studier har identifierat att replikering-behöriga HIV-1 proviruses kvarstår i naiva och vilande minne CD4+ T cell undergrupper (inklusive central, övergångsbestämmelser och effektor T-minnesceller), om vikten av inriktning på dessa celler i framtiden utrotning strategier2,8,9.

Tidiga insikter i distribution, dynamik och underhåll av reservoaren latent HIV-1 uppnåddes genom utnyttjande av single-proviral (SPS) sekvenseringsmetoder som genetiskt kännetecknar sub-genomisk regioner av HIV-1 genome10 ,11,12,13. SPS är ett mångsidigt verktyg, kunna sekvensera en enda HIV-1 provirus från inom en infekterad cell. SPS är dock inte att avgöra replikering-kompetensen av proviruses, eftersom det bara sekvenser sub-genomisk regioner och missar proviruses som innehåller stora borttagningar inom primer bindningsställen. En tidigare studie visat att SPS överskattar storleken på reservoaren replikering-behöriga av 13 - till 17 - faldigt genom selektivt sekvensering intakt sub-genomisk regioner2.

Att ta itu med begränsningarna av SPS, Ho et al. 4 och Bruner o.a. 1 utvecklade analyser sekvens nära fullängds HIV-1 proviruses. Detta tillät frekvensen av genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, HIV-1-proviruses hos individer på långsiktig ART skall fastställas. Dessa analyser förstärks och sekvenserade (via Sanger sekvensering) sub-genomisk regioner som monterades sedan för att få en sekvens av (intakt eller defekta) HIV-1 provirus. Tre begränsningarna med denna metod är: (1) användningen av flera sekvensering grundfärger ökar risken för oavsiktligt introducera defekter i proviral sekvensen, 2) primer missmatchningar kan förebygga amplifiering av särskild proviruses, och 3) ofta den hela proviral sekvensen inte kan lösas på grund av teknikalitet av dessa metoder.

För att övervinna begränsningarna av befintliga fullängds HIV-1 proviral sekvensering analyser, utvecklat vi Full -Lpåtagning jagindividuella Proviral Sequencing (VOLTER) analysen. VOLTER är en nästa generations sekvensering (NGS)-baserat test som förstärker och sekvenser nära fullängds (intakt eller defekta) HIV-1-proviruses på en hög genomströmning och effektivt sätt. FLIPS ger fördelar jämfört med tidigare analyser, eftersom den begränsar antalet primers utnyttjas; Därför, det minskar risken för primer skillnader, vilket kan begränsa befolkningen av proviruses fångas eller oavsiktligt introducera defekter i en viral sekvens. VOLTER är också mindre tekniskt utmanande än tidigare analyser och omfattar 6 huvudsakliga steg: 1) lys av HIV-1 infekterade celler, 2) förstärkning av enstaka HIV-1 proviruses via nästlade PCR utfört begränsa utspädning med primers som är specifika för den mycket bevarat HIV-1 5' och 3' U5 LTR region (figur 1A), 3) rening och kvantifiering av förstärkta produkter, 4) bibliotek beredning av förstärkt proviruses för NGS, 5) NGS, och 6) de novo montering av sekvenserade proviruses att få contigs av varje enskilda provirus.

Sekvenser som genereras av VOLTER kan genomgå en stränga eliminering att identifiera de som är genetiskt intakt och potentiellt replikering-behöriga (figur 1 c)2. Genetiskt intakt proviruses saknar alla kända defekter som resulterar i generation av en replikering-inkompetent provirus. Dessa defekter inkluderar: inversion sekvenser, stora interna borttagningar, hypermutation/skadliga stop kodon, bassubstitutioner eller mutationer i de 5' förpackning signalen eller större skarva givare (MSD) webbplats.

Figure 1
Figur 1: kritiska steg i fullängds enskilda proviral sekvensering (VOLTER) analysen. (A) HIV-1 DNA-genomet med primer bindningsställen i 5' och 3' U5 LTR regioner används av VOLTER för att förstärka nära fullängds (defekt och intakt) HIV-1 proviruses via nästlade PCR. (B) Layout av en PCR-plattan med 96 brunnar innehållande 80 prov wells (20 brunnar för varje spädning), 4 negativa kontrollbrunnar och 1 positiv kontroll väl. (C) process för eliminering används för att identifiera genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, HIV-1-proviruses. Denna siffra har ändrats från Hiener et al. 2 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av institutionella granskning styrelserna vid University of California San Francisco och Western Sydney lokala hälsa distriktet, som omfattar Westmead Institutet för medicinsk forskning.

1. lys av HIV-1-infekterade celler

Obs: Celler kan isoleras från perifert blod, leukaferes prover, benmärgsbiopsi eller vävnad biopsi. Cellpopulationer kan sorteras med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS).

  1. Förbereda en lyseringsbuffert innehållande 10 mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet P–40, 0,5% Tween-20 och 0,3 mg/mL proteinas K. Tillsätt 100 μl lyseringsbuffert per 1 x 106 celler till en cell pellet. Pipettera upp och ner för att blanda. Inkubera vid 55 ° C i 1 timme följt av 85 ° C under 15 minuter att lysera celler och släppa genomiskt DNA för PCR-amplifiering.
    Obs: Cell lysis är tillräcklig för att erhålla genomiskt DNA för förstärkning. Ingen DNA isolering eller rening krävs. Protokollet kan pausas vid denna punkt och genomiskt DNA kan förvaras vid-20 ° C på obestämd tid.

2. förstärkning av enstaka HIV-1 DNA Proviruses via nästlade PCR

  1. Blanda reagenserna för första runda PCR (PCR1) anges i tabell 1 (se Tabell för material). Tillsätt 38 µL av master mix till 85 brunnar (80 prover, 4 negativa kontroller, 1 positiv kontroll) i en PCR-plattan med 96 brunnar (Följ layouten i figur 1B). Utse denna platta 'PCR1'.
Reagens Slutlig koncentration Volym för PCR1 plattan (µL) Volym för PCR2 plattan (µL)
Forward Primer 1 ΜM 32,3 23,8
Reverse Primer 1 ΜM 32,3 23,8
Buffert (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129,2 95,2
dNTP (10 mM) 0,2 mM 64,6 47,6
DNA-polymeras (5 U/µL) 0,025 U/ΜL 16.2 11,9
Ultrarena H2O 2632.5 1939.7

Tabell 1: Reagens och volymer för PCR behärska mixar.

Obs: Primers används för PCR1 är:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 placera 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 placera 9662-9686)

  1. Efter beredning av master mix, flytta PCR1 plattan till ett rent område som utsetts för tillägg av genomisk DNA.
    1. Seriellt utspädd genomiskt DNA från 1:3 till 1:81 med Tris-HCl (5 mM, pH 8), förbereder 45 µL för varje utspädning (tillräckligt för 20 brunnar för varje utspädning). Tillsätt 2 µL utspädda genomiskt DNA i varje prov väl och 2 µL Tris-HCl (5 mM, pH 8) till varje negativa kontrollbrunnen (Följ layouten i figur 1B). Försegla alla brunnarna av PCR1 plattan, exklusive positiva Kontrollera väl, med en tydlig självhäftande förslutning (se Tabell för material).
      Obs: De ovan rekommenderade utspädningarna fungera endast som en start guide för att fastställa slutpunkten utspädning. Spädningar beror på koncentrationen av integrerade HIV-1 DNA i proverna.
  2. Flytta till ett område som utsetts för tillägg av positiv kontroll. Tillsätt 2 µL positiv kontroll (pNL4-3 utspätt till 105 kopior/μl) i den positiva kontrollen väl Skyltens PCR1 och försegla plattan. Kort snurra PCR1 plattan i en PCR-plattan spinner eller Centrifugera (400 x g för 10 s vid rumstemperatur) att dra ner eventuella återstående innehåll från sidorna av brunnarna.
  3. Kör PCR1 plattan i en termocykler: 94 ° C i 2 min; sedan 94 ° C i 30 s, 64 ° C i 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 61 ° C för 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 55 ° C för 30 s, 68 ° C i 10 min för 21 cykler; sedan 68 ° C i 10 min (30 cykler totalt). Håll vid 4 ° C.
    Obs: Protokollet kan pausas här och PCR1 plattan hålls vid 4 ° C i upp till 2 dagar.
  4. Blanda reagenserna för den andra omgången av PCR (PCR2) anges i tabell 1. Tillsätt 28 µL till 85 brunnar (80 prover, 4 negativa kontroller, 1 positiv kontroll) i en ny PCR-plattan med 96 brunnar (Följ layouten i figur 1B). Utse denna platta 'PCR2'.

Obs: Primers används för PCR2 är:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 placera 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 placera 9650-9676)

  1. Kort snurra PCR1 plattan i en PCR-plattan spinner eller Centrifugera (400 x g för 10 s vid rumstemperatur) att dra ner eventuella återstående innehåll från sidorna av brunnarna. Tillsätt 80 µL Tris-HCl (5 mM, pH 8) till varje brunn av PCR1 plattan.
    1. Över 2 µL av PCR1 plattan till PCR2 plattan med hjälp av en flerkanalspipett. Säkerställa prover överförs väl till väl (dvs 2 µL från väl A1 av PCR1 plattan överförs till väl A1 av PCR2 plattan). Täta PCR2 plattan med en tydlig självhäftande förslutning (se Tabell för material).
    2. Kort snurra PCR2 plattan i en PCR-plattan spinner eller Centrifugera (400 x g för 10 s vid rumstemperatur) att dra ner eventuella återstående innehåll från sidorna av brunnarna. Försegla PCR1 plattan med en värme tätning film för långtidsförvaring vid-20 ° C (se Tabell för material).
  2. Kör PCR2 plattan i en termocykler: 94 ° C i 2 min; sedan 94 ° C i 30 s, 64 ° C i 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 61 ° C för 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s, 68 ° C i 10 min i 3 cykler; 94 ° C i 30 s, 55 ° C för 30 s, 68 ° C i 10 min för 31 cykler; sedan 68 ° C i 10 min (40 cykler totalt). Håll vid 4 ° C.
    Obs: Protokollet kan pausas här och PCR2 plattan hålls vid 4 ° C i upp till 2 dagar.
  3. Kort snurra PCR2 plattan i en PCR-plattan spinner eller centrifug för att dra ner eventuella återstående innehåll från sidorna av brunnarna. Tillsätt 60 µL Tris-HCl (5 mM, pH 8) till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett.
    1. Kör 15 µL av varje brunn på 2 x 48-väl förtillverkade 1% agaros gel som innehåller etidiumbromid (0.1\u20120.3 µg/mL, se Tabell för material). Använda en stege med en räckvidd upp till 10 kb (se Tabell för material). Visualisera för att identifiera de brunnar som innehåller förstärkt produkten och deras ungefärliga storlekar. Spara gel bilden.
      Anmärkning: Se till att den positiva kontrollen innehåller väl förstärkt produkt. Om de negativa kontrollbrunnarna innehåller förstärkt produkt, överväga kontaminering och bortse från plattan.
  4. Bestämma den utspädning som högst 30% av brunnarna är positiva för förstärkt produkt.
    Obs: Detta är slutpunkten utspädning där en majoritet (80%) av brunnar innehåller förstärkt produkt från en enda mall. Denna utspädning bör förberedas och används i efterföljande primärvården för att få ytterligare proviral amplikoner. Registrera den ungefärliga storleken på varje förstärkt produkt.

3. DNA-rening och kvantifiering

  1. Kort snurra PCR2 plattan i en PCR-plattan spinner eller centrifug för att dra ner eventuella återstående innehåll från sidorna av brunnarna. Över 40 µL från brunnarna som innehåller förstärkt produkt (vid eller nedanför slutpunkten utspädning) till en ny 96 brunnar midi-tallrik (med en väl volym 0.8 ml, se Tabell för material).
    Obs: Skriv ner ursprungliga och nya väl position varje förstärkt produkt i ett kalkylblad som en post för varje förstärkt produkt till sekvenseras.
  2. Rena de amplifierade DNA produkter med hjälp av en magnetisk pärla baserat PCR rening kit (se tabell för material) ta bort primers, nukleotider, enzymer, oljor och salter. Innan du börjar placera magnetiska pärlor i rumstemperatur och förbereda färska 80% etanol. Använd nya pipettspetsar när det är lämpligt att undvika korskontaminering av DNA-prover.
    1. Vortex magnetiska pärlor för att säkerställa att de är grundligt resuspended. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 40 µL av pärlor till de 40 µL av amplifierad produkt i 0,8 mL 96 brunnar MIDI-plattan. Pipettera försiktigt upp och ner 10 gånger för att blanda. Alternativt kan du blanda lösningen genom tätning plattan sedan skaka på en mikroplattan shaker vid 1 800 rpm för 2 min. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
    2. Plats på plattan på en magnetisk utmärker (se Tabell för material) för 2 min. avlägsna och Kassera supernatanten.
    3. Tvätta pärlor genom att tillsätta 200 µL av 80% etanol till varje brunn med plattan på stativet. Odla i rumstemperatur i 30 s. ta bort och Kassera supernatanten. Upprepa en gång. Med hjälp av en flerkanalspipett med fina tips, ta bort någon överflödig etanol efter andra tvätten. Med plattan på stativet, låt pärlorna till luft torka i 15 min.
    4. Avlägsna plattan från stativet. Tillsätt 30 µL eluering buffert (se Tabell för material) till varje brunn. Pipettera försiktigt upp och ner 10 gånger för att blanda. Alternativt kan du blanda lösningen genom tätning plattan sedan skaka på en mikroplattan shaker vid 1 800 rpm för 2 min. Inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    5. Placera plattan på en magnetisk stå för 2 min. med hjälp av en flerkanalspipett, överföra 25 µL av supernatanten (renade DNA) till en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Se till att proverna överförs väl-att-väl (dvs supernatanten väl a1 i 0,8 mL plattan överförs till väl A1 i nya plattan med 96 brunnar).
      Obs: 5 uL av eluerade provet är kvar att se till att ingen överföring av resterande rening pärlor.
  3. Fastställa och registrera den ungefärliga koncentrationen av varje amplifierade DNA-produkt efter rening med en spektrofotometer (absorbans vid en våglängd på 260 nm).
    Obs: Mäta ungefärliga koncentrationen av varje förstärkt produkt är nödvändigt i detta skede så att inga Prover går förlorade under reningssteg och att den ungefärliga koncentrationen inom spänna av standardkurvan används inom nästa skede ( 0,001 – 1 ng/µL DNA i 100 µL av volymen). Protokollet kan pausas här och rengjorda prover kan förvaras vid-20 ° C i upp till 6 månader.
  4. Kvantifiera koncentration av DNA för varje renad produkt använder en dsDNA kvantifiering kit (se tabell för material).
    Obs: Detta innebär att man använder en standardkurva för att bestämma koncentrationen av dsDNA i ett prov. Satsen innehåller buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), en lamda dsDNA standard och ett fluorescerande färgämne. Hålla alla reagens på is. Täcka röret som innehåller färgämne med folie för att undvika exponering för ljus. Mätning av koncentrationen av varje förstärkt produkt i tre exemplar.
    1. Utspädda bufferten till 1 x i sterilt DNase gratis H2O. lägga till 99 µL av buffert till ett lämpligt antal tomma brunnar (3 gånger antalet amplifierade produkter som skall mätas, se tabell 2 för ett exempel layout) platt botten vävnadsodling platta. Tillsätt 100 µL buffert 3 tomma brunnar.
    2. För varje förstärkt produkt skall mätas, tillsätt 1 µL av renade DNA (från steg 3.2.5) i tre exemplar till varje brunn innehållande buffert (se tabell 2 för ett exempel layout).
    3. För att förbereda standarder, späd lamda dsDNA 10-faldig från 2 ng/µL till 0,002 ng / µL. Tillsätt 100 µL av varje standard dsDNA till 3 brunnar.
      Obs: Efter steg 3.4.4, slutliga koncentration av standarderna kommer att variera från 1 till 0,001 ng/µL
    4. Späd den fluorescerande färg 1: 200 med buffert. Snabbt Tillsätt 100 µL till varje brunn innehållande prov, tomma värden och normer. Blanda upp och ner med en pipett. Täck plåten med folie för att undvika kontakt med ljus.
    5. Läs fluorescens utsläpp på en microplate reader (magnetiseringen på 480 nm, emission på 520 nm). Rekordresultat i ett kalkylblad.
    6. Bestämma koncentrationen av dsDNA i varje prov med hjälp av fluorescens mätningar registreras. Subtrahera fluorescensen mätt i de tomma brunnarna från provet och standarder. Bestämma den genomsnittliga fluorescensen för varje prov och standard från exemplar. Rita en standardkurva baserat på fluorescens mätningar av standarder. Bestämma koncentrationen av proverna i förhållande till standarderna.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0.01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomt
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffert
B Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0.01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomt
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffert
C Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0.01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) Tomt
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL buffert
D Prov 1: Prov 2: Prov 3: Prov 4: Exempel 5: Exempel 6: Exempel 7: Exempel 8: Exempel 9: Exempel 10: Exempel 11: Exempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert
E Prov 1: Prov 2: Prov 3: Prov 4: Exempel 5: Exempel 6: Exempel 7: Exempel 8: Exempel 9: Exempel 10: Exempel 11: Exempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert
F Prov 1: Prov 2: Prov 3: Prov 4: Exempel 5: Exempel 6: Exempel 7: Exempel 8: Exempel 9: Exempel 10: Exempel 11: Exempel 12:
1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert 1 mL DNA + 99 mL buffert
G
H

Tabell 2: Exempel layout för kvantifiering av dsDNA plattan med 96 brunnar.

  1. Späd varje renad produkt (erhålls i steg 3.2.5) med H2O till 0,2 ng/µL.

4. sekvensering bibliotek förberedelse

  1. Förbereda förstärks och renade proviral DNA för NGS använder en NGS DNA bibliotek förberedelse kit (se Tabell för material). Följ tillverkarens instruktioner för alla tagmentation, PCR-amplifiering och städa upp steg [förutom att reaktion volymerna inklusive ingående DNA (från steg 3.5) kan halveras för att utöka användningen av bibliotek förberedelse reagenser].
  2. Normalisera bibliotek manuellt med hjälp av en qPCR-baserade NGS bibliotek kvantifiering kit (se Tabell för material) för att fastställa den individuella koncentrationen av provirus. Kombinera enskilda provirus bibliotek equimolar beloppen till en slutlig koncentration på 4 nM, eller av sekvensering tjänsteleverantörens angivna.
    Obs: Protokollet kan pausas här och sammanslagna biblioteket lagras vid-20 ° C.
  3. Kvantifiera sista sammanslagna biblioteket med hjälp av samma dsDNA kvantifiering kit används i steg 3,4. Följ tillverkarens instruktioner. Bestämma de genomsnittliga fragment längderna genom att köra 1 µL sammanslagna biblioteket på en automatiserad electrophoresis system använder en lämplig kit (se Tabell för material). Använda den koncentration och genomsnittliga fragment längder för att avgöra molariteten av poolade biblioteket.
  4. Kombinera 5 µL av poolade biblioteket med 5 µL 0,2 N NaOH att denaturera biblioteket. Tillsätt 5 µL av 200 mM Tris-HCl för att neutralisera. Späd det slutliga biblioteket till 5 12.00 med kylda hybridisering buffert (tillgänglig med DNA bibliotek förberedelser kit) omedelbart före sekvensering.
  5. Utför 2 x 150 nukleotid (nt) Parade-end sekvensering på en lämplig NGS-plattform (se Tabell för material).
    Obs: När 96 proviral bibliotek indexeras per kör, detta ger cirka 20 miljoner Parade-end läsningar per körning eller 200 000 läsningar per enskilda provirus bibliotek för analys efter de multiplexing. Steg 4.4 och 4.5 utförs vanligtvis av en anläggning för sekvensering.

5. De Novo montering av sekvenserade HIV-1 Proviruses

Obs: För att erhålla den genetiska sekvensen av varje förstärkta provirus, contigs är monterade de novo från den Parade-end läser. Många plattformar (t.ex., CLC genomik Workbench14), att utformningen av anpassade arbetsflöden för de novo montering. Annan öppen källkod såsom FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17och FLASH18 kan också användas för bearbetning läsningar, liksom verktyg såsom Bowtie219 och spader20 för Läs kartläggning och de novo församling. Stegen för de novo montering av HIV-1 contigs med en viss kommersiell plattform (se Tabell för material) beskrivs nedan (figur 2). Anpassade arbetsflödet filen är tillgänglig på begäran.

  1. Importera sekvenser och kontrollera kvaliteten: importera Parade sekvensen läser (i fastq.gz format) in i programvaran, som sedan kombineras som enda uppsättning ihopkopplade läsningar. Generera en sekvens QC rapporten och kontrollera kvaliteten på dina data.
  2. Kvalitetskontroll
    1. Utföra Läs trimning enligt rapporten QC. Ta bort eventuella adapter sekvenser och tvetydiga nukleotider. Trimma femton 5' och två 3' terminal nukleotider. Kassera läser mindre än 50 nukleotider i längd. Använd högst stränga kvalitetskrav 0.001 motsvarar en QC phred poäng av 30.
  3. Sammanfoga överlappande par
    1. Enda utökade läsningar av sammanslagning ihopkopplade fram och vända läsningar med överlappande regioner.
  4. De novo församling
    1. Använda den infödda CLC genomik de novo assembler med ett ord (eller k-mer) storlek 30 nt och en maximal bubblornas storlek 65 nt att montera ett slumpmässigt delurval av 10.000 icke-överlappande Parade läser. Den beräknade täckningen för den de novo monterade contig är ~ 200 x för en ~ 9 kb-sekvens.
      Obs: Denna delsampling kan avlasta computational sådan att de flesta vanliga stationära datorer kan hantera församlingen och analys, och med tanke på clonality av varje provirus (ett bibliotek är en provirus), detta begränsar inte mångfalden.
  5. Ny kartläggning alla läsningar till contigs
    1. Att få slutliga majoritet konsensus sekvens av varje provirus, mappa hela Läs uppsättningen till de de novo monterade contig. Acceptera bara contigs med en minsta genomsnittliga täckning 1,000 x och säkerställa den slutliga contig längden motsvarar storleken på bandet på den ursprungliga agarosgel (steg 2.8.1). Spara sista majoritet konsensus sekvensen som en .fasta fil.
      Obs: De flesta contigs kan monteras med hjälp av stegen ovan. Dock i vissa fall, för en enda provirus, är flera contigs med en liknande täckning monterade. Under dessa omständigheter contigs justeras till en nära fullängds (~ 9 kb) samförstånd sekvens från samma deltagare och manuellt monterade in en enda contig. Alla läser mappas sedan till den manuellt monterade contig och det slutliga samförståndet accepterade om Läs täckning är jämn i hela församlingen och inte enda nukleotid polymorfismer (SNP) > 40% är närvarande.
  6. Ytterligare kvalitetskontroll
    1. För att säkerställa varje contig representerar en enda provirus och beror inte på förstärkning av flera proviruses inom en enda brunn, läsa skärmen täckning och variant kallandet av de slutliga contig.
    2. Flera proviral mallar närvarande under PCR identifieras ofta av mycket ojämn Läs täckning (på grund av samtidig förstärkning av proviruses i olika storlekar) när mappning till en fullängds samförstånd från samma deltagare, eller av förekomsten av SNP med en frekvensen av > 40% (se representativa resultat, figur 4). Bortse från blandade populationer i efterföljande analyser.
  7. Justering
    1. Importera den slutliga konsensus av varje proviral sekvens till sekvens visning programvara såsom molekylär Evolutionär genetik analys (MEGA) 721. Justera varje sekvens manuellt till sekvensen HXB2 referens. Trimma den 5' och 3' slutar ståndpunkter 666-9650 HXB2 ta bort primer sekvenser.
    2. Exportera sekvenslistan i fasta format och sedan justera med MAFFT version 722, med manuell redigering där så är lämpligt att få den slutliga justeringen.
      Obs: Om någon sekvenser inte att rikta in, komplettera första omvända sekvensen. Om sekvensen inte justeras fortfarande utföra en BLAST sökning för att säkerställa sekvensen är HIV-1. Det är möjligt att förstärka icke-HIV-1 mallar och dessa kan identifieras i detta skede. Om sekvenser är HIV-1, men inte att rikta in överväga förekomsten av inversioner (se steg 6.1).

6. att fastställa potentiella replikering kompetensen av HIV-1 Proviral sekvenser

Obs: För att identifiera sekvenser av genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, HIV-1 proviruses en stränga process för eliminering är följt (figur 1 c). Proviral sekvenser saknar omkastningar, stora interna borttagningar, skadliga stop kodon / hypermutation, frameshift mutationer eller defekter i MSD webbplats eller packning signalen anses genetiskt intakt och potentiellt replikering-behöriga.

  1. Inversioner
    1. Under justering, identifiera inversioner. Inversioner finns regioner där sekvensen inte justeras hänvisningen HXB2 såvida regionen är omvänd kompletteras.
      Obs: Beroende på tillämpningen av data, sekvenser som innehåller inversioner kan behöva utelämnas från ytterligare analys.
  2. Stora interna borttagningar
    1. Identifiera contigs med stora interna strykningar (> 600 bp) i justering scenen. Om borttagningen sitter inom nef, kan sekvensen definieras som defekta.
      Obs: Några sekvenser med interna borttagningar < 600 bp identifieras av genen Cutter (steg 6.3.1) ha ofullständiga gensekvenser.
  3. Skadliga stop kodon, frameshift mutationer och borttagningar
    1. Kontrollera alla contigs längd > 8400 nukleotider för förekomst av skadliga stop kodon, bassubstitutioner och ofullständig gensekvenser som använder Los Alamos National Laboratory HIV sekvens databas gen fräsen verktyg23.
      Obs: Det genen Cutter verktyget delar proviral sekvensen i generna gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, och nefoch översätter dem till aminosyror. Gene Cutter sedan skärmar för förekomst av stop kodon och frameshift mutationer (på grund av infogningar och borttagningar). Contigs som innehåller stop kodon eller bassubstitutioner i någon gen, exklusive nef24, klassificeras som defekta. Gene Cutter identifierar även ofullständiga gensekvenser och någon proviruses med en deletion < 600 bp i en gen än nef kan omklassificeras som defekt på grund av en stor inre borttagning.
  4. Hypermutation
    1. Generera en konsensus av de återstående fullängds proviral sekvenser med Los Alamos National Laboratory HIV sekvens samförstånd databasproducenten verktyg (enkel samförstånd maker)25. Lägg till sekvensen samförstånd till toppen av en anpassning som innehåller endast de återstående fullängds proviral sekvenserna. Använda denna anpassning och Los Alamos National Laboratory HIV sekvens databas Hypermut verktyg26 att identifiera APOBEC-inducerad G-A hypermutation i återstående fullängds proviral sekvenser.
  5. Defekter i MSD och förpackning signal
    1. Inspektera varje av de återstående contigs för defekter i MSD och förpackning signalen (HXB2 region 670-810) vilket gör den proviral sekvens defekta4. Leta efter en punktmutation i webbplatsen MSD (sekvens GT, HXB2 744-745) eller borttagning i de fyra hejda slingor av förpackningar signalen (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779), och SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

FLIPS analysen förstärker och sekvenser singel, nära fullängds HIV-1 proviruses. Protokollet innebär 6 steg för att få nära fullängds proviral sekvenser. Åtgärderna omfattar bland annat: lys av infekterade celler, nästlade PCR fullängds (intakt och defekta) HIV-1 proviruses, DNA-rening och kvantifiering, sekvensering bibliotek förberedelse, NGS, och de novo montering av sekvenserade proviruses. I slutet av varje steg kan betraktas som en kontrollpunkt där kvaliteten på produkten (t.ex. förstärkt DNA, renade DNA, sekvensering bibliotek eller sekvens) kan bedömas innan nästa steg. En översikt över bedömningen utförs i slutet av varje steg och de förväntade resultaten beskrivs nedan.

Efter nästlade PCR, förstärkta produkter körs på en 1% agarosgel (figur 3). Den ursprungliga kvaliteten av PCR kan bestämmas genom inspektion av negativa och positiva kontrollerna. Negativ kontrollbrunnar som innehåller förstärkt produkt anger kontaminering och positiva kontrollbrunnar frånvarande av amplifierad produkt anger otillräcklig förstärkning. Nästa, brunnar som innehåller förstärkt produkt väljs för sekvensering. För att undvika brunnar innehåller blandningar av flera förstärkta proviruses, betraktas endast brunnar som innehåller förstärkt produkten körs vid slutpunkten utspädning för sekvensering. Enligt Poisson-fördelningen finns slutpunkten utspädning när 30% av brunnarna är positiva för förstärkt produkt. Vid denna spädning, finns det en 80% chans dessa brunnar innehåller en enda förstärkt provirus. Brunnar som innehåller flera förstärkta proviruses av olika längder kan dessutom visualiseras i detta skede som flera band visas på gelen. Dessa brunnar bör inte väljas för sekvensering (figur 3).

Efter rening av de förstärkta proviruses valts för sekvensering, kvantifiering garanterar ingen proviral DNA går förlorad under reningssteg. Om DNA koncentrationen av en förstärkt provirus är < 0,2 ng/µL, återstående provet i den PCR2 plattan kan renas. En liknande checkpoint uppstår efter bibliotek beredningen, i vilka varje enskild bibliotek är kvantifierad. Detta säkerställer individuella proviruses har varit korrekt fragmenterade, taggade och förstärks innan sekvensering. Enskilda proviral bibliotek sammanförs i equimolar uppgår till en slutlig bibliotek koncentration av 4 nM (eller som anges av leverantören sekvensering). Om koncentrationen av en enskild proviral bibliotek är för lågt, det kan uteslutas från sekvensering bibliotek poolen eller enskilda biblioteket beredd igen. En sista kontroll av koncentrationen av poolade biblioteket utförs före sekvensering tillsammans med bekräftar de genomsnittliga fragment längderna.

Åtgärder för kvalitetskontroll innan de novo församlingen scenen säkerställer kvaliteten på den läser som används för att montera den slutliga proviral contig. Åtgärderna omfattar bland annat: avlägsnande av adapter sekvenser, putsning av 5' och 3' nukleotider, en stränga kvalitetskrav gräns, och bortser från korta läsningar. CLC genomik Workbench kan tillhandahålla kvalitetskontroll rapporter som kan användas för att bedöma den ursprungliga kvaliteten läsningar och guide trimning inställningar, och sedan efter för att avgöra om trimningen var tillräckliga för att undanröja låg kvalitet regioner. Dessutom för de novo montering, kvaliteten på de församlade contigs kan bedömas för tillräckligt djup (> 1000 X) och jämnhet av täckning (figur 4A). Blandade populationer kan också identifieras i detta skede. Blandningar av flera fullängds (~ 9 kb) proviruses identifieras genom närvaron av flera SNP med en frekvens på mer än 40%, medan blandningar av kort (som innehåller en stor inre borttagning) och fullängds proviruses kan identifieras genom ojämn Läs täckning efter mappning till en fullängds referens från samma deltagare (figur 4B).

Beroende på applikation, kan den slutliga justeringen visualiseras med verktyg som ggtree tillgängliga som ett paket i ”R: A språk och miljö för statistiska beräkningar”27. I en färsk studie, VOLTER utnyttjades till sekvens HIV-1 proviruses från naiva, central, övergångsbestämmelser, och effektor minne CD4+ T celler isolerade från individer på långsiktiga konst, med målet att identifiera om viss cell undergrupper visade högre andelen genetiskt intakt och potentiellt replikering-behöriga HIV-1-2. Visuell representation av de sekvenser som isolerats från en deltagare i denna studie (deltagare 2026) presenteras här, (figur 5). I denna deltagare, flesta (97%) av sekvenser var defekta, med intakta sekvenser i effektor och övergångsbestämmelser minne CD4+ T celler. Visualisering verktyget är användbart för att visa antalet sekvenser med stora interna borttagningar och deras position i genomet. Det kan vara kommenterad ytterligare för att indikera sekvenser med skadliga stop kodon, frameshift mutationer och borttagningar/mutationer i MSD webbplats eller förpackning signal.

En tillämpning av VOLTER analysen är identifiering av genetiskt intakt och potentiellt replikering-behöriga HIV-1-proviruses. I en färsk studie av 531 sekvenser isolerade från CD4+ T celler från 6 deltagare på långsiktiga konst, 26 (5%) genetiskt intakt HIV-1 proviruses var identifierade2. De återstående defekta proviruses ingår de med inversion sekvenser (6%), stora interna borttagningar (68%), skadliga stop kodon/hypermutation (9%), frameshift mutationer (1%) och defekter i förpackning signal eller mutationer i webbplatsen MSD (11%) .

Figure 2
Figur 2: Översikt över arbetsflödet för de novo montering av HIV-1 proviruses. Stora stegen i arbetsflödet omfattar: (1) sekvens Läs kvalitetskontroll, 2) sammanfoga överlappande par, 3) de novo montering, och 4) ommappning och samförstånd har varit rött, blått, grönt och orange, respektive. Denna siffra har ändrats från Hiener et al. 2 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exempel agarosgel av PCR amplifieras HIV-1 proviruses. Brunnar 1, 2, 3, 6, 9 och 10 innehåller förstärkt HIV-1 proviruses. Väl 10 innehåller en provirus med en stor inre deletion, väl 2 innehåller Co amplifiering av två HIV-1 proviruses av olika längder (blandning) och väl 12 innehåller positiv kontroll. Procent av brunnarna som innehåller förstärkt produkt är 60%, vilket är över den procentandel som krävs för att isolera enstaka mallar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: exempel utdata av Läs kartläggning. (A) exempel visar jämn täckning tack vare förstärkning av en enda fullängds HIV-1 provirus. Efter de novo montering, alla läser mappas till den monterade contig att producera en konsensus-sekvens. Programvaruplattformen tillåter den mappade läser som skall kontrolleras tillräckligt och jämn täckning. (B) exempel visar samtidig amplifiering av två HIV-1 proviruses av olika längder (blandning). För att avgöra blandningar, är läsningar mappas till en fullängds (~ 9 kb) referens sekvens från samma deltagare och Läs kartläggning inspekteras. Förekomsten av ojämn täckning indikerar en blandning. Denna siffra är Reproducerad med tillstånd från Qiagen14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Exempel visualisering av HIV-1 proviral sekvenser isolerade från CD4+ T cell delmängder individ på långsiktiga konst. Enskilda HIV-1 proviral sekvenser representeras av horisontella linjer. Denna siffra har ändrats från Hiener et al. 2 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

FLIPS analysen är en effektiv och hög genomströmning metod för förstärkande och sekvensering singel, nära fullängds HIV-1 proviruses. Flera faktorer och kritiska steg i protokollet som påverkar antalet och kvaliteten på de sekvenser som erhållits har identifierats. För det första påverka antalet celler och HIV-1 infektion frekvensen av cell befolkningen antalet proviruses förstärks. Till exempel i en tidigare publikation, ungefär hälften så många sekvenser erhölls från samma antal naiva CD4+ T celler jämfört effektor minne CD4+ T celler. Detta beror på att naiva celler har normalt en lägre infektion frekvens än effektor minne celler2. För det andra, cellys är att föredra framför kolumnbaserade extraktionsmetoder för att erhålla genomiskt DNA som det finns ingen risk att förlora DNA i utvinningsprocessen. Slutligen, som med någon PCR-baserat test, förhindrar kontaminering är kritisk. Avskilda rena områden bör utses för att förbereda master mixer, hantering genomiskt DNA, lägga till positiva kontroller, DNA-rening och kvantifiering och bibliotek förberedelse. Detta är särskilt viktigt för singel-kopia analyser som presenteras här.

Genomförandet av VOLTER analysen bör först omfatta kör en positiv kontroll såsom pNL4-3 plasmider snarare än deltagare prover. Detta gör att någon felsökning före användning av HIV-1-positiva celler, som de sekvenser som erhålls kan jämföras med tillgängliga referens sekvenser för dessa plasmider. När du använder HIV-1-positiva celler, är det viktigt att överväga undertypen HIV-1 (primer avsedd för VOLTER är specifika för subtyp B) och infektion frekvensen av cell befolkningen om lite att ingen proviruses förstärks. Primer sekvenser kan vara modified/omgjorda att matcha andra undertyper. Dessutom bör en brunn innehållande en positiv kontroll ingå i varje PCR utförs.

VOLTER har övervunnit begränsningarna av tidigare sekvensering analyser, inklusive SPS. Genom förstärkande och sekvensering nära fullängds HIV-1 proviruses, kan VOLTER bestämma potentiella replikering-kompetensen av HIV-1 proviruses. Detta var inte möjligt med SPS, som sekvenserade bara sub-genomisk regioner och därför valt för sekvenser med intakt primer bindningsställen. Dessutom vänder övervinner begränsningarna med att använda flera amplifiering och sekvensering grundfärger, som var anställd av föregående fullängds sekvensering analyser1,4. Genom två rundor av PCR inriktning Regionkommittén HIV-1 LTR kombinerat med NGS, VOLTER minskar antalet och komplexiteten av primers som krävs. VOLTER är därför mindre känsliga för konsekvenserna av primer missmatchningar, nämligen felaktig identifiering av defekta proviruses och en oförmåga att förstärka vissa proviruses inom en befolkning. FLIPS protokollet är också effektivare och möjliggör en högre genomströmning av sekvensering än tidigare metoder.

Uppenbarligen, VOLTER ger fördelar jämfört med befintliga metoder som bestämmer den genetiska sammansättningen av HIV-1 proviruses. Det är dock viktigt att erkänna begränsningar av VOLTER. För det första har FLIPS analysen inte utvecklats som ett verktyg för att mäta storleken på reservoaren latent HIV-1, som analyser för att fastställa huruvida FLIPS förstärker varje HIV-1 provirus närvarande i en cell befolkning inte har slutförts. FLIPS används istället för att göra relativa jämförelser av sammansättningen av reservoaren mellan olika cell populationer2. För det andra, replikering-kompetensen av intakt HIV-1 proviruses kan inte fastställas med säkerhet utan i vivo analyser, såsom dem som utförs av Ho et al. 4. för det tredje, VOLTER är inte avsedd att fastställa webbplatsens integration i HIV-1 proviruses.

Mindre variationer i VOLTER protokollet kan öka dess tillämpning. Till exempel förändringar i primer sekvenser kan tillåta olika och flera HIV-1 subtyper förstärks och sekvenserade. Sekvensering av plasma HIV-1 virioner är möjligt genom tillägg av cDNA syntes före nästlade PCR. Framtida utnyttjande av enda molekyl sekvenseringsmetoder kommer att eliminera behovet för de novo församling.

Genetisk sekvensering av integrerade HIV-1 proviruses har ökat vår förståelse av den latenta HIV-1-reservoaren. VOLTER är ett viktigt verktyg för framtida studier belysa sammansättning och fördelning av latent reservoaren. Dock kan tillämpningen av VOLTER sträcka sig bortom reservoaren. Framtida studier kan utnyttja VOLTER för att fastställa särskilda mål för CRISPR-Cas-teknologi, eller bistå vid identifieringen av kodning och icke-kodande regioner som göra viruset mer lyhörd för latens backning agenter. Viral rekombination kan förstås bättre genom att titta på korsningen platser av stor inre strykningar.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes Delaney AIDS forskning Enterprise (vågar) hitta ett botemedel (1U19AI096109 och 1UM1AI126611-01); ett amfAR forskningskonsortiet på HIV utrotning (ARCHE) Collaborative forskningsbidrag från Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australiska centrum för HIV och hepatit virologi forskning (ACH2); UCSF-GIVI centrum för AIDS-forskning (P30 AI027763); Australiensiska nationella hälsa och medicinska forskningsrådet (AAP1061681). Vi vill tacka Dr Joey Lai, genomik fastighetschef på Westmead Institutet för medicinsk forskning för sin utbildning i biblioteket förberedelse och användning av sin anläggning och Ramaciotti centrum för genomik (University of New South Wales, Sydney, Australien) för att bedriva sekvensering. Vi bekräftar med tacksamhet deltagarna som donerade prover för denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Genetik fråga 140 nästa generations sekvensering HIV-1 HIV sekvensering proviruses single-proviral HIV DNA latens replikering-kompetens antiretroviral behandling HIV reservoar integrerad HIV
Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter